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Articolo metodologico

L'uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte

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DOI:

10.3791/51627

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19 giugno 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

In questo articolo

Sommario

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta> 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

Abstract

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria e la progettazione di immunoterapie. Qui si descrive l'uso della tecnologia matrice di destinazione fluorescente (FTA), che utilizza coloranti vitali come ester carbossifluoresceina succinimidyl (CFSE), laser viola coloranti eccitabili (CellTrace Violet: CTV) e laser rosso coloranti eccitabili (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) per combinatorialmente linfociti del mouse etichette in> 250 distinguibili gruppi di cellule fluorescenti. Gruppi di cellule all'interno di questi ALS possono essere pulsate con maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e MHC classe II-peptidi leganti e quindi agiscono come cellule bersaglio per CD8 + e CD4 +, rispettivamente. Queste cellule FTA rimangono vitali e pienamente funzionale, e possono quindi essere somministrati in topi per consentire la valutazione della CD8 + T uccisione cellulo-mediata delle cellule bersaglio FTA e CD4 + T hel cell-meditatap delle cellule bersaglio cellule FTA B in tempo reale in vivo mediante citometria a flusso. Da> 250 cellule bersaglio possono essere valutati in una volta, la tecnica consente di monitorare risposte delle cellule T contro diversi epitopi antigenici in diverse concentrazioni e in più replicati. Come tale, la tecnica può misurare le risposte delle cellule T sia un quantitativo (ad esempio la grandezza cumulativo della risposta) e qualitativa (ad es. Avidità funzionale e epitopo-cross reattività della risposta) livello. Qui, descriviamo come tali ALS sono costruiti e danno un esempio di come possono essere applicati per valutare le risposte delle cellule T indotta da un vaccino pox virus ricombinante.

Introduzione

Cellule T svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria adattativa e sono spesso mirati per la manipolazione in immunoterapia. Cellule T effettrici CD4 + rispondono ai antigene estraneo secernendo citochine che regolano molti aspetti di immunità e può anche aiutare direttamente le cellule B a produrre anticorpi. Cellule CD8 + T citotossici (CTL) possono anche rispondere alle antigene estraneo secernendo citochine, così come un ruolo centrale nella uccidere direttamente le cellule che esprimono un antigene estraneo. L'interazione fondamentale che avvia queste funzioni effettrici delle cellule T comporta l'interazione del recettore delle cellule T (TCR) con peptidi estere visualizzati su molecole MHC sulla superficie delle cellule. Cellule CD4 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe II sulle cellule presentanti l'antigene e cellule CD8 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe I che sono tipicamente visualizzati su cellule microbiche infetti.

Al finevalutare il ruolo delle cellule T svolgono in una risposta immunitaria, è essenziale che le loro funzioni effettrici sono misurati con tecniche affidabili e sensibili. Metodi comuni per la valutazione della risposta delle cellule T includono; MHC class-I/II/peptide tetramero reattività; produzione di citochine da ELISPOT e intracellulare di citochine colorazione; e la capacità di uccidere con 51 saggi Cr-rilascio. Questi saggi, però, vengono in genere eseguite ex vivo con la stimolazione in vitro, o forniscono informazioni limitate nella funzione delle cellule T. Idealmente, quando si misurano le risposte delle cellule T sarebbe utile per valutare in situ, in vivo in cui si verificano, senza manipolazione di cellule T in modo da evitare alterazioni dei parametri funzionali che possono verificarsi attraverso la stimolazione in vitro. Alcuni dei più comunemente usato in vivo di cellule T saggi funzionali sono basati sulla misurazione uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio pulsate con MHC di classe I peptidi leganti, che vengono enumerati in vivotramite la loro individuazione attraverso l'etichettatura fluorescente con coloranti vitali come CFSE. Anche se questi tipi di test in grado di monitorare l'uccisione CTL mediata di obiettivi quando accadono in vivo, che hanno già avuto una capacità relativamente limitata di valutare uccisione di obiettivi multipli che presentano diverse concentrazioni e diversi tipi di epitopi peptidici, che è necessario per consentire parametri qualitativi quali avidity funzionale e la variante epitopi cross-reattività da valutare. Questi test inoltre non forniscono alcuna informazione sui cellulari mediate risposte T CD4 +.

