Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato "ubiquitome" schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile.
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Articolo metodologico
siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modificazione post-traslazionale di proteine con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) sta emergendo come una rete di segnalazione cellulare dinamica che regola diverse vie biologiche, tra cui la risposta all'ipossia, proteostasis, la risposta al danno al DNA e la trascrizione. Per capire meglio come UBLs regolano i percorsi relativi alla malattia umana, abbiamo compilato una siRNA umano "ubiquitome" biblioteca composta da 1.186 siRNA piscine su due piani destinati a tutti noti e previsti componenti dei percorsi del sistema UBL. Questa libreria può essere proiettato contro una serie di linee cellulari esprimenti reporter di diverse vie biologiche per determinare i componenti UBL agiscono come regolatori positivi o negativi della via in questione. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza questa libreria per identificare ubiquitome-regolatori della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia utilizzando un reporter luciferasi basato trascrizione. Una fase di sviluppo iniziale di analisiviene eseguita per stabilire parametri di schermatura della linea cellulare prima di eseguire lo schermo in tre fasi: di screening / deconvoluzione primaria, secondaria e terziaria. L'uso di mirata su intere librerie genoma siRNA sta diventando sempre più popolare in quanto offre il vantaggio di notifica solo per i membri del percorso con cui i ricercatori sono più interessati. Nonostante i limiti intrinseci dello screening siRNA, in particolare falsi positivi causati da siRNA effetti off-target, l'identificazione di veri e propri nuovi regolatori dei percorsi in questione superano queste carenze, che possono essere superati eseguendo una serie di esperimenti di controllo con attenzione intraprese.
Introduzione
Modifica delle proteine con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) rappresenta un sistema biochimico espansiva che regola diverse vie biologiche e risposte allo stress. L'attacco covalente di UBLs alle loro proteine bersaglio può avere vari risultati che regolano la stabilità, localizzazione, funzione o interattoma del substrato 1. I passaggi enzimatici sottostanti modifica UBL sono stati stabiliti in primo luogo per ubiquitina, e ora servono come paradigma per la modifica con la maggior parte UBLs, tra cui SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Per modifica si verifichi, il gruppo carbossilato del diglycine motivo LBM viene prima attivato da un enzima ....
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Protocollo
1. Assay Fase di sviluppo
Nota: prima di iniziare la schermata siRNA, una fase di sviluppo di analisi è fondamentale per impostare i parametri importanti per lo screening con la linea cellulare giornalista. È essenziale investire sforzo significativo in questa fase, questo sosterrà il futuro successo della schermata.
- Per caratterizzare l'ipossia-reattività del U20S-HRE linea cellulare giornalista, crescere 2 x 75 cm 2 flaconi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS.
- Aspirare il supporto da un pallone di cellule, lavate due volte con....
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Risultati
Prima della proiezione, viene stabilita la ipossia-responsività delle cellule U20S-HRE. Cellule U20S-HRE esprimono un costrutto giornalista costituito da luciferasi di lucciola fuso valle di tre copie tandem dell'elemento risposta all'ipossia, che è vincolato da dell'eterodimero HIF1A/HIF1B in caso di esposizione all'ipossia (Figura 1A). Le cellule sono posti in una workstation ipossia per un intervallo di tempo per stabilire l'esposizione ipossia produce la risposta più efficace per.......
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Discussione
L'uso di genoma di ampiezza schermi siRNA in cellule di mammifero ha dimostrato di essere estremamente utile per identificare nuovi regolatori di vie biologiche distinte. Qui, abbiamo descritto l'uso di uno schermo ubiquitome siRNA targeting per identificare regolatori della risposta cellulare HIF1a mediata da ipossia. Schermi mirati stanno diventando sempre più attraente in quanto sono generalmente più economiche, più veloce, più facile da gestire e riferire solo sui componenti della via in cui gli investigator.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) e l'Istituto scozzese per la segnalazione cellulare (ora parte della proteina fosforilazione MRC e l'unità ubiquitylation).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dosatore automatico di liquidi | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Piastra per test a parete bianca | Greiner Bio One | 655083 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ | |
| Pellicola per piastre trasparenti | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| libreria di siRNA | Thermo Scientific | On-Target Plus | |
| http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ reagente di trasfezione | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Siero ridotto medio | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Riferimenti
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10....
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Ristampe e permessi
