I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.
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Articolo metodologico
MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell'RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l'uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.
Introduzione
Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l'avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all'orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non sti....
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Protocollo
1. Preparazione della Cultura Reagenti e piastre di coltura
- mTeSR1 Media: Preparare il supporto mTeSR1 secondo le istruzioni del produttore. Scongelare 100 ml di mTeSR1 5x supplemento notte a 4 ° C. Aggiungere 100 ml di mTeSR1 5x complemento a 400 ml di mTeSR1 terreni di base e mescolare bene. Questo supporto è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi.
- Differenziazione dei media: Preparare il supporto differenziazione DMEM/F12 per produrre 0.1mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2.0 mM L-glutammina, siero knockout del 10%, e 10 mg / ml di gentamicina.
- iPS-RPE supporto: preparare iPS-RPE media in MEM ced....
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Risultati
cellule iPS (Figura 1A) sono state coltivate in condizioni di differenziazione di indurre il differenziamento in cellule iPS-RPE. IPS-RPE esposto classico fenotipo RPE di esagonale morfologia cellulare pigmentato (Figura 1B) simile a RPE fetale (Figura 1C).
Per comprendere meglio il ruolo che può svolgere miRNA durante il processo di differenziazione da iPS a iPS-RPE, analisi di microarray di espressione dei miRNA è stata condotta. L'RNA.......
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Discussione
In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l'RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato rileva.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell'Esercito o il Dipartimento della Difesa.
Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l'USAISR.
Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Scienc....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni mTeSR1 + 5X integratore | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-β-mercaptoetanolo | Sigma | M-7154 | |
| Aminoacidi non essenziali | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Sostituzione del siero knockout | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 integratore | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Idrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Siero fetale bovino | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Sale sodico di triiodo-l-tironina | Sigma | T6397 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | S5881 | |
| Terreni RPE fetali Kit RTEGM | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Hyclone (Fisher) | 10010-023 | |
| Tripsina | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec tampone di lavaggio | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec tampone di risciacquo | StemGent | 130-092-222 | |
| Kit di microsfere Anti-TRA-1-60 | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec colonna di selezione cellulare | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Trituratore QIA | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Microarray di miRNA umano v16 | Agilent | G4471A |
Riferimenti
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS....
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Ristampe e permessi