Per superare molte delle limitazioni con metodi attualmente utilizzati per valutare le risposte delle cellule T, abbiamo recentemente sviluppato un saggio multiplex basato su array fluorescenti bersaglio (ALS), che permette il controllo delle risposte delle cellule T contro> 250 cellule bersaglio contemporaneamente in un animale da citometria a flusso 1, 2. Accordi di libero scambio sono costituiti da linfociti marcati con SEVLe concentrazioni rali e combinazioni di coloranti vitali come CFSE, CTV e CPD permettendo> 250 gruppi di cellule di fluorescenza unico da generare. Poiché queste cellule rimangono vitali e completamente funzionale, possono essere iniettati in animali per consentire il monitoraggio della loro interazione con le cellule T effettrici in vivo 3. Ad esempio, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe I-binding per consentire la valutazione di antigene-specifica uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio 1. Inoltre, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe II-legame, che permetta di valutare antigene specifico per le cellule T helper (T H) L'attività valutando attivazione (mediante la valutazione dei marcatori di attivazione quali CD69, CD44 e / o CD62L) delle cellule B all'interno della zona di libero scambio recanti peptide cognate 2. Da più di 250 obiettivi possono essere rilevati simultaneamente, è possibile misurare le risposte CTL e T H contro molti gruppi di cellule bersaglio pulsate con npeptidi umerous a diverse concentrazioni e l'inclusione di molti replicati. Il test FTA prevede pertanto un livello senza precedenti di T effettrici delle cellule valutazione della risposta in vivo.

Qui si descrive in dettaglio la costruzione di un FTA e mostrare come possono essere applicati a valutare le risposte delle cellule T in vivo. La procedura descrive la costruzione di un FTA composto di 252 gruppi di cellule distinguibili attraverso l'uso di tre coloranti vitali, composti da 6 ripetizioni di 42 gruppi di cellule pulsate con MHC di classe I e II peptidi leganti. L'etichettatura dei 42 gruppi di cellule avviene in 10 ml a fondo conico tubi ed è utile per fissare questi fuori in un rack tubo, come indicato nella Tabella 1. Questo metodo può essere regolata per piccoli numeri di cluster distinguibili come richiesto riducendo la quantità di etichettatura di ciascun colorante eseguita 1.

Si evidenzia l'utilità del test, mostrando come si può misurare responses generati da ricombinante vaccinazione pox virus contro diversi epitopi in una piccola coorte di topi. Questo mostra come il test FTA può essere utilizzato per misurare le risposte cumulative e avidità funzionale attraverso, rispettivamente, l'uso di area sotto la curva (AUC) valutazioni e misurare la concentrazione di peptide efficace necessaria per generare risposte massime mezzo (EC 50).

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Protocollo

Nota: I topi utilizzati ai sensi del presente protocollo sono state gestite secondo le linee guida della Australian National University Sperimentazione animale Comitato Etico e topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale.

