Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.
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Articolo metodologico
Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in
In questo articolo
Sommario
Abstract
In piante da fiore, la transizione destino delle cellule somatiche-to-riproduttiva è segnato dalla specificazione delle cellule madri spore (SMC) in organi floreali della pianta adulta. La femmina SMC (cellula madre megaspore, MMC) differenzia nel primordio ovulo e subisce meiosi. Il megaspore haploid selezionato poi subisce mitosi per formare il gametofito multicellulare femminile, che darà origine ai gameti, la cellula uovo e la cellula centrale, insieme a cellule accessorie. L'accessibilità limitata della MMC, meiocyte e gametofito femminile all'interno dell'ovulo è tecnicamente impegnativo per citologica e citogenetica analisi a livello di singola cellula. In particolare, immunorivelazione diretta o indiretta di epitopi cellulari o nucleari è compromessa dalla scarsa penetrazione dei reagenti all'interno della cellula vegetale e di imaging singola cellula è locato dalla mancanza di chiarezza ottica in tutto il montaggio tessuti.
Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace per analizzare i Nuclorganizzazione orecchio e la modifica della cromatina ad alta risoluzione della singola cella in tutto il montaggio ovuli di Arabidopsis embedded. Si basa sulla dissezione e l'incorporamento di ovuli fissati in uno strato sottile di gel di acrilammide su un vetrino microscopico. Gli ovuli incorporati vengono sottoposti a trattamenti chimici ed enzimatici volti a migliorare la chiarezza tessuto e permeabilità ai reagenti di immunoistochimica. Tali trattamenti conservano organizzazione, DNA e proteine epitopi cellulari e cromatina. I campioni possono essere utilizzati per diverse analisi citologiche a valle, cromatina immunostaining, ibridazione in situ fluorescente (FISH), e colorazione del DNA per l'analisi eterocromatina. Microscopio confocale a scansione laser (CLSM) delle immagini, ad alta risoluzione, seguita dalla ricostruzione 3D permette misurazioni quantitative a risoluzione singola cellula.
Introduzione
In piante da fiore, l'istituzione di linee riproduttive inizia con la differenziazione di SMC, MMC femminile e cellula madre microspora maschile. Il MMC sviluppa da una cellula nucellare sub-epidermica sulla punta distale del primordio ovulo, e la cellula madre microspore sviluppa dal tessuto sporigeni nel locule antera, che si trovano in profondità all'interno degli organi floreali 1. SMCs subiscono meiosi per produrre spore aploidi, che poi danno origine ai gametofiti su mitosi. Il gametofito femminile, o embrione sac, costituito da una cellula uovo, una cella centrale, due synergids e tre antipodals. Il gametofito maschile, o il polline, è composto da una cellula vegetativa e due cellule spermatiche. Mentre il gametofito maschile rimane uno studio oggetto d'relativamente accessibile, il gametofito femminile è incorporato all'interno dell'ovulo, si racchiuso nel carpello fiore, e pone quindi sfide specifiche per analisi molecolari e citologici. Recentemente, tuttavia, laser assistitamicrodissezione ha offerto una soluzione elegante che permette trascrittomica analizza in MMC e cellule gametofitici femminili 2-4. In aggiunta l'espressione del gene candidato analisi, ad esempio utilizzando RNA ibridazione in situ o giornalista test genetici, analisi citologiche consente indagare le dinamiche di componenti cellulari endogeni mediante specifica colorazione cellulare diretto o indiretto immunoistochimica. In particolare, la colorazione citogenetica utilizzando FISH e la colorazione del DNA, insieme con immunocolorazione delle modificazioni della cromatina o componenti della cromatina sono approcci centrali di chiarire la dinamica della cromatina e l'organizzazione nucleare in Arabidopsis 5. In genere, la meiosi comporta dinamiche cromosomiche specifiche, che è stato ben studiato in pianta maschio meiocytes 6,7; ulteriormente su larga scala, specifica delle cellule cromatina riorganizzazione, probabilmente riflettendo riprogrammazione epigenetica dinamico è stato descritto durante lo sviluppo del polline 8-10. Per contro, a causaalla relativa inaccessibilità della meiocyte femmina e gametofito, queste indagini rimangono tecnicamente difficile da applicare, e spesso richiedono dissezione sezionamento o manuale e digestione enzimatica (vedi sotto). Inoltre, la prevalente mancanza di chiarezza ottica in tutto il monte è un ostacolo alla imaging ad alta risoluzione delle cellule riproduttive in ovuli intatti.
