Trauma acuto cerebrale è una lesione grave che non ha alcun trattamento adeguato ad oggi. La microscopia multiphoton permette lo studio longitudinalmente il processo di sviluppo acuto trauma cerebrale e sondando strategie terapeutiche nei roditori. Due modelli di trauma cerebrale acuto studiato con in vivo a due fotoni di imaging del cervello sono dimostrate in questo protocollo.
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Articolo metodologico
Acuta cerebrale Trauma nei topi Seguito By longitudinale a due fotoni di imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
Anche se trauma cerebrale acuto spesso deriva da danni testa in diversi incidenti e colpisce una frazione consistente della popolazione, non vi è ancora alcun trattamento efficace per esso. Limiti dei modelli animali attualmente utilizzati impedire la comprensione del meccanismo patologia. La microscopia multiphoton permette di studiare cellule e tessuti all'interno cervelli animali intatti longitudinalmente in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, descriviamo due modelli di danno cerebrale acuto studiati per mezzo di due fotoni di imaging del comportamento delle cellule cerebrali in condizioni post-traumatiche. Una regione del cervello selezionata è ferito con un ago appuntito per produrre un trauma di larghezza controllato e profondità nel parenchima cerebrale. Il nostro metodo utilizza puntura stereotassica con un ago da siringa, che può essere combinato con l'applicazione simultanea della droga. Proponiamo che questo metodo può essere utilizzato come uno strumento avanzato per studiare i meccanismi cellulari di conseguenze fisiopatologiche di trauma acuto nel cervello dei mammiferi
Introduzione
Lesione cerebrale acuta è un problema rilevante di sanità pubblica, con alta incidenza di lesioni in incidenti automobilistici, cadute o aggressioni, e l'alta prevalenza di una successiva disabilità cronica. Approcci terapeutici per il trattamento di lesioni cerebrali rimangono del tutto sintomatico, limitando così l'efficacia del trattamento preospedaliero, chirurgica e critica. Questo rende l'impatto sociale ed economico delle lesioni cerebrali particolarmente grave. Per una serie di ragioni, la maggior parte degli studi clinici non hanno dimostrato un miglioramento nel recupero dopo lesione cerebrale utilizzando approcci terapeutici.
I modelli animali sono fondamentali per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nei confronti di una fase in cui l'efficacia dei farmaci può essere previsto in pazienti con lesioni cerebrali. Allo stato attuale, esistono diversi modelli animali ben consolidata di trauma cranico, compreso l'impatto controllato corticale 1, lesioni percussioni fluido 2, dinamico deformazione corticale 3, peso-drop4, e lesioni foto 5. Un certo numero di modelli sperimentali sono stati utilizzati per studiare alcuni aspetti morfologici, molecolari e comportamentali del trauma cranico associata patologia. Tuttavia, nessun singolo modello animale è del tutto riuscito a convalidare nuove strategie terapeutiche. Sviluppo di modelli animali affidabili, riproducibili e controllate di lesioni cerebrali è necessario valutare i processi patologici complessi.
Il romanzo combinazione delle più recenti tecnologie di imaging microscopici e reporter fluorescenti geneticamente codificati offre un'opportunità senza precedenti per studiare tutte le fasi di lesioni cerebrali, tra cui lesione primaria, diffusione della lesione primaria, lesione secondaria, e la rigenerazione. In particolare, in vivo microscopia a due fotoni è una tecnologia ottica non lineare unica che permette la visualizzazione in tempo reale delle strutture cellulari e subcellulari anche in strati profondi corticali del cervello dei roditori. Diversi tipi di cellule e organelles possono essere esposte contemporaneamente combinando marcatori fluorescenti differenti. L'utilizzo di questo potente strumento, possiamo visualizzare i cambiamenti morfologici e funzionali dinamici nel cervello di vivere in condizioni post-traumatiche. I vantaggi di in vivo microscopia a due fotoni nello studio di lesioni cerebrali sono stati recentemente dimostrati da Kirov e colleghi 6. Utilizzando un modello di focale contusione corticale mite, questi autori hanno dimostrato che lesioni dendritiche acuto nella corteccia pericontusional è recintato dalla diminuzione del flusso sanguigno locale. Inoltre, hanno dimostrato che la corteccia metabolicamente compromesso attorno al sito contusione è ulteriormente danneggiato dalla depolarizzazione diffusione. Questo danno secondario riguarda circuiti sinaptici, rendendo le conseguenze di lesioni cerebrali traumatiche più gravi.