1. Dye e Peptide Preparazione

  1. Preparazione Dye
    Nota: I coloranti sono prediluiti a diverse concentrazioni per permettere l'etichettatura delle cellule a intensità di fluorescenza discreti. CFSE viene utilizzato a sette concentrazioni effettuate attraverso diluizioni seriali 3.5-fold, e CTV e CPD sono utilizzati in sei diverse concentrazioni effettuate attraverso diluizioni seriali 3.7-fold (vedi tabelle 2-4). Le concentrazioni di stock di coloranti elencate nelle tabelle 2-4 saranno utilizzati per etichettare le cellule bersaglio alle concentrazioni di colorante finali elencate nelle tabelle 2-4. Coloranti reagiscono in seguito all'esposizione alla soluzione acquosa. È quindi importante che i flaconi essere equilibrati a RT prima dell'apertura per minimizzare l'esposizione di coloranti a condensazione.
    1. CFSE
      Nota: CFSE viene acquistato come carboxyfluorescein diacetato succinimidil estere (CFDA, SE; MW 557,47), in genere a 25 mg / flacone.
      1. Risospendere 25 mg di CFSE in 4.48 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock 10 mM.
      2. Serie diluire CFSE: Aggiungere 35 ml di 10 mM CFSE magazzino in 87,5 ml di DMSO e ripetere questo con diluito soluzione stock di dare ad ogni concentrazione di colorante nella Tabella 3.
    2. CTV
      Nota: CTV è tipicamente acquistata in confezioni da 9 flaconcini, ognuno dei quali può essere ricostituito con 10 ml di DMSO per generare una soluzione 10 mM di colorante.
      1. Ricostituire e riunire tutti i 9 fiale di CTV con 90 ml di DMSO per dare una soluzione al 10 mm.
      2. Serie diluire CTV: Aggiungere 11 ml di 10 mM CTV magazzino in 29,7 ml di DMSO e ripetere questo con diluito soluzione stock di dare ad ogni concentrazione di colorante nella tabella 2.
    3. CPD
      Nota: CPD (792,6 MW) è tipicoly ha acquistato 0,5 mg / flacone.
      1. Risospendere 0,5 mg di CPD in 63 ml di DMSO per ottenere una soluzione di 10 mm.
      2. Serie diluire CPD: Aggiungere 11 ml di 10 mM CPD magazzino in 29,7 ml di DMSO e ripetere questo con diluito soluzione stock di dare ad ogni concentrazione di colorante in Tabella 4.
        Nota: scorte Dye possono essere conservati a -20 ° C per diversi mesi e possono essere scongelati e ricongelati più volte senza significativa perdita di funzione.
  2. Preparazione Peptide
    Nota: peptidi MHC classe I leganti sono generalmente utilizzati per impulsi cellule bersaglio a 6 concentrazioni differenti effettuate con 10 diluizioni da una concentrazione iniziale di 1 pM (Tabella 5). MHC di classe II-peptidi leganti sono generalmente utilizzati per impulsi cellule bersaglio a 6 concentrazioni differenti fatta utilizzando 3 diluizioni da una concentrazione iniziale di 400 pM (Tabella 5). Ogni peptide è effettuata a concentrazione finale 2x in PBS tale that ogni concentrazione peptide ha un volume minimo di 250 microlitri. Scorte peptidici possono essere preparati prima FTA costruzione e conservati a -20 ° C senza perdita significativa in funzione.
    1. Peptidi Preparazione magazzino MHC di classe I-binding
    2. Preparare la più alta concentrazione di ciascun epitopo peptide a 2 soluzioni micron archivi (2x 1 micron)
    3. Serie diluire MHC peptidi di classe I-binding: aggiungere 44,4 ml di soluzione di 2 stock peptide micron in 400 ml di PBS. Ripetere questa operazione con diluito soluzione stock di dare a ciascuno la concentrazione del peptide nella Tabella 5.
    4. Peptidi Preparazione magazzino MHC di classe II-binding
    5. Preparare la più alta concentrazione di ciascun epitopo peptide a 800 micron soluzioni madre (2x 400 micron).
    6. Serie diluire MHC peptidi classe II-binding: aggiungere 150 ml di soluzione di peptide 800 micron in 300 ml di PBS. Ripetere questa operazione con diluito soluzione stock di dare a ciascuno la concentrazione del peptide nella Tabella 5 .

2. FTA Preparazione

Nota: La procedura seguente descrive la costruzione di un FTA composto di cellule pulsate con 7 differenti epitopi peptidici a 6 differenti concentrazioni (cioè 42 gruppi di cellule.) Ripetuti 6 volte per generare 252 ammassi cellulari distinguibili. All'interno di ogni ripetizione, un gruppo di cellule non pulsate con qualsiasi epitopo (zero), è incluso come controllo. È utile per ALS di avere una differenza CD45 allotipo da animali ospiti per consentire loro discriminazione da cellule riceventi mediante etichettatura anticorpo al momento dell'analisi. Altrimenti ALS può essere etichettato con altri coloranti come PKH-26 per questo scopo (descritto al punto 2.6). In genere, la procedura di preparazione FTA viene eseguita dall'inizio alla fine durante una seduta.

