Lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. Tuttavia, alcuni neuroni spinali-proiezione sono buoni recuperatori e altri non lo sono. Questo documento illustra le tecniche per la lampreda di mare abitazioni larve (e adulti recentemente trasformati), producendo completi transezioni midollo spinale e la preparazione di cervelli wholemount e midolli spinali per l'ibridazione in situ.
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Articolo metodologico
Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dopo una lesione completa del midollo spinale, lamprede di mare in un primo momento sono paralizzate sotto il livello di resezione. Tuttavia, essi recuperano locomozione dopo diverse settimane, e questo è accompagnato da rigenerazione breve distanza (pochi mm) degli assoni propriospinali e degli assoni spinali-proiezione dal tronco encefalico. Tra i 36 grandi neuroni spinali-proiezione identificabili, alcuni sono buoni recuperatori e gli altri sono cattivi rigeneratori. Questi neuroni possono essere più facilmente identificate nelle preparazioni SNC wholemount. Al fine di comprendere i meccanismi dei neuroni-intrinseca che favoriscono o inibiscono la rigenerazione degli assoni dopo una lesione nei vertebrati del SNC, si determina differenze di espressione genica tra i rigeneratori buoni e cattivi, e come l'espressione è influenzata dalla resezione del midollo spinale. Questo documento illustra le tecniche per l'edilizia abitativa larvale e recentemente trasformato lamprede di mare per adulti in serbatoi d'acqua dolce, producendo completi transezioni midollo spinale sotto visione microscopica, e preparare brain e wholemounts midollo spinale per ibridazione in situ. In breve, gli animali sono mantenuti a 16 ° C e anestetizzato in 1% benzocaina in lampreda Ringer. Il midollo spinale è sezionato con iridectomia forbici attraverso un approccio dorsale e l'animale è permesso di recuperare in serbatoi d'acqua dolce a 23 ° C. Per ibridazione in situ, gli animali sono reanesthetized e il cervello e il cavo rimosso tramite un approccio dorsale.
Introduzione
Nei mammiferi lesioni del midollo spinale (SCI) è una condizione devastante che porta alla perdita permanente della funzione al di sotto del sito di lesione, perché assoni feriti non si rigenerano attraverso la zona di trauma e ricollegare ai loro obiettivi adeguati. A differenza dei mammiferi, lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. 1 È interessante notare che, lamprede hanno una serie di 36 midollo spinale proiettando neuroni che sono singolarmente identificabili in tutto il montaggio preparati cervello a causa delle loro grandi dimensioni 2,3 (Figura 1) . Tutti questi neuroni spinali-pro....
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Protocollo
Vedere la Tabella 1 per tutti i materiali usati in questo protocollo.
Gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale alla Temple University.
1. Gli animali
- Ottenere tipo selvatico lamprede di mare larvali (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm di lunghezza (4-7 anni) da ruscelli che alimentano il lago Michigan, da affluenti del fiume Delaware (Pennsylvania) o corsi d'acqua nel Maine.
- In laboratorio, mantenere le larve in gruppi di 50 - 100 animali in vasche d'acqua dolce 50 litri a 16 ° C. Linea i serbatoi con....
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Risultati
Come esempio dei risultati che si possono ottenere quando si utilizza questo metodo, le immagini rappresentative del cervello wholemounted che mostrano l'espressione dei trascritti neogenin in neuroni spinali identificabili spinale proiezione di controllo e 2 settimane dopo lesione larvali lamprede di mare sono mostrati nella Figura 2. I lettori si riferiscono a un precedente studio 6 segnalato il rapporto tra l'espressione di neogenin dopo una resezione completa del midollo spinale e.......
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Discussione
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire una resezione completa del midollo spinale e posteriore dissezione del cervello in lamprede di mare larvali. Questa procedura permette di analizzare le differenze nell'espressione genica tra identificabile midollo spinale sporgenti neuroni dopo la lesione del midollo spinale per mezzo di un cervello intero-mount ibridazione in situ. Il passaggio fondamentale nella procedura è la corretta esecuzione di una resezione completa del midollo spinale, che può essere.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Supportato da sovvenzioni NIH NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 al Dr. Michael E. Selzer; Borsa di ricerca Shriners SHC-85220 al Dr. Michael E Selzer; e Shriners Research Grant SHC-85310 al Dr. Michael I. Shifman. Il Dott. Antón Barreiro-Iglesias è stato sostenuto dalla Fundación Barrié (Spagna) e dalla Xunta de Galicia (Galizia, Spagna).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tricaina metano solfonato | Spettro | TR108 | Soluzione satura di benzocaina in PBS per sacrificio |
| Bisturi #3 | Strumenti di scienza fine (FST) | 10003-12 | |
| Lame per bisturi: #11 | Strumenti di scienza fine | 10011-00 | |
| Forbici Castroviejo #8 | Strumenti per la scienza fine | 15002-08 | |
| Pinze #4 & #5 | Dumont, Svizzera | Roboz RS4955 | #4 per la dissezione del midollo spinale; #5 per la rimozione di menninge |
| Microscopio da dissezione | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Spilli per insetti 0,15, 0,20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0,15 mm per il fissaggio del cervello e del midollo spinale; 0,20 mm per il corpo |
| ml Tubi a scintillazione in HDPE con tappi Fisher | Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldeide 16% | Microscopia elettronica Science (EMS) | 19210 | Diluire al 4% in PBS |
Riferimenti
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending br....
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Ristampe e permessi