Qui, proponiamo il metodo di puntura stereotassico con una siringa con ago, che può essere combinato con applicazione simultanea farmaco topico, come un modello avanzato per cervello localelesioni e come strumento per studiare le conseguenze fisiopatologiche del trauma acuto nel cervello dei mammiferi in vivo.
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Protocollo
Tutte le procedure qui presentate sono state eseguite secondo la guida locale per la cura degli animali (La legge finlandese sulla sperimentazione animale 62/2006). Licenza animali (ESAVI/2857/04.10.03/2012) è stato ottenuto da autorità locali (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Topi adulti di 1-3 mesi di età, peso 24-38 g, sono stati tenuti in gabbie individuali nella struttura animale certificata dell'Università e ha fornito cibo e acqua ad libitum.
1. Brain Injury Imaging attraverso una finestra cranica
- Anestetizzare gli animali e la preparazione del campo operatorio
- Anestetizzare topi mediante iniezione peritoneale di una miscela di ketamina (Ketalar, 80 mg / kg) e xilazina (Rompun, 10 mg / kg) sciolta in sterilizzata per filtrazione, tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4. Controllare i riflessi del topo regolarmente (coda e sonda pizzico tep) per verificare la profondità dell'anestesia. Aumentare la dose, se del caso, per mantenere l'anestesia corretta, ma evitare Overdose.
- Mantenere l'animale a 37,0 ° C con un batuffolo di riscaldamento durante l'intervento chirurgico, sessione di imaging e la prima ora dopo il recupero dall'anestesia.
- Per proteggere gli occhi del topo si asciughi, applicare il lubrificante occhio.
- Somministrare desametasone (Rapidexon veterinario, 2 mg / kg) per via sottocutanea per ridurre l'infiammazione ed edema cerebrale.
- Somministrare un analgesico (ad esempio, Ketoprophene intraperitoneale) fino a 30 minuti prima o immediatamente dopo l'intervento chirurgico. Se l'animale presenta alcun sintomo di dolore, come la riluttanza a muoversi, mangiare o bere, o perdita di peso, salivazione, piloerezione, o respiratoria anormale suoni dopo l'intervento chirurgico, ripetere l'iniezione di analgesico.
- Radersi la testa di topo 'con una macchina da barba (vedi Materiali e attrezzature). Evitare di danneggiare i baffi.
- Trattare la pelle sulla testa del topo con una soluzione di etanolo al 70% per pulire la zona rasata.
- Utilizzando le forbici chirurgiche (vedi Materiali eEquipment) e pinza (vedi Materiali e attrezzature), tagliare la pelle dalla linea di mezzo tra le orecchie alla fronte.
- Raschiare delicatamente via il tessuto connettivo attaccato al cranio con una lama smussata microchirurgico.
- Far scorrere i confini della pelle lateralmente e tirare bar orecchio leggermente in orifizi fonetiche del cranio per la testa e la fissazione della pelle.
- Pulire il cranio con PBS sterile e curare il sito chirurgico sulla testa del mouse con lo 0,5% clorexidina digluconato, quindi asciugare la superficie del cranio usando una combinazione di tamponi di cotone sterili e aria compressa.
- Inflizione della lesione cazzo
- Posizionare un piccolo strumento stereotassico animale con un titolare di animali (vedi Materiali e attrezzature).
- Regolare la posizione del microscopio binoculare accanto allo strumento stereotassico a concentrarsi sulla superficie del cranio dell'animale.
- Utilizzando un microscopio binoculare, individuare il punto bregma sul cranio.
- Identificare il region di interesse utilizzando le coordinate stereotassica.
NOTA: Evitare quelle aree di interesse che si trovano direttamente sopra vasi superficiali corticali. La distruzione di questi può influenzare fortemente la progressione trauma. - Posizionare l'ago G 30 sopra la regione prescelta e segnare il sito di destinazione da graffiare la superficie del cranio.
- Praticare il cranio con tutte le precauzioni possibili per evitare un inutile allargamento della superficie ossea interessata. Utilizzare un trapano chirurgico ad alta velocità (vedi Materiali e attrezzature) sotto il microscopio. Smettere di perforazione se il liquido viene visualizzata nell'area forato.
