Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale Drosophila Tessuti In Situ

Sommario

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Abstract

Gli studi condotti in Drosophila melanogaster embrioni e larve forniscono informazioni cruciali nei processi di sviluppo, come specifica il destino delle cellule e organogenesi. Immunocolorazione permette la visualizzazione di sviluppare tessuti e organi. Tuttavia, una cuticola protettiva che si forma al termine della embriogenesi impedisce permeazione di anticorpi in embrioni in fase avanzata e larve. Mentre dissezione prima della colorazione viene regolarmente utilizzato per analizzare i tessuti di Drosophila larvali, si rivela inefficiente per alcune analisi, perché i piccoli tessuti possono essere difficili da individuare e isolare. Sonicazione fornisce un'alternativa alla dissezione nei protocolli di immunoistochimica Drosophila larvali. Esso consente una rapida, l'elaborazione simultanea di un gran numero di embrioni in fase avanzata e le larve e mantiene nella morfologia situ. Dopo fissazione in formaldeide, un campione viene sonicato. Campione viene quindi sottoposto ad immunocolorazione con antigene-specifica formica primariaibodies e anticorpi secondari fluorescente di visualizzare tipi di cellule bersaglio e proteine ​​specifiche mediante microscopia a fluorescenza. Durante il processo di sonicazione, il corretto posizionamento di una sonda sonicating sopra il campione, nonché la durata e l'intensità della sonicazione, è critica. Additonal piccole modifiche ai protocolli di immunoistochimica standard possono essere richiesti per le macchie di alta qualità. Per gli anticorpi con basso rapporto segnale rumore, tempi di incubazione più lunghi sono in genere necessari. Come un proof of concept per questo protocollo sonicazione-facilitato, mostriamo immunoistochimiche su tre tipi di tessuto (testicoli, ovaie, e tessuti neurali) ad una serie di stadi di sviluppo.

Introduzione

Embrioni di Drosophila e larve forniscono un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo in molti organi e tessuti. Imaging delle singole cellule è spesso necessario in questi studi per verificare gli ambienti complessi in cui le cellule si sviluppano. Visualizzazione di cellule nei tessuti può essere realizzato attraverso immunostaining. Ben descritti immunoistochimica esistono protocolli per i tessuti embrionali di Drosophila <17 ore dopo la deposizione delle uova (AEL) ^1-3. Tuttavia, un protettivo forme cuticola verso la fine dell'embriogenesi, impedendo efficace permeazione anticorpo. Così, questi protocolli immunostaini....

Protocollo

1 Preparazione di una gabbia Collection

1. Anestetizzare giovani, mosche fertili con CO _2. Trasferimento mosche anestetizzati ad una gabbia. Per ottenere il rendimento ottimale, utilizzare 100-120 mosche adulte che vanno da 2-7 giorni di età in un rapporto 4: 1 di femmine ai maschi. Consenti mosche un adeguato periodo di acclimatazione, ~ 24 ore prima di ottenere il campione per il fissaggio. Se la gabbia è stato istituito con femmine vergini accoppiato ai maschi, un uso un 36 - periodo di acclimatazione ore 48.
2. Sulla estremità aperta della gabbia, mettere una piastra di agar succo di mela pre-preparata con una goccia monetina imprese di ....

Risultati

Per dimostrare l'efficacia di immunoistochimica basata sonicazione-analisi di ritardo-fase embrionale e tessuti larvali in situ, wild-type embrioni e larve sono stati trattati per immunoistochimica dei testicoli, ovaie e tessuto neurale. I campioni sono stati ripresi tramite microscopia confocale e risultati rappresentativi sono mostrati (Figura 1 e Figura 2). I risultati rivelano che il protocollo descritto è efficace per la visualizzazione di caratteri morfologici, nonché le .......