Un metodo classico per l'analisi citologica di organizzazione cromosoma in ovuli interi montaggio utilizza la colorazione del Feulgen 11-13. Si tratta di idrolisi acida (con acido ipocloroso) del DNA che provoca la denaturazione delle proteine e provoca la distruzione della struttura della cromatina così. In alternativa, l'organizzazione dei cromosomi in meiocytes femminili e cellule gametofitici può essere osservata con colorazione DAPI e immunoistochimica su sezioni semi-sottili o sacche di embrioni sezionati e MMC (per esempio vedi 14-18). Chiaramente, però, la dissezione manuale e sezionamento possono essere laborioso eostacola l'analisi qualitativa e quantitativa di un gran numero di epitopi cromatina.
Qui forniamo un protocollo efficiente per preparare un gran numero di ovuli Arabidopsis adatti per una varietà di valle colorazione citologica in tutto il montaggio. In breve, boccioli di fiori sono incubati in una soluzione di fissativo, filari di ovuli sono sezionati dal carpello e incorporate in acrilammide sulla trasparenza come fatto per il polline meiocytes 19,20. Gli ovuli incorporati sono ulteriormente cancellate e fissate in metanolo, etanolo, e xilene prima digestione parete cellulare e permeabilizzazione. Eventuali variazioni di questi passaggi sono discussi. I campioni possono quindi essere utilizzate per la colorazione del DNA, immunoistochimica e FISH. La modalità di preparazione è efficiente e consente parallelo sperimentale set-up (fino a 16 vetrini possono essere preparati in un giorno per l'analisi a valle differente). I trattamenti descritti permettono di segnali omogenei in tutto-mount e istologici, cellulari ben conservati,e l'organizzazione nucleare in cellule riproduttive e cellule nucellare circostanti che beneficiano confronti qualitativi e quantitativi tra i tipi di cellule. Calibrato, a base di CLSM imaging ad alta risoluzione seguita da ricostruzione 3-dimensionale consente misurazioni quantitative significative di segnali fluorescenti. Abbiamo utilizzato con successo questa procedura per analizzare le dinamiche della cromatina in MMC differenziare 21 e in via di sviluppo gametofito femminile 22; Vi presentiamo qui i risultati rappresentativi di analisi heterochromatin, immunostaining cromatina, GFP immunostaining e FISH in tutto il montaggio ovuli. Siamo inoltre convinti che il nostro protocollo sarà adatto per altri tessuti vegetali e specie.
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Protocollo
La procedura è descritta nel flusso di lavoro in Figura 1, e la configurazione per la dissezione e l'incorporamento di tessuti sono rappresentati nella Figura 2.
1. Tissue fissaggio
- Raccogliere 20-30 carpelli in una provetta per microcentrifuga contenente appena fatto tampone fissativo BVO sul ghiaccio.
- Fissare il tessuto 30 min con una leggera agitazione a temperatura ambiente.
- Gira le provette contenenti i carpelli in fissativo in un banco microcentrifuga 1 min a 400 x g.
- Rimuovere con cautela il buffer fissativo e aggiungere 1 ml di PBT, posizionare i tubi sul ghiaccio.
2. Dissection and Embedding
- Preparare cinque provette Eppendorf con ogni 200 ml di un appena fatto, 5% miscela di acrilamide.
- Preparare cinque vetrini Superfrost pre-puliti con il 70% di etanolo e marcate con una matita.
- Scongelare una aliquota del 20% di APS e il 20% PAN ciascuno, sul ghiaccio.
- Prendere 4-5 carpelli con una punta cut-end, postoli su un vetrino pulito, rimuovere l'eccesso di liquido.
- Effettuare tagli longitudinali con un ago sottile e staccare le pareti carpello a rilasciare file di ovuli, come mostrato figura 2, evitare la disidratazione coprendo con PBS (non superiore a 10 ml).
- Aggiungere rapidamente e mescolare 12 PAN microlitri, 12 APS microlitri con una aliquota di 200 microlitri mix acrilamide.
- Aggiungere 30 ml di acrilammide attivato sui ovuli sezionati.
- Coprire con un coprioggetto mm 20 x 20, lasciate polimerizzare a temperatura ambiente, 45-60 min.
- Rimuovere il vetrino con una lama di rasoio. In questa fase, i campioni possono essere conservati a 4 ° C in una vaschetta Coplin contenente PBS.
3. Processazione dei tessuti
NOTA: Tutte le fasi tranne 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 e 3.4.3 sono svolte in vaschette Coplin con 80 ml di soluzione sotto la cappa chimica a temperatura ambiente. I vetrini vengono trasferiti con un piatto-punta pinze.
- Tissue chiarimenti efissazione:
- Incubare 5 min in metanolo.
- Incubare 5 min in etanolo.
- Incubare 30 min in etanolo: xilene (1:1).
- Incubare 5 min in etanolo.
- Incubare 5 min in metanolo.
- Incubare 15 min in metanolo e PBT (1:1), integrato con 2,5% di formaldeide.
- Sciacquare 2 x 10 min in PBT. In questa fase, i vetrini possono essere conservati per una notte a 4 ° C.
- Digestione della parete cellulare:
- Scongelare una aliquota della miscela di digestione parete cellulare su ghiaccio.
- Prendete una diapositiva dalla vaschetta Coplin, drenare l'eccesso di liquido ponendolo verticalmente su un tovagliolo di carta.
- Aggiungere 100 ml di parete cellulare mix digestione sopra il pad acrilamide e coprire con un coprioggetto mm 23 x 46. Ripetere l'operazione per le altre diapositive. Incubare per 2 ore a 37 ° C in una camera umida (descritto in Materiali).
- Lavare il slides 2 x 5 minuti in PBT.
- RNase A Trattamento:
- Prendete una diapositiva dalla vaschetta Coplin, drenare the l'eccesso di liquido come prima.
- Incubare il vetrino con 100 ml di RNAseA a 100 pg / ml in PBS con 1% Tween-20 per 1 ora a 37 ° C in una camera umida.
- Lavare i vetrini per 2 x 5 minuti in PBT.
- Post-fissazione e permeabilizzazione:
- Post-fix per 20 minuti in appena fatto PBT-F.
- Sciacquare i vetrini per 10 minuti in PBT.
- Permeabilize per 2 h in PBS con 2% di Tween-20 a 4 ° C.
- Sciacquare i vetrini per 2 x 5 minuti in PBT.
4. Immunostaining
NOTA: Per questo passaggio, la concentrazione ottimale dell'anticorpo primario deve essere testato utilizzando diverse diluizioni (1:200, 1:500, 1:1000) degli anticorpi.
- Incubare il vetrino con 100 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS con 0,2% di Tween-20 per 12-24 ore a 4 ° C.
- Lavare i vetrini in PBT per 2-4 ore a temperatura ambiente sotto leggera agitazione.
- Applicare il1:200 anticorpo secondario in PBS + 0,2% Tween-20 per 24 ore a 4 ° C.
- Lavare i vetrini in PBT per 1 ora a temperatura ambiente sotto leggera agitazione.
- Controcolorare con 10 ug / ml di ioduro di propidio in PBS per 15 minuti, quindi risciacquare 15 min in PBS sotto leggera agitazione, a temperatura ambiente.
- Mount anti-fading liquido di montaggio integrato con 10 mg / ml ioduro di propidio. Lasciate che il mezzo di montaggio indurire per 1 ora prima di acquisire le immagini da CLSM.
5. Imaging quantitativa
- Acquisizione delle immagini:
- Acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando CLSM, preferibilmente utilizzando una modalità di scansione di risonanza, che permette una migliore conservazione dei segnali fluorescenti su immagini prolungata 23, e un obiettivo ad immersione 63X glicerolo.
- Testare i parametri di acquisizione come l'intensità del laser, guadagno, pinhole, dimensione voxel e fattore di zoom all'inizio dell'esperimento definire una procedura di acquisizione standard da seguire rigorosamente tuttatutte le diapositive per le misure quantitative coerenti.
- Verificare l'assenza di cross-talk tra fluorocromi. Se presente, impostare una scansione sequenziale. Acquisire le immagini della trasmissione separatamente e non contemporaneamente.