- Toccare il fondo del pozzo perforato con l'ago.
- Immergere l'ago uniformemente nel cervello (tasso di inserimento 5-10 mm / min), alla profondità di 0,5-2,0 mm secondo le coordinate del sito di applicazione puntura.
- Rimuovere l'ago subito dopo aver raggiunto la profondità desiderata (tasso di svincolo 5-10 mm / min) e pulire il sangue che appare dopo la puntura con un piccolo tampone (see Materiali e attrezzature).
- Eseguire microiniezione di 100 pM solforodamina 101 o un altro composto di interesse nel sito della lesione utilizzando una pompa microsiringa (WPI) e siringa da 10 microlitri Hamilton montare con pipetta di vetro.
NOTA: Durante la preparazione della pipetta di vetro dal capillare di vetro borosilicato, affilare la punta di un diametro di 10-20 micron. - Infondere 250-1,500 nl della soluzione iniettabile alla velocità di 2-5 nl / sec.
NOTA: Lasciare la pipetta dopo la fine dell'infusione per almeno 5 minuti in parenchima cerebrale, quindi rimuoverlo lentamente e delicatamente per evitare la soluzione di deflusso.
- Craniotomy per la finestra cranica cronica
- Praticare delicatamente e con attenzione il cranio per fare una finestra cerchio intorno al sito di lesione. Utilizzare la finestra diametro di 3-3.5 mm.
- Applicare una goccia di tampone corteccia (125 mM NaCl, KCl 5 mM, glucosio 10 mM, HEPES 10 mM, 2 mM CaCl 2 e 2 mM MgSO 4 in H 2 O distillata) per coprire il wiNdow.
- Posizionare un vetrino di vetro rotondo (# 1.5 spessore) sulla finestra cranica.
- Rimuovere l'eccesso di tampone corteccia intorno al vetrino.
- Sigillare i bordi del vetrino con colla polimetilmetacrilato (vedi Materiali e attrezzature).
NOTA: Assicurarsi che la colla non è applicato alla superficie superiore del vetrino. Se il vetro di copertura è contaminato con colla, attendere che il vetro è stabilmente incollato al cranio e la colla sulla superficie del vetro si asciuga, poi rimuovere con attenzione la colla contaminando con un MicroBlade. - Attendere 5 minuti per lasciare che la colla asciughi.
- Utilizzando le viti altezza della barra orecchio, regolare la posizione della testa in modo che il titolare del metallo può essere collocato.
- Applicare una piccola quantità di colla poliacrilico sull'anello di supporto in acciaio (vedi Materiali e attrezzature).
- Incollare l'anello di supporto in acciaio al vetrino di vetro con il manico di metallo titolare diretto all'indietro.
- Attendere 5 minuti per lasciare che la colla asciughi.
- Mix cemento dentale (vedi Materiali e attrezzature) con colla poliacrilica in una capsula di Petri 3,5 centimetri (o analogico) per ottenere condizioni viscosi.
- Sigillare i bordi della finestra cranica con la miscela + cemento colla e coprire la superficie esposta del cranio con la stessa miscela fino al confine della pelle.
- Attendere 15 minuti per consentire la miscela di cemento + colla asciughi e poi rimuovere le barre orecchio.
- Eseguire eccitazione a due fotoni microscopico (TPEM) di imaging per la regione di interesse e di una zona di controllo come descritto nel protocollo 3.
- Dopo l'imaging, permettono all'animale di riprendersi dall'anestesia su una piastra elettrica e tenerlo in un individuo gabbia sotto osservazione fino alla completa guarigione. Cibo umido può essere dato per facilitare masticazione e idratazione.
2. Brain Injury Imaging Attraverso il Assottigliato Teschio
- Anestetizzare gli animali e la preparazione del campo operatorio
- Anestetizzare il mouse e prepararlo per l'induzione traumacome descritto al punto 1.1.
- Skull assottigliamento e inflizione della lesione cazzo
- Posizionare un piccolo strumento stereotassico animale con il supporto degli animali (vedi Materiali e attrezzature).
- Regolare la posizione di un microscopio binoculare accanto allo strumento stereotassico a concentrarsi sulla superficie del cranio animale.
- Individuare il punto bregma sul cranio con il microscopio binoculare, di individuare l'area del cervello per essere ripreso in base alle coordinate stereotassica e segnare da graffi.