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo per indirizzare correttamente immunostain Drosophila embrionale e tessuti larvali in situ, eliminando così la necessità di dissezione. Come per i protocolli precedenti per la colorazione embrioni precoci ^1,2,3, la membrana corionica viene rimossa con il 50% di candeggina (NaOCl). I campioni sono fissati in formaldeide e metanolo. Poiché la cuticola larvale provoca campione più vecchio a stare a galla, l'intero campione viene fatto passare attraverso u.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tabella 1: Reagenti e tamponi Tampone
fosfato Triton X-100 (PBTx)			Per 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Negozio presso RT.
Soluzione salina tampone fosfato 10X (PBS 10X)			Per 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Aggiungere i componenti e riempire fino al volume appropriato. Conservare a 4 °C.
Triton 10%			Per 50 ml: 5 ml di Triton, 5 ml di PBS 10X, 45 ml di ddH2O. Rock da miscelare. Negozio presso RT.
Tubi PEMS			0,1 m (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Negozio presso RT.
Tubi			Per 400 ml di una soluzione 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubi dH20 NaOH. Sciogliere i tubi in 300 ml di dH2O e quindi regolare a pH 6,9 con NaOH. Portare il volume totale a 400 ml con dH2O e autoclave. Negozio presso RT.
Formaldeide			37% formaldeide in peso in metanolo. Conservare presso RT. Conservare la miscela di scarti di formaldeide, eptano e metanolo in un contenitore ermeticamente sigillato in cappa aspirante prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali.
Eptano		CAS 142-82-5	n-eptano. Conservare presso RT. Conservare la miscela di scarti di formaldeide, eptano e metanolo in un contenitore ermeticamente sigillato in cappa aspirante prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali.
Metanolo		CAS 67-56-1	Conservare presso RT. Conservare la miscela di rifiuti di formaldeide, eptano e metanolo in un contenitore ermeticamente sigillato in cappa aspirante prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali.
Tampone fosfato Tween (PBTw)			Per fare 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Il filtro sterilizza dopo aver aggiunto tutti i componenti. Conservare a 4 °C.
Tween 10%			Per 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml di PBS 10X, 40 ml di ddH2O. Rock da miscelare. Negozio presso RT.
Siero bovino albumina/tampone fosfato Tween (BBTw)			Per fare 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere BSA quindi sterilizzare utilizzando un 0,2 μ m Unità filtro sottovuoto. Conservare a 4 °C.
Siero di capra normale (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	Per fare 10 ml: Siero di capra normale 10 ml ddH2O. Aggiungere ddH2O alla fiala di NGS e sterilizzare con un 0,2 μ m Filtro Syrninge. Conservare le aliquote a -20 °C.
1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano (DABCO)		CAS: 281-57-9	Per fare 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml di Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g di DABCO solido, 3,5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml di glicerolo. Nel becher da 250 ml con ancoretta, aggiungere ddH2O, Tris HCl e DABCO. Mescolare e poi aggiungere 6N HCl, 10 N NaOH e glicerolo. Quindi aggiungere 10N NaOH goccia a goccia fino a quando la soluzione raggiunge il pH 7,5. Aliquota. Conservare le aliquote a -20 °C.
		di p-fenilendiammina (PPD)	1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Sciogliere la PPD nella soluzione di NaHCO3 e NaCO3. Aggiungi 60 μ l di soluzione PPD a 500 μ l di DABCO. Conservare le aliquote a -20 °C.
			preparare ~200 piatti: 45 g di agar agar (CAS#9002-18-0), 45 g di zucchero semolato (acquistato in negozio), 500 ml di succo di mela (acquistato in negozio), 15 ml di Tegosept 10%, 1,5 ml di ddH2O. Aggiungere l'agar a ddH2O in un pallone da 4 L, quindi sterilizzare in autoclave per 30 minuti. Mescolare il succo di mela e lo zucchero sulla piastra di cottura riscaldata. Aggiungere gradualmente la miscela di succo di mela all'agar autoclavato. Mescolare su una piastra di miscelazione riscaldata, quindi aliquotare 10 ml di volume in piastre di Petri da 35 mm e lasciare riposare a RT per solidificare. Conservare a 4 °C.
Tegosept 10%			Per fare 100 ml: 10 g di Tegosept, 100 ml di etanolo. Conservare le aliquote a -20 °C.
Pasta			50 g di lievito attivo secco. Aggiungere gradualmente ddH2O al bicchiere contenente lievito mescolando fino a raggiungere una consistenza pastosa. Conservare a 4 °C.
Tabella 2: Materiali coloranti
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock a 5 mg/ml.
Coniglio anti-Vasa			1:250, dono di Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, un dono di Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Topo anti-Prospero	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
topo anti-Repo	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Capra anti-coniglio Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Capra anti-topo Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Maiale anti-guniea di capra Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Capra anti-ratto Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Tabella 3: Materiali e attrezzature
Gabbie per mosche	fatte a mano; Genesee Scientific Corporation	Non applicabile; Bottiglie: 32-130; Gabbia prefabbricata: 59-101	Realizzata tagliando tubi acrilici colati trasparenti (1 3/4 di pollice di diametro) in segmenti alti 4 pollici con una troncatrice composta a 400 giri/min. Schermatura ultrafine in acciaio inossidabile (è stata fissata a un'estremità della vasca con colla acrilica. Un metodo alternativo che utilizza una bottiglia vuota di cibo per mosche può essere trovato nei protocolli Drosophila ISBN 0-87969-584-4. Le gabbie possono anche essere acquistate dalla Genesee Scientific Corporation.
Sonicatore: Branson 250 Digital Sonifier		Branson Modello: Branson Digital Sonifier 250
Sonda sonicatrice	Branson	Modello #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Filtro per siringa	Nalgene	190-25-20	0.2 μ m cellulosa, filtro a membrana in acetato
Sistema di imaging: Microscopio confocale a disco rotante con sorgente luminosa multicromatica, fotocamera CCD digitale e software di imaging	Microscopio: Olympus, Sorgente luminosa: Lumen Dynamics, Fotocamera: Q-Imaging, Software di imaging: Intelligent Imaging Inc.		Microscopio: BX51 dotato di disco rotante DSU, Sorgente luminosa: X-Cite 120Q, Fotocamera: RETIGA-SRV, Software di imaging: Slidebook 5.0
Unità filtro sottovuoto	Nalgene	450-0020	0.2 μ m filtro a membrana in nitrato di cellulosa