  1. Etichetta 42, 10 ml a fondo conico tubi di plastica 1-42 (come in Tabella 1 per esempio).
  2. Preparazione delle cellule
    1. Isolare milza e / o lymphnodes da topi. Preparare sospensione singola cella da tessuti da schiacciare con un 70 micron studiato attentamente setaccio a 5 ml stantuffo della siringa e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    2. Risospendere linfociti fino a 200 x 10 6 cellule / ml in 11,5 ml di Rochester parco Memorial Institute 1640 (RPMI, o equivalente) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS). Nota: È importante usare un buffer con elevato contenuto di ammina per minimizzare la tossicità colorante cellule 3.
  3. Etichettatura CTV
    Nota: Le cellule sono inizialmente etichettati con 6 concentrazioni di CTV.
    1. Risospendere completamente le cellule invertendo la provetta diverse volte. Aggiungere 1,9 ml di sospensione cellulare per 6 dei 10 ml provette etichettate 37-42, facendo attenzione a non bagnare la metà superiore dei tubi.
    2. Per etichettare le celle con CTV, rimuovere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    3. Aggiungere 83 ml di PBS per la parte non bagnata nella parte superiore del tubo, ed a questo aggiungere 17 ml di brodo CTV (vedi TabLe 2 per la quale soluzione stock è assegnato a cui tubo). Nota: Un tubo non umidificato è importante per impedire il movimento sospensione cellulare e rapido mescolamento della soluzione cella con la soluzione colorante.
    4. Chiudere la provetta e miscelare la sospensione cellulare con il colorante rapidamente e accuratamente su vortex.
    5. Ripetere i punti 2.3.2-2.3.4 per le soluzioni stock di CTV nei tubi designati descritti nella tabella 2.
    6. Incubare le cellule per un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente (20 ° C).
  4. Etichettatura CFSE
    1. Dopo l'etichettatura CTV, aggiungere 5 ml di RPMI contenente 5% FCS in ogni provetta e accuratamente risospendere le cellule nel vortex.
      1. Dal tubo 37 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per provette 31, 25, 19, 13, 7 e 1.
      2. Dal tubo 38 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per tubi da 32, 26, 20, 14, 8, e 2.
      3. Dal tubo 39 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per provette 33, 27, 21, 15, 9, e 3.
      4. Dal tubo di 40 trasferimenti 1 ml di cellulesospensione per tubi 34, 28, 22, 16, 10 e 4.
      5. Dal tubo 41 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per provette 35, 29, 23, 17, 11, e 5.
      6. Dal tubo di 42 trasferimenti 1 ml di sospensione cellulare nei tubi 36, 30, 24, 18, 12, e 6
        Nota: Fare attenzione a non bagnare la metà superiore dei tubi durante le fasi 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Per etichettare le celle con CFSE, rimuovere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    3. Aggiungere 103 ml di PBS per la parte non bagnata nella parte superiore del tubo, e per questo aggiungere 7 ml di magazzino CFSE (vedi Tabella 3 per i quali soluzione stock è assegnato alla quale tubo).
    4. Chiudere la provetta e miscelare la sospensione cellulare con il colorante rapidamente e accuratamente su vortex.
    5. Fare passi 2.4.2-2.4.4 per le soluzioni stock di CFSE nei tubi designati descritti nella Tabella 3.
    6. Incubare le cellule per un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavare le cellule: Diluire sospensione cellulare con 9 ml di 20 ° CRPMI contenente 5% FCS, sedimento mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 20 ° C e rimuovere surnatanti per aspirazione con una pipetta di trasferimento.
  5. Peptide pulsare e lavaggio delle cellule
    Nota: Dopo che le cellule sono state etichettate con CTV e CFSE, sono pulsate con MHC di classe I e / o MHC di classe II peptidi leganti (preparati in 1.2). Una delle popolazioni cellulari non deve inoltre pulsate con il peptide (ad es. Nil in tabella 1) e utilizzati come controllo negativo per il calcolo di risposte delle cellule T.
    1. Peptide pulsare
      1. Risospendere le cellule in un volume totale di 250 ml di RPMI contenente 5% FCS. Nota: tipico 50 ml di sospensione cellulare rimane dopo l'aspirazione del supernatante alla fine dello step 2.4.7, quindi aggiungere 200 ml di mezzo alla cella pellet.
      2. Aggiungere 250 ml di scorte peptidici pre preparati (come in tabella 5) per i tubi designato adeguatamente (come in tabella 1) ed essere sure di inserire un tubo di controllo di PBS aggiunto da soli senza peptide come controllo Nil.
      3. Mescolare sospensioni cellulari con un vortice. Nota: è fondamentale che ciascun epitopo peptide e ciascuna concentrazione peptide è assegnato ad un unico tubo e questo registrato chiaramente basato sulla fluorescenza previsto delle cellule in questo tubo, dopo la firma fluorescenza di questo cluster definirà questo peptide (come in Tabella 1 per esempio).