NOTA: Skull posizione diluizione non deve essere posizionato sopra o nelle vicinanze suture craniche, come la stabilità cranio è compromessa in quelle zone. Inoltre, le grandi navi e meningi situati sotto le suture del cranio corticali o meningea sono suscettibili di causare artefatti di imaging. - Posizionare il supporto metallico rivestito con colla sopra l'area di interesse sul cranio dell'animale, applicare una leggera pressione e attendere per 5 minuti fino a che il supporto del metallo è saldamente incollato al cranio.
- Miscelare cemento dentale (vedi Materiali e attrezzature) con colla poliacrilica in una capsula di Petri 3,5 centimetri (o analogico) per ottenere condizioni viscosi.
- Sigillare i bordi del supporto del metallo con la miscela + cemento colla e coprire la superficie esposta del cranio con la stessa miscela fino al confine della pelle.
- Attendere 15 minuti per lasciare il cemento e la miscela di colla prosciugano.
- Risciacquare regione cranio assottigliata e le parti circostanti del metallo titolare più volte con PBS, in modo che i residui di colla nonpolymerized vengono lavate via.
NOTA: E 'fondamentale garantire l'attaccamento stabile del cranio al titolare. Ciò consente la stabilità preparazione durante l'imaging. - Modalità ad alta ingrandimento del microscopio binoculare, rimuovere gli strati superiori del cranio dell'osso con un micro-trapano ad alta velocità per creare una zona assottigliata cranio di ~ 0,5-1,5 mm di diametro. Utilizzare aria compressa durante la foratura per rimuovere i detriti osso. Eseguire la perforazione intermittently durante la procedura di diradamento al fine di evitare il surriscaldamento per attrito. Raffreddare la punta utilizzando la soluzione a temperatura ambiente e periodicamente applica buffer alla zona assottigliata di assorbire calore.
NOTA: Per evitare di danneggiare la corteccia, non forare su vaste regioni (> 1,5 millimetri) fino a un sottile strato (<50 micron).
NOTA: La struttura roditore cranio ossea è costituito da due strati sottili di osso compatto separati da uno spesso strato di osso spugnoso. Piccole cavità della forma dell'osso spugnoso cerchi e canaliculi concentrici, che contengono vasi sanguigni. Utilizzare il microdrill per rimuovere sia lo strato di osso compatto esterno e la maggior parte dello strato spugnoso. Turbativa dei vasi sanguigni all'interno dell'osso spugnoso possono causare sanguinamento. Utilizzare emostasi spugna di collagene per fermare questa emorragia. - Utilizzare generazione di seconda armonica (SHG) di imaging per esaminare se la maggior parte della spongiosa è stato rimosso. Prestare attenzione per evitare un eccessivo assottigliamento, assicurarsi che l'osso residuo è ªIcker di 50 micron in questa fase della preparazione.
- Mettere una goccia di tampone caldo (35-37 ° C) al di sopra della regione assottigliata. Utilizzare una lama microchirurgica o Micro Finishing Bur per rimuovere ulteriormente gli strati ossei e formare una superficie liscia di ~ 700 micron di diametro con spessore osseo di circa 20 micron. Durante questa fase, è utile effettuare ripetitivo immagini SHG e misurare regolarmente lo spessore dell'osso.
- Effettuare l'imaging TPEM per la regione di interesse e una zona di controllo.
- Regolare la posizione della testina utilizzando le viti altezza della barra orecchio in modo tale assottigliato regione è posizionato strettamente orizzontalmente. Posizionare l'ago al di sopra della regione assottigliata e assicurarsi che non ci siano grandi navi sotto il sito di destinazione.
- Effettuare una lesione immergendo l'ago nel cervello, alla profondità di 0.5-2.0 mm dalla superficie del cranio assottigliato e secondo le coordinate del sito di applicazione puntura.
- Rimuovere l'ago e sopprimere l'emorragia che appare dopo tegli acute lesioni cerebrali con tampone emostatico (vedi Materiali e attrezzature). Attendere fino a coaguli di sangue forma e vaso di pulsazione al sito di lesione si ferma.
- Eseguire microiniezione di 100 pM solforodamina 101 o un altro composto di interesse nel sito della lesione, come sopra descritto nella sezione 1.2.10.
- Effettuare l'imaging TPEM per monitorare la progressione lesioni e ripristino come descritto nel protocollo 3.
