Articolo metodologico

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico

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DOI:

10.3791/51589

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24 giugno 2014

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

In questo articolo

Sommario

I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

Abstract

L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell'RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l'uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.

Introduzione

Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l'avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all'orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non stimolare una risposta immunitaria, aumentando notevolmente la probabilità di successo applicazioni terapeutiche 2-3. Sotto specifiche condizioni di coltura, le cellule iPS hanno dimostrato di differenziarsi in diversi tipi cellulari in vitro, compresi cardiomiociti, neuroni, cellule beta pancreatiche, epatociti e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) 4-12.

La RPE è uno strato specializzato di cellule epiteliali pigmentate situati nella parte posteriore della retina che svolge diverse funzioni che sono essenziali per la salute visiva e funzione come assorbimento della luce diffusa, fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, e l'elaborazione di retinoidi per la produzione di chromophore visiva. Disfunzione del RPE causa di danni o malattia colpisce profondamente la salute dei fotorecettori e la funzione visiva come testimoniano le malattie accecante che sono il risultato della sottostante patologia RPE come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la malattia di Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Trattamenti veramente efficaci che possono ripristinare la visione non sono stati raggiunti, e la sostituzione di RPE malato con sano RPE può essere l'opzione migliore per prevenire la perdita della visione 14-15. RPE derivate da iPS (iPS-RPE) è una possibile fonte di cellule per sostituire il RPE danneggiato. iPS-RPE esprime caratteristiproteine ​​RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; visualizza la classica altamente pigmentato esagonale RPE morfologia; e svolge funzioni RPE come la fagocitosi, l'elaborazione retinoidi, e la secrezione di 11 - cis 5,16 retinica. Tuttavia, prima di iPS-RPE può essere utilizzato terapeuticamente, IPS-RPE deve essere accuratamente caratterizzato. Comprensione dei fattori che regolano la differenziazione RPE è necessario per migliorare la resa e la purezza delle cellule da utilizzare per applicazioni cliniche.

La differenziazione cellulare è il risultato dell'espressione genica altamente regolato. Rimodellamento epigenetico del genoma e del coordinamento dei fattori di trascrizione sono necessari per le decisioni destino delle cellule che si verificano durante la differenziazione e lo sviluppo 17. Regolamento del messaggio RNA messaggero (mRNA), traduzione di microRNA (miRNA) presenta ancora un altro livello di regolamentazione che riguarda il destino delle cellule 1. MiRNAs sono brevi, ~ 22 nt, lunghezze di nucleotidi che sia la traduzione di soppressione dalegame al 3 'UTR del mRNA bersaglio o l'mRNA per degradazione. MiRNAs sono stati rilevati in quasi tutti i tessuti e ad oggi oltre 2.000 microRNA umani unici sono stati registrati nel database miRBase. Poiché miRNA richiedono complementarità soltanto parziale di legarsi al mRNA bersaglio, un singolo miRNA può potenzialmente legarsi a decine o centinaia di bersagli, e viceversa, cioè un singolo mRNA può essere bersaglio di diversi miRNA diversi. Questa caratteristica vincolante promiscua aumenta notevolmente il livello di complessità della regolamentazione, così come il livello di difficoltà di determinare le funzioni dei singoli miRNA e il ruolo ognuno gioca in funzioni cellulari 18-21. Tuttavia, studi hanno dimostrato che miRNA raffina genica durante il differenziamento influenzando stato di metilazione del DNA 17. In uno studio più specifico al RPE, miR-204/211 ha dimostrato di promuovere il fenotipo epiteliale della RPE 22. Un altro gruppo ha analizzato il profilo di miRNAdi RPE durante il differenziamento di cellule ES e ha rivelato insiemi distinti di miRNA sono espressi durante il processo di differenziazione 23. In realtà, i profili miRNA possono distinguere in modo inequivocabile tipi cellulari, comprese le cellule staminali, cellule precursori e cellule terminalmente differenziate 24,25. Oltre 250 miRNA sono espressi nella retina. Sulla base di questi studi, ipotizziamo che i microRNA svolgono un ruolo importante durante la differenziazione di RPE da iPS.

L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per il differenziamento di RPE da IMR90-4 cellule iPS, la raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA che sono differenzialmente espressi fra tre tipi di cellule, le cellule iPS , iPS-RPE e RPE fetale. L'RNA totale è stato estratto da colture di ogni tipo di cellula e ibridato a un microarray miRNA, contenente sonde specifiche per il 1205 miRNA umani e 144 miRNA virali. I risultati microarray sono stati confrontanod per determinare quali miRNA sono differenzialmente espressi tra i diversi tipi cellulari. miRNA con 2 volte o più fold change in espressione sono stati selezionati per ulteriore analisi. Un programma software di analisi miRNA è stato usato per identificare potenziali target dei miRNA differenzialmente espressi e generare reti cellulari regolati dai miRNA selezionati.

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Protocollo

1. Preparazione della Cultura Reagenti e piastre di coltura

  1. mTeSR1 Media: Preparare il supporto mTeSR1 secondo le istruzioni del produttore. Scongelare 100 ml di mTeSR1 5x supplemento notte a 4 ° C. Aggiungere 100 ml di mTeSR1 5x complemento a 400 ml di mTeSR1 terreni di base e mescolare bene. Questo supporto è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi.
  2. Differenziazione dei media: Preparare il supporto differenziazione DMEM/F12 per produrre 0.1mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2.0 mM L-glutammina, siero knockout del 10%, e 10 mg / ml di gentamicina.
  3. iPS-RPE supporto: preparare iPS-RPE media in MEM cedere supplemento 1x N1, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 250 mg / ml taurina, 13 ng / ml sale di sodio triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mcg / ml gentamicina, e 15% FBS 26.
  4. Soluzione madre sale sodico triiodo-L-thyronine. Per preparare soluzione madre sciogliere 1,0 mg di triiodo-L-thyroninesale di sodio in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Successivamente aggiungere 49,0 ml di mezzi di comunicazione di base per rendere 50,0 ml di 20 mg / ml di sale di sodio triiodo-L-thyronine. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale.
  5. Idrocortisone soluzione madre: Per preparare una soluzione madre idrocortisone, solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo assoluto agitando. Successivamente aggiungere 19,0 ml di mezzi di comunicazione di base per la soluzione di 20 ml di idrocortisone magazzino di 50 mg / ml. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale.
  6. Fetale crescita media RPE. Preparare i mezzi di crescita miscelando tutti i reagenti nel kit RTEGM nei media basale, secondo le istruzioni del produttore eccezione del FBS.
  7. Mezzi di placcatura RPE fetale. Preparare terreni in piastra trasferendo una piccola quantità di terreni di crescita in un contenitore sterile eFBS dd ad una concentrazione finale del 2%.
  8. Dispasi: Preparare la soluzione di lavoro del dispasi di 1 mg / ml in DMEM/F12.
  9. Matrigel rivestite con lastre: Preparare Matrigel in DMEM/F12 a 0,08 mg / ml.
  10. Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1,0 ml della soluzione di matrigel.
  11. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1,0 ore.
  12. Dopo l'incubazione 1,0 ore, aspirare il DMEM/F12 eccesso.
  13. Aggiungere 0,5 ml di media mTeSR1 per evitare l'essiccamento. Le piastre Matrigel rivestite sono ora pronti per l'uso.

2. Cultura iPS

  1. Prima della semina delle cellule iPS hanno tutti i tubi, i media caldi mTESR1 a temperatura ambiente, e le piastre Matrigel rivestite pronte.
  2. Scongelare rapidamente le cellule IMR90-4 iPS in un bagno d'acqua a 37 °. Quindi rimuovere il esageratamente dal bagnomaria e sterilizzare utilizzando 70% di etanolo.
  3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta 2 ml per minimizzare rottura di aggregati cellulari.
  4. Drop-saggio aggiungere 5 ml di warm supporti mTeSR1 alle cellule e delicatamente mescolare. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.
  5. Risospendere con attenzione gli aggregati di cellule in 2 ml di media mTeSR1 e seminare le cellule su un pozzetto di una piastra ben sei.
  6. Porre la piastra in un incubatore e la cultura 37 ° con il 5% di CO 2, 95% di umidità.
  7. Cambiare la coltura delle cellule iPS quotidiana. Colonie indifferenziati appariranno 5-7 giorni dopo la semina. Verificare la presenza di colonie indifferenziati che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso).

3. Passaging di cellule iPS

  1. Prima di iniziare a passaggio le cellule iPS, hanno tutte le provette, soluzione dispasi, DMEM/F12 e mTERS1 supporti riscaldata a temperatura ambiente, e la Matrigel rivestite piastre pronta.
  2. Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l'area e aspirare il media. Differenziazione dovrebbe rimanere inferiore al 20% del pozzo per altacolture di qualità. Sciacquare accuratamente la cella contenente bene con 2 ml DMEM/F12 iPS e aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun bene.
  3. Incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM/F12 due volte.
  4. Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di mTSER1 a ciascun pozzetto.
  5. Usando una pipetta da 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra a formare aggregati.
  6. Trasferire le colonie staccate in una provetta da 15 ml. Aggiungi mezzi mTeSR1 sufficienti per seminare il prossimo passaggio di cellule.

4. Differenziazione delle cellule iPS per iPS-RPE

  1. Piastra le cellule iPS su un piatto rivestito di recente nei media mTESR1.
  2. Lasciare colonie di cellule iPS per espandere per 4-5 giorni di coltura.
  3. Supporti di sostituzione mTeSR1 con i media di 4 ml di differenziazione. Cambiare metà dei mezzi ogni 3 giorni.
  4. Consentire foci pigmentate diventino abbastanza grandi per essere sezionato manualmente della cultura (40-50 giorni).
  5. Utilizzare un200 microlitri pipetta punta a tagliare intorno e sollevare le colonie pigmentate.
  6. Raccogliere e mettere in comune le colonie sezionato in un tubo da 15 ml.
  7. Aggiungere quindi 5 ml di DMEM/F12 alle cellule RPE pool e centrifugare a 300 xg per 5 min due volte.
  8. Preparare una soluzione singola cellula tramite l'incubazione del pool iPS-RPE con il 0,25% tripsina EDTA.
  9. Lavare le cellule iPS-RPE con i media iPS-RPE e piastra le cellule raccolte su un nuovo Matrigel rivestite bene in 4 ml di mezzi iPS-RPE.
  10. Coltivare le cellule per 3 settimane prima di passaggio. Modificare i media ogni 3 giorni. Per l'esperimento, piastra IPS-RPE a 100.000 cellule / cm 2. Raccogliere le cellule il giorno 17. Contare il giorno della semina come giorno 0.

5. Raccolta dei campioni

  1. iPS cellule Collection
    1. Cultura le cellule iPS fino colonie indifferenziati sono osservate per essere denso al centro.
    2. Sciacquare le colonie in DMEM/F12.
    3. Dissociarsi nelle singole cellule utilizzando accutas e. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12.
  2. Fetale RPE Collection
    1. Sciacquare colture cellulari fetale RPE con DMEM/F12 e dissociare nelle singole cellule utilizzando 0,25% tripsina EDTA.
    2. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12.
  3. iPS-RPE cellulare Collection
    1. Quando il iPS-RPE raggiungere passaggio 3 e il passaggio 5, raccogliere le celle Giorno 17 dopo il passaggio. Sciacquare iPS-RPE due volte in PBS e preparare una sospensione singola cella mediante incubazione con 1,0 ml di 0,25% tripsina.
    2. Neutralizzare la tripsina con 2 ml di ghiaccio freddo supporti iPS-RPE.
    3. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
    4. Risospendere la sospensione cellulare in 3 ml di tampone colorazione del kit microbead.
ve_title "> 6. Negativo Selezione del iPS-RPE per rimuovere le cellule indifferenziate

  1. Conservare tutti i reagenti a 4 ° C fino al momento dell'uso, ma non funzionano sul ghiaccio. Sospensione cellulare centrifuga dal punto 5.3.4 a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
  2. Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone colorazione del kit microbead a 2 x 10 6 cellule.
  3. Aggiungere 10 ml di anti-TRA-1-60-PE anticorpi per 2 x 10 6 cellule.
  4. Mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min.
  5. Lavare le cellule in 1-2 ml di tampone per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante.
  6. Risospendere le cellule in 80 ml ​​di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Aggiungere 20 ml di microsfere anti-PE etichettati (dal kit) per 2 x 10 6 cellule. Mescolare bene. Incubare per 15 minuti a 4 ° C.
  7. Aggiungere 1-2 ml di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante.
  8. Risospendere le cellule in 500 & #956; l di tampone di colorazione.
  9. Separazione cellulare magnetico:
    1. Mettere colonna cell sorter magnetico. Risciacquare colonna con 3 ml di tampone di colorazione.
    2. Applicare sospensione cellulare dal 6,8 su colonna.
    3. Collocare un tubo al porto negativo per raccogliere le cellule negative TRA-1-60 anni.

7. RNA totale estrazione

  1. Lisare le cellule eseguendo i campioni attraverso una colonna microcentrifuga omogeneizzatore mini giro disponibile in commercio progettato per minipreps acidi nucleici.
  2. Estrarre l'RNA totale da cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale con il kit di estrazione di RNA disponibile in commercio progettato per preservare piccole molecole di RNA 27.
  3. Determinare le concentrazioni di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.

8. Bioanalyzer e Microarray Assay

  1. Controllare l'integrità dell'RNA con Bioanalizzatore in combinazione con kit di qualità RNA disponibile in commercio.
  2. Incubare 100 ng diRNA totale con fosfatasi intestinale di vitello a 37 ° C per 30 min
  3. Denaturare l'RNA utilizzando il 100% DMSO a 100 ° C per 5 min.
  4. Etichettare i campioni con PCP-Cy3 utilizzando T4 ligasi tramite incubazione a 16 ° C per 1 ora.
  5. Ibridare su un formato 8_x_15K matrice miRNA umani.
  6. Lavare le matrici secondo le istruzioni del fabbricante e la scansione ad una risoluzione di 5 micron utilizzando uno scanner.
  7. Acquisire i dati usando la funzione microarray software di estrazione compatibili con il microarray miRNA.
  8. Elaborare i segnali miRNA per determinare il livello relativo di espressione in ogni campione.
  9. Confrontare i livelli di espressione di ciascuno miRNA tra i gruppi campione. Selezionare miRNA con espressione differenziale di almeno due volte per ulteriori analisi.
  10. Utilizzo del software disponibile in commercio per l'analisi dei dati, seguire le istruzioni per generare mappe di calore per la visualizzazione dei miRNA differenzialmente espressi 28.

9. Analisi Pathway

  1. Salvare i dati dai miRNA selezionati in 8.9 in formato Excel.
  2. Accedere al programma online di analisi di RNA percorso. Caricare il file di Excel. Selezionare "Format flessibile" per il formato di file e selezionare "Agilent" dal menu a discesa per il tipo identificativo.
  3. Alla voce dati grezzi, assegnare "ID" per sondare colonna ID e assegnare "Osservazione 1" e "rapporto log" alla colonna razione log. Selezionare "ignora" per tutte le altre colonne.
  4. Selezionare i parametri per l'analisi come segue: Fiducia: sperimentalmente osservato solo; comprendere le relazioni dirette e indirette; e comprendono prodotti chimici endogeni; Selezionare il Knowledge base Ingenuity come l'insieme di riferimento. Scegliere il database di molecole di riferimento che include i dati di tutte le specie, tutte le linee di cellule e tessuti, e tutte le mutazioni.
  5. Rete Esegui e percorso di analisi.

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Risultati

cellule iPS (Figura 1A) sono state coltivate in condizioni di differenziazione di indurre il differenziamento in cellule iPS-RPE. IPS-RPE esposto classico fenotipo RPE di esagonale morfologia cellulare pigmentato (Figura 1B) simile a RPE fetale (Figura 1C).

Per comprendere meglio il ruolo che può svolgere miRNA durante il processo di differenziazione da iPS a iPS-RPE, analisi di microarray di espressione dei miRNA è stata condotta. L'RNA...

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Discussione

In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l'RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato rileva...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell'Esercito o il Dipartimento della Difesa.

Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l'USAISR.

Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Science Center a San Antonio.

Questo lavoro è stato supportato dal US Army programma clinico di Medicina Riabilitativa Research (CRMRP) e militare Programma di Ricerca Operativa Medicina (MOMRP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreni mTeSR1 + 5X integratoreStem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-β-mercaptoetanoloSigmaM-7154
Aminoacidi non essenzialiHyclone(Fisher)SH30853.01
Sostituzione del siero knockoutLife Technologies10828-028
GentamicinaLife Technologies15750-060
MEM mediaLife Technologies10370-021
N1 integratoreSigmaN-6530-5ML
TaurinaSigmaT-8691-25G
IdrocortisoneSigmaH0888-1G
Siero fetale bovinoHyclone(Fisher)SH3008803HI
Sale sodico di triiodo-l-tironinaSigmaT6397
Idrossido di sodioSigmaS5881
Terreni RPE fetali Kit RTEGMLife Technologies195406
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Soluzione salina tamponata con fosfatoHyclone (Fisher)10010-023
TripsinaHyclone(Fisher)25200-072
Miltenyi Biotec tampone di lavaggioStemGent130-092-987
Miltenyi Biotec tampone di risciacquoStemGent130-092-222
Kit di microsfere Anti-TRA-1-60StemGent130-095-816
Miltenyi Biotec colonna di selezione cellulareStemGent130-021-101
RNeasy micro kitQiagen74004
Trituratore QIAQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip kitAgilentG2938-90046
Microarray di miRNA umano v16AgilentG4471A

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