      4. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora.
    2. Lavaggio delle cellule
      1. Aggiungere 5 ml di ghiaccio freddo (4 ° C) RPMI contenente 5% FCS alla sospensione cellulare e risospendere le cellule invertendo tubo. Underlay cautela la sospensione cellulare con 3 ml di ghiaccio freddo (4 ° C) FCS.
      2. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Utilizzare lenta accelerazione e frenata per assicurare l'interfaccia di FCS e la soluzione sospensione cellulare viene mantenuta.
      3. Aspirare con cautela il RPMI e poile FCS con una pipetta di trasferimento, lasciando i pellet cellulari lavati indisturbati. Nota: L'uso di un sottofondo FCS per lavare le cellule contribuisce ad assicurare soluzione peptide tanto viene rimosso dalle cellule possibile e limitando in tal modo l'esposizione di popolazioni cellulari a più peptidi liberi quando le cellule sono raggruppati.
      4. Lavare nuovamente celle: Risospendere il pellet di cellule in 10 ml di 4 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Versare off surnatanti.
      5. Piscina tutte le popolazioni cellulari in un singolo tubo con una pipetta con 6 ml di 4 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimenti cellule pool mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta di trasferimento.
  6. Etichettatura delle cellule CPD
    Nota: A questo punto sei repliche di analisi intra possono essere generati dalle cellule pulsate etichettatura peptide con 6 diverse concentrazioni di CPD.
    1. Aggiungere 11,4 ml di 20 ° CRPMI contenente 5% FCS al pellet riunite e risospendere accuratamente con una pipetta.
    2. Aggiungere 1,9 ml di sospensione cellulare a 6, 10 ml provette etichettate AF, facendo attenzione a non bagnare la metà superiore dei tubi.
    3. Per etichettare le celle con CPD, rimuovere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    4. Aggiungere 92 ml di PBS per la parte non bagnata nella parte superiore del tubo, e per questa azione stock CPD (vedere Tabella 4 per la quantità di soluzione assegnato a ciascun tubo).
    5. Chiudere la provetta e miscelare la sospensione cellulare con il colorante rapidamente e accuratamente su vortex.
    6. Sei passi. 2.6.3-2.6.5 per le soluzioni stock di CPD nei tubi designati descritti nella Tabella 4 Nota: A differenza di CFSE e CTV, la concentrazione di etichettatura CPD non è proprio linearmente correlata con l'intensità di fluorescenza risultante di cellule marcate, e così la concentrazione etichettatura utilizzata avere picchi fluorescenti equidistanti di diverse popolazioni etichettati statodeterminati empiricamente (cfr. tabella 4).
    7. Incubare le cellule per un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente (20 ° C).
    8. Lavare le cellule due volte: Risospendere le cellule a 10 ml con 20 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta di trasferimento. Ripeti.
    9. Pool tutte le celle in un singolo tubo con 8 ml 4 ° C RPMI contenente 5% FCS con una pipetta. Sedimenti cellule pool mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il sopranatante con una pipetta di trasferimento.
  7. (Facoltativo) PKH-26 etichettatura cellulare
    Nota: Se ALS non può essere costruita con cellule che esprimono una differenza allotipici CD45 per ospitare topi, possono essere etichettati con PKH-26 per consentire loro discriminazione da cellule riceventi.
    1. Aggiungere 2,9 ml di 20 ° C PBS al pellet pooled e risospendere accuratamente con una pipetta.
    2. Aggiungi sospensione cellulare a un non bagnata 10 ml di tubo, facendo attenzione a non bagnare la metà superiore del tubo.
    3. Togliere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    4. Aggiungere 58 ml di diluente C (nel kit colorante PKH-26) alla parte non bagnata nella parte superiore del tubo, e per questo aggiungere 42 ml di 1 mM magazzino PKH-26.
    5. Tappare la provetta e mescolare soluzione di cellule con il colorante accuratamente vortex.
    6. Incubare le cellule per un minimo di 10 min a temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavare le cellule due volte: Risospendere le cellule a 10 ml con 20 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta di trasferimento. Ripeti.
  8. Iniezione di accordi di libero scambio in animali ospiti
    Nota: Per misurare le risposte delle cellule T in vivo, ALS sono iniettati in animali che hanno una risposta immunitaria attiva e lasciato in situ per un massimo di 24 ore. E 'fondamentale che i TLC sono iniettati in animali naive come controllo negativo.
    1. Contare e risospendere le cellule a 2,5 x 10 8 cellule per ml in PBS. Iniettare 200 ml di cellule per via endovenosa in topi ospitanti, tra cui un animale naif come controllo.