- Dopo l'imaging, permettono all'animale di riguadagnare la coscienza dall'anestesia su una piastra elettrica. Non lasciare l'animale incustodito e tornare alla sua gabbia casa solo dopo il pieno recupero fisico.
3. Imaging
- Posto l'animale al microscopio collegando il supporto del metallo al telaio su misura.
- Per l'imaging, ad esempio, utilizzare il FV1000MPE microscopio a due fotoni dotati di Mai Tai DeepSee laser e XLPLN 25X 1,05 NA obiettivo immersione in acqua ottimizzato per in vivo a due fotoniimaging.
- Identificare il sito della lesione al microscopio a fluorescenza utilizzando la modalità a largo campo. Utilizzare filtri passa lunghi per visualizzare vascolare cerebrale e seleziona la zona di controllo secondo il modello osservato di vasi sanguigni.
- Per l'immagine del segnale di generazione di seconda armonica (SHG), sintonizzare il laser a femtosecondi per la lunghezza d'onda di 800 nm e raccolgono la luce emessa utilizzando il filtro di bypass 380-410 nm. Per l'imaging di fluorescenza, utilizzare il filtro passa banda (515-560 nm) per raccogliere la luce emessa, e le seguenti lunghezze d'onda vengono utilizzate per eccitare la fluorescenza: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Utilizzare il software FluoView per l'acquisizione delle immagini.
- Conservare le coordinate di ogni ROI per la successiva rappresentazione ripetitiva. Immagine stessa ROI nel tempo, e regolare le coordinate ogni tempo per sfruttare la sovrapposizione dell'immagine.
- Analizzare le immagini con il software appropriato (ad es. ImageJ). Ricostruzioni qui presentate sono state effettuate utilizzando il software Imaris.
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Risultati
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Discussione
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo profondamente grati al Dr. Frank Kirchhoff per la fornitura di GFAP-EGFP e ceppi di topi CX3CR1-EGFP. Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Centro di Mobilità Internazionale della Finlandia, Tekes, finlandese Graduate School of Neuroscience (FGSN) e l'Accademia di Finlandia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinzetta muta 2A-sa, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in ago | BD | REF 304000 | |
| Trimmer per animali, macchina da barba | Aesculap | Isis GT420 | |
| Microscopio binoculare | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Regolatore di temperatura biologica con termoforo in acciaio inox | Supertech | TMP-5b | |
| Lama microchirurgica smussata | BD | REF 374769 | |
| Tubo in borosilicato con filamento | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Per la produzione di pipette in vetro |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Clorexidina digluconato | Sigma | C9394 | |
| Cemento dentale | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Desametasone | FaunaPharma | Rapidexon veterinario | |
| Trapani monouso | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco' s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 pinze, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Estrattore per microelettrodi Ealing | Ealing | 50-2013 | Estrattore verticale per la produzione di pipette in vetro |
| Unguento per gli occhi | Novartis | Viscotears | |
| Foredom Drill control | Foredom | FM3545 | |
| Manipolo per micromotore Foredom | Foredom | MH-145 | |
| Piattaforma per anestesia gassosa per topi | Stoelting | 50264 | Assemblato su strumento stereotassico |
| Emostasi Collagene Spugna | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamina | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Supporto in metallo | Pinza | ||
| , 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Capillari di riempimento per micro siringhe |
| Olio minerale Microscopio | multifotone Sigma | M8410 | |
| Siringa Olympus | FV1000MPE | ||
| NanoFil 10 μ l | WPI | NANOFIL | Siringa Hamilton |
| Tamponi in tessuto non tessuto 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Tamponi chirurgici Colla |
| poliacrilica | Henkel | Loctite 401 | |
| Vetrino coprioggetto rotondo in vetro | della microscopia elettronica | ||
| spessore 1,5 | |||
| Strumento stereotassico per piccoli animali | David Kopf Instruments | 900 | |
| Adattatore per topo e ratto neonatale | Stoelting | 51625 | Assemblato su strumento stereotassico. |
| Forbici per iride da studente, dritte 11,5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Sonde molecolari | S-359 | |
| UMP3 e controller per microsiringa Micro 4 | WPI | UMP3-1 | Microiniettore e controller |
| Xilazina | Bayer Health Care | Rompun veterinario |
Riferimenti
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- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
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Ristampe e permessi
