Articolo metodologico

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

DOI:

10.3791/51552

⸱

30 giugno 2014

 , 
1Department of Physiology, The University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Orthopedic Surgery and Biomedical Engineering, The University of Tennessee Health Science Center

In questo articolo

Sommario

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La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l'imaging di fluorescenza in tempo reale.

Abstract

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La preparazione isolato polmone sangue perfuso è ampiamente usato per visualizzare e definire segnalazione in singoli microvasi. Accoppiando questa preparazione con la rappresentazione in tempo reale, diventa fattibile per determinare le variazioni di permeabilità delle singole microvasi polmonari. Qui descriviamo passi per isolare i polmoni di ratto e profumato con sangue autologo. Poi, abbiamo delineare misure per infondere fluorofori o agenti attraverso un microcatetere in una piccola regione del polmone. Utilizzando queste procedure descritte, abbiamo determinato un aumento della permeabilità nel ratto microvasi polmonari in risposta alle infusioni di lipopolisaccaride batterico. I dati hanno rivelato che lipopolisaccaride aumentata perdita di liquido in entrambi i segmenti venulare e capillare dei microvasi. Così, questo metodo permette di confrontare le risposte permeabilità tra segmenti vascolari e quindi, definisce alcun eterogeneità nella risposta. Mentre i metodi comunemente usati per definire la permeabilità polmonare richiedono post-elaborazione di campioni di tessuto polmonare, iluso di imaging in tempo reale evita questo requisito come evidente dal presente metodo. Così, la preparazione polmone isolato combinato con l'imaging in tempo reale offre diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali per determinare la permeabilità microvascolare polmonare, ma è un metodo semplice per sviluppare e implementare.

Introduzione

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Aumento della permeabilità microvascolare nei polmoni porta allo sviluppo di edema alveolare e gli scambi gassosi compromessa ed è un importante caratteristica del danno polmonare acuto (ALI) 1-3. Pertanto, le stime di permeabilità vascolare sono importanti nel definire l'entità del danno polmonare e l'efficacia degli interventi terapeutici proposti. Analisi gravimetrica come rapporto polmone gratuito sangue wet-to-dry e coefficiente di filtrazione microvascolare sono ampiamente utilizzati metodi per stimare la permeabilità 4,5. Altri metodi includono quantificare la ritenzione di sonde radioattive o fluorescenti nel tessuto polmonare

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti condotti su animali erano come approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Tennessee Health Science Center.

1. Tubing preparati perfusione Rat Lung

  1. Preparare un sistema di tubi con tubi Tygon (# 18) per la perfusione di sangue come mostrato in Figura 1. Collegare trasduttori di pressione (P23XL) e posizionare il tubo sul palco microscopio.
  2. Regolare la temperatura del bagno d'acqua a 37 ° C.
  3. Collegare l'ingresso del polmone e di uscita temporanea con tubo Tygon.

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Risultati

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Un isolato preparazione polmone sangue perfuso collegato al tubo per perfusione e relative apparecchiature è mostrato in Figura 2. A scopo dimostrativo, abbiamo usato un ratto Sprague Dawley, se le procedure qui descritte possono essere utilizzati con qualsiasi specie di ratto. Infusioni attraverso un microcatetere atriale sinistra raggiungono solo una piccola regione del polmone. La regione infuso può essere identificato dal scolorimento infusione indotta (Figura 3). La preparazione de.......

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Discussione

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La preparazione isolato polmone sangue perfuso accoppiato con immagini in tempo reale fornisce un semplice strumento per la determinazione delle variazioni di permeabilità in microvasi polmonari singoli. Abbiamo applicato questo metodo per definire cambiamenti di permeabilità in risposta alle infusioni di LPS. I nostri dati indicano chiaramente che LPS infusione provocato un aumento della permeabilità microvascolare. Inoltre, i dati indicano anche che i cambiamenti di permeabilità indotte da LPS erano simili in entrambi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli studi sono stati supportati da NIH HL75503 a KP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tygon TubingFisher Scientific#18
Trasduttore di pressioneData Sciences InternationalP23XLQuantità necessaria 3
Ago a farfallaGreiner Bio-One45008121 G
Pompa peristalticaCole ParmerMasterflex L/S
PE-90 TuboBecton Dickinson42742130 cm necessario
Tubo in PE-10Becton Dickinson42740140 cm necessari
Pompa a siringaBraintree ScientificBS8000
O-ringRealizzato su misura con un foro di diametro 20 mm e una maniglia per fissare l'O-ring al supporto
Microscopio a fluorescenza verticaleOlympus AmericaBX61WI
Software di acquisizione immaginiMolecular DevicesMetamorph
FITC destrano 20KDSigma Aldrich0,5 mg/ml (è possibile selezionare un destrano di diverse dimensioni molecolari, se gli esperimenti di prova ne indicano l'idoneità in base ai valori dell'indice di permeabilità calcolati) 
LipopolisaccarideSigma Aldrichsierotipo 0111:B4

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
  2. Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
  3. Bhattacharya, J., Matthay, M. A.

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Ristampe e permessi

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Isolated Rat LungBlood PerfusionMicrovessel PermeabilityFluorescence ImagingMicrocatheter InfusionLipopolysaccharide TreatmentDextran Permeability AssayReal time ImagingVascular Segment AnalysisLung Preparation Protocol

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