Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

William Stephenson; Gorby Wan; Scott A. Tenenbaum; Pan T. X. Li

doi:10.3791/51542

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Articolo metodologico

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

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DOI:

10.3791/51542

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20 agosto 2014

William Stephenson¹ , Gorby Wan² , Scott A. Tenenbaum³^,⁴ , Pan T. X. Li⁴^,⁵

¹Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ²Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ³Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ⁴The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, ⁵Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

In questo articolo

Sommario

Le pinzette ottiche sono state utilizzate per studiare il ripiegamento dell'RNA allungando le singole molecole dalle loro estremità 5' e 3'. Qui vengono descritte le procedure comuni per sintetizzare molecole di RNA per la pinzetta, la calibrazione dello strumento e i metodi per manipolare singole molecole.

Abstract

Una gran parte del genoma umano viene trascritto ma non tradotto. In questo post genomica, funzioni di regolamentazione di RNA hanno dimostrato di essere sempre più importante. Dato che la funzione RNA spesso dipende dalla sua capacità di adottare strutture alternative, è difficile prevedere RNA strutture tridimensionali direttamente dalla sequenza. Singola molecola approcci mostrano potenzialità per risolvere il problema di RNA polimorfismo strutturale monitorando strutture molecolari una molecola alla volta. Questo lavoro presenta un metodo per manipolare con precisione la piegatura e la struttura delle molecole di RNA singoli utilizzando pinzette ottiche. In primo luogo, i metodi per sintetizzare molecole adatte a singola molecola lavoro meccanico sono descritti. Avanti, diverse procedure di calibrazione per garantire le operazioni corrette delle pinzette ottiche sono discussi. Successivamente, vari esperimenti sono spiegati. Per dimostrare l'utilità della tecnica, i risultati di dispiegamento meccanicamente forcine RNA e un singolo RNA kissing complesso sono utilizzati come prova. In questi esempi, la tecnica nanomanipolazione stato utilizzato per studiare piegatura di ciascun dominio strutturale, comprese secondaria e terziaria, in modo indipendente. Infine, le limitazioni e le future applicazioni del metodo sono discussi.

Introduzione

Lo sviluppo della tecnica pinzette ottiche è stata a lungo accompagnato con la sua applicazione nella ricerca biologica. Quando l'effetto intrappolamento ottico è stato scoperto, Arthur Ashkin osservato che i batteri in acqua contaminata potrebbero essere intrappolati nel fuoco del laser ^1. Da allora, i batteri trapping è diventato un involontario, divertente esperimento per generazioni di studenti biofisica, nonché come strumento di ricerca seria per studiare la fisiologia microbica ^2,3. La tecnica di intrappolamento ottico utilizza focalizzato fascio laser per immobilizzare un oggetto microscopico ^1. In pratica, una funzione di ....