Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in Arabidopsis

Summary

Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.

Abstract

In piante da fiore, la transizione destino delle cellule somatiche-to-riproduttiva è segnato dalla specificazione delle cellule madri spore (SMC) in organi floreali della pianta adulta. La femmina SMC (cellula madre megaspore, MMC) differenzia nel primordio ovulo e subisce meiosi. Il megaspore haploid selezionato poi subisce mitosi per formare il gametofito multicellulare femminile, che darà origine ai gameti, la cellula uovo e la cellula centrale, insieme a cellule accessorie. L'accessibilità limitata della MMC, meiocyte e gametofito femminile all'interno dell'ovulo è tecnicamente impegnativo per citologica e citogenetica analisi a livello di singola cellula. In particolare, immunorivelazione diretta o indiretta di epitopi cellulari o nucleari è compromessa dalla scarsa penetrazione dei reagenti all'interno della cellula vegetale e di imaging singola cellula è locato dalla mancanza di chiarezza ottica in tutto il montaggio tessuti.

Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace per analizzare i Nuclorganizzazione orecchio e la modifica della cromatina ad alta risoluzione della singola cella in tutto il montaggio ovuli di Arabidopsis embedded. Si basa sulla dissezione e l'incorporamento di ovuli fissati in uno strato sottile di gel di acrilammide su un vetrino microscopico. Gli ovuli incorporati vengono sottoposti a trattamenti chimici ed enzimatici volti a migliorare la chiarezza tessuto e permeabilità ai reagenti di immunoistochimica. Tali trattamenti conservano organizzazione, DNA e proteine ​​epitopi cellulari e cromatina. I campioni possono essere utilizzati per diverse analisi citologiche a valle, cromatina immunostaining, ibridazione in situ fluorescente (FISH), e colorazione del DNA per l'analisi eterocromatina. Microscopio confocale a scansione laser (CLSM) delle immagini, ad alta risoluzione, seguita dalla ricostruzione 3D permette misurazioni quantitative a risoluzione singola cellula.

Introduction

In piante da fiore, l'istituzione di linee riproduttive inizia con la differenziazione di SMC, MMC femminile e cellula madre microspora maschile. Il MMC sviluppa da una cellula nucellare sub-epidermica sulla punta distale del primordio ovulo, e la cellula madre microspore sviluppa dal tessuto sporigeni nel locule antera, che si trovano in profondità all'interno degli organi floreali ^1. SMCs subiscono meiosi per produrre spore aploidi, che poi danno origine ai gametofiti su mitosi. Il gametofito femminile, o embrione sac, costituito da una cellula uovo, una cella centrale, due synergids e tre antipodals. Il gametofito maschile, o il polline, è compo....

Protocol

La procedura è descritta nel flusso di lavoro in Figura 1, e la configurazione per la dissezione e l'incorporamento di tessuti sono rappresentati nella Figura 2.

1. Tissue fissaggio

1. Raccogliere 20-30 carpelli in una provetta per microcentrifuga contenente appena fatto tampone fissativo BVO sul ghiaccio.
2. Fissare il tessuto 30 min con una leggera agitazione a temperatura ambiente.
3. Gira le provette contenenti i carpelli in fissativo in un banco microcentrifuga 1 min a 400 x g.
4. Rimuovere con cautela il buffer fissativo e aggiungere 1 ml di PBT, posizionare i tubi s....

Results

Forniamo un protocollo robusto per la preparazione su larga scala e l'elaborazione di ovuli di Arabidopsis adatti per la colorazione citologica in tutto-mount. Grazie alla incorporamento, gli ovuli conservano una struttura 3-dimensionale (Figura 3). Inoltre, il trattamento dei tessuti con precisazioni ottico consente strutture subcellulari di imaging ad alta risoluzione. Figura 4 mostra la colorazione del DNA in tutto il montaggio primordi dell'ovulo dove heterochromatin appare.......

Discussion

In piante da fiore, il lignaggio riproduttivo femminile è circondato da diversi strati di cellule, tra cui il nucellus e tegumenti ovuli, rendendo la colorazione citologica in tutto il montaggio tecnicamente impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo efficace che consente la preparazione e l'elaborazione di un gran numero di ovuli adatti per la colorazione citologica come immunostaining, colorazione DNA e ibridazione in situ fluorescente in tutto il montaggio. Abbiamo utilizzato con successo per l'an.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzioni
Tampone di fissazione BVO (basato su32)			2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldeide, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5% (v/v) formaldeide
30% acrilammide:bisacrilammide			3 g di acrilammide, 0,33 g di bisacrilammide, 1x PBS (preparare 10 ml, conservare a 4 gradi; C)
200 ml di miscela di acrilammide al 5% in PBS			34 ml di acrilammide al 30%:bisacrilammide, 166 ml 1x PBS (fare fresco dal 30% di brodo)
20% di ammoniopersulfto			, 1 ml di acqua sterile (preparare aliquote con 1 ml e conservare a -20 ° C)
20% solfito			, 0,2 g di solfito di sodio, 1 ml di acqua sterile (preparare aliquote con 1 ml e conservare a -20 gradi; C)
		enzimatica della parete cellulare	0,5% (p/v) cellulasi, 1% (p/v) drisalilasi, 0,5% (p/v) pectoliasi
Reagenti e materiali
Formaldeide	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Etanolo	Schaurlau	ET00102500
Metanolo	Schaurlau	ME03062500
Xilene	ROTH	4436.1
Cellulasi	Sigma	1794
Driselasi	Sigma	D8037
pectoliasi	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrilammide	Sigma	A-3553
bisacrilammide	Sigma	M2022
ammonio tossicopersolfato	Sigma	A9164
Solfito di sodio	Fluka	71988
Anti-trimetil-istone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti-monometil-istone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488 ~ capra ~ anti ~ coniglio (H + L)	Sonda molecolare	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Ioduro di propidio	Sigma	P4170	tossico
DAPI	Sigma	D9542	RNAsi tossico
A	Roche	10109169001
barattolo Coplin	Huber & CO	10.055
Pinze	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Camera			Una scatola di plastica con all'interno un tovagliolo di carta umido, un supporto di plastica viene inserito nella scatola per sostenere i vetrini e tenere i vetrini lontani dall'acqua.
Scivolo Superfrost Plus	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek