Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.
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Articolo metodologico
Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo zebrafish è un modello importante per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigenerazione appendice. Tuttavia, le strategie molecolari di impiegare genetica inversa non sono ancora stati adeguatamente sviluppati per valutare la funzione del gene nella rigenerazione o omeostasi dei tessuti durante le fasi larvali dopo embriogenesi zebrafish, e diversi tessuti all'interno della larva zebrafish sono difficili da colpire. Iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici offrono un metodo alternativo per l'attuale incapacità di indirizzare genomically geni di zebrafish in modo controllato temporalmente in queste fasi. Questo metodo consente la completa dispersione e successiva incorporazione del morfolino in vari tessuti dell'organismo, comprese le strutture che prima erano impossibili da raggiungere come quelli nella pinna caudale larvale, una struttura spesso usato per ricercare in modo non invasivo rigenerazione tissutale. Diversi geni attivati durante la rigenerazione finfold larvale sono anche Present nella rigenerazione dei tessuti vertebrati adulti, in modo che la larva è un modello utile per capire la rigenerazione negli adulti. Questo metodo dispersione morfolino consente l'identificazione rapida e facile di geni necessari per la rigenerazione di tessuti larvali nonché altri fenomeni fisiologici che regolano l'omeostasi del tessuto dopo l'embriogenesi. Pertanto, questo metodo di consegna fornisce una strategia attualmente necessari per il controllo temporale per la valutazione della funzione genica dopo embriogenesi.
Introduzione
Rigenerazione di organi e appendici è di fondamentale importanza per la sopravvivenza e fitness; Tuttavia, alcuni vertebrati compreso l'uomo hanno limitato la capacità rigenerative. Mentre diversi modelli animali esistere che hanno ampia capacità rigenerativa, invertire tecniche genetiche per valutare la funzione del gene durante organo e la rigenerazione appendice rimangono molto limitato o inesistente. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per sezionare la biologia molecolare di rigenerazione in questi organismi modello.
Il zebrafish è un modello ben consolidato per comprendere la biologia cellulare e molecolare di organo e rigene....
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Protocollo
1. Preparazione degli aghi di vetro (Figura 1)
- Utilizzare capillari di vetro con diametro 0,75 millimetri per preparare aghi per iniezione (Figura 1A).
- Posizionare il capillare di vetro in un estrattore ago e tirare l'ago con il seguente parametro: valore del ciclo di riscaldamento: 463; tirando valore del ciclo: 230; Velocità: 150 msec; Tempo: 150 msec (Figura 1B).
- Rompere il capillare di vetro tirato con le pinzette da orologiaio per produrre un diametro ago 20 micron sotto uno stereoscopio con un micrometro.
- Utilizzare un tornio con una ruota che gira gomma bagnata per affinare l'ag....
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Risultati
Il forte, smussato ago per l'iniezione è facilmente inserito nel ventricolo cardiaco della larva zebrafish quando si avvicinò dorsale (Figura 3A). Il cuore continua a pompare e il flusso di sangue viene mantenuta nonostante la presenza dell'ago (Figure 3B e 3C). Iniezioni attente non perturbare la morfologia del ventricolo o contrazioni cardiache (Figura 3D) nonostante iniezione del morfolino nel cuore (Figura 3E).
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Discussione
L'iniezione intraventricolare fornisce un metodo di valutazione rapida e affidabile per analizzare la funzione genica nelle fasi successive di sviluppo o di omeostasi del corpo senza alterare la funzione del gene durante l'embriogenesi. Per assicurare il successo di questa tecnica, si deve essere consapevoli di quattro punti critici: 1) dimensioni dell'ago, 2) essiccazione dell'ago, 3) minimizzare il volume, e 4) tempo di esposizione minima nella soluzione sedazione. Aghi che sono troppo piccoli saranno .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), desideriamo ringraziare Ayele Tsedeke Taddese per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Morpholino con 3´ etichetta con fluoresceina | Gene Tools Inc. | Maggiori | informazioni su www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | Maggiori informazioni su www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | Per versare piastre per posizionare il pesce durante le iniezioni e l'imaging |
| Tricaina (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | Per anestesia | |
| Terreno E3 (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4) | Per l'allevamento larvale | ||
| Piastre di Petri | Sarstedt | 821.472 | Per posizionare il pesce durante le iniezioni e l'imaging |
| Capillari di vetro a parete sottile | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | Per la preparazione di aghi per iniezione |
| Punte per pipette Microloader | Eppendorf | 5,242,956,003 | Per caricare l'ago |
| Pipette Pasteur (3 ml/1 ml) | Marca | 747760/ 74775 | Per il trasferimento di larve |
| Estrattore per aghi fiammeggiante/marrone | Sutter | Maggiori informazioni su www.sutter.com | |
| Orologiaio (Dumont) Pinzette (misura 5) | World Precision Strumenti, Inc. | 501985 | Per frenare l'ago prima dell'affilatura |
| Microscopio da dissezione | Olympus, Leica, Zeiss | Varia a seconda del produttore | Parte dell'intera configurazione di iniezione |
| Fotocamera a fluorescenza | Olympus, Leica, Zeiss | Varia a seconda del produttore | Per visualizzare la fluorescenza dopo l'iniezione |
| PicoNozzle (supporto microiniettore) | World Precision Instruments | 5430-12 | Per microiniezioni |
| Pneumatic PicoPump (microiniettore) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Per microiniezioni |
Riferimenti
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6....
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Ristampe e permessi