- Eseguire seriale, l'acquisizione di immagini tridimensionali con la massima risoluzione possibile nelle dimensioni X e Y e con 2x oversampling nella dimensione z (regola di Nyquist).
- Elaborazione delle immagini:
- Ricostruire le immagini in serie in tre dimensioni utilizzando il software fonte commerciale o aperto.
- Definire superfici di contorno attorno a ciascun nucleo (o cella) di interesse in 3D.
- Quantificare fluorescenza in ciascun canale come la somma di intensità dei pixel in ciascun oggetto.
- Esportare i dati in Excel per le analisi statistiche. Normalizzare i segnali di anticorpi contro i segnali di colorazione ad esempio DNA.
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Risultati
Forniamo un protocollo robusto per la preparazione su larga scala e l'elaborazione di ovuli di Arabidopsis adatti per la colorazione citologica in tutto-mount. Grazie alla incorporamento, gli ovuli conservano una struttura 3-dimensionale (Figura 3). Inoltre, il trattamento dei tessuti con precisazioni ottico consente strutture subcellulari di imaging ad alta risoluzione. Figura 4 mostra la colorazione del DNA in tutto il montaggio primordi dell'ovulo dove heterochromati...
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Discussione
In piante da fiore, il lignaggio riproduttivo femminile è circondato da diversi strati di cellule, tra cui il nucellus e tegumenti ovuli, rendendo la colorazione citologica in tutto il montaggio tecnicamente impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo efficace che consente la preparazione e l'elaborazione di un gran numero di ovuli adatti per la colorazione citologica come immunostaining, colorazione DNA e ibridazione in situ fluorescente in tutto il montaggio. Abbiamo utilizzato con successo per l'an...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Ueli Grossniklaus (Università di Zurigo) per il supporto tecnico e finanziario. Siamo grati a Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos e Peter Kopf per il supporto generale del laboratorio. Questa ricerca è stata finanziata dall'Università di Zurigo, da sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzera a CB (31003A_130722) e Ueli Grossniklaus (31003A_141245 e 31003AB-126006) e dall'Agence Nationale de la Recherche a DG (Programma ANR-BLANC-2012).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzioni | |||
| Tampone di fissazione BVO (basato su32) | 2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldeide, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0,1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2,5% (v/v) formaldeide | ||
| 30% acrilammide:bisacrilammide | 3 g di acrilammide, 0,33 g di bisacrilammide, 1x PBS (preparare 10 ml, conservare a 4 gradi; C) | ||
| 200 ml di miscela di acrilammide al 5% in PBS | 34 ml di acrilammide al 30%:bisacrilammide, 166 ml 1x PBS (fare fresco dal 30% di brodo) | ||
| 20% di ammoniopersulfto | , 1 ml di acqua sterile (preparare aliquote con 1 ml e conservare a -20 ° C) | ||
| 20% solfito | , 0,2 g di solfito di sodio, 1 ml di acqua sterile (preparare aliquote con 1 ml e conservare a -20 gradi; C) | ||
| enzimatica della parete cellulare | 0,5% (p/v) cellulasi, 1% (p/v) drisalilasi, 0,5% (p/v) pectoliasi | ||
| Reagenti e materiali | |||
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Etanolo | Schaurlau | ET00102500 | |
| Metanolo | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xilene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulasi | Sigma | 1794 | |
| Driselasi | Sigma | D8037 | |
| pectoliasi | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrilammide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrilammide | Sigma | M2022 | |
| ammonio tossicopersolfato | Sigma | A9164 | |
| Solfito di sodio | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimetil-istone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti-monometil-istone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488 ~ capra ~ anti ~ coniglio (H + L) | Sonda molecolare | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Ioduro di propidio | Sigma | P4170 | tossico |
| DAPI | Sigma | D9542 | RNAsi tossico |
| A | Roche | 10109169001 | |
| barattolo Coplin | Huber & CO | 10.055 | |
| Pinze | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Camera | Una scatola di plastica con all'interno un tovagliolo di carta umido, un supporto di plastica viene inserito nella scatola per sostenere i vetrini e tenere i vetrini lontani dall'acqua. | ||
| Scivolo Superfrost Plus | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Glä ser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