3. Citometria a Flusso

  1. 18-24 ore dopo l'iniezione FTA raccolta sangue o milza (o di altri tessuti di interesse) da topi ospitanti.
  2. Preparare sospensione singola cella da tessuti da schiacciare con un 70 micron pori setaccio a 5 ml stantuffo della siringa.
  3. Risospendere le cellule fino a 65 x 10 6 cellule / ml in PBS contenente 0,1% di BSA.
  4. Distribuire aliquote di 100 microlitri di sospensione cellulare nei pozzetti di una micropiastra per l'etichettatura anticorpo.
  5. Celle di etichette con fluorocromo etichettato anticorpi e sonde fluorescenti vitalità con fluorescenza spettralmente compatibile con CFSE, CTV e CPD. Nota: Anticorpi per B marcatori cellulari come B220 e marcatori di attivazione come CD69 sono essenziali per misurare l'attivazione delle cellule B se si utilizza il FTUn misurare le risposte delle cellule T H 2. Includere un anticorpo CD45.1 e / o CD45.2 se gli accordi di libero scambio e topi ospitanti hanno una differenza allotipici CD45.
  6. Aggiungere 100 ml di soluzione madre 2x di coloranti anticorpi / vitalità (in PBS contenente 0,1% BSA) per aliquote di 100 microlitri di cellule, mescolare bene e incubare in ghiaccio (4 ° C) per 30 min.
  7. Lavare le cellule: cellule sedimento mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS contenente 0,1% BSA, cellule sedimento mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  8. Risospendere le cellule in un volume totale di 400 microlitri di PBS contenente 0,1% BSA, celle filtranti attraverso una maglia di 70 micron e analisi mediante citometria a flusso in un citometro di flusso in grado di rilevare i coloranti e coniugati fluorescenti pertinenti. Raccogliere fino a 3 x 10 6 eventi linfociti al fine di risolvere ogni cluster di cellule FTA e di ottenere cellule sufficienti per statistianalisi cal. Nota: Assicurarsi che tutti i controlli tipici (come i controlli colorate singoli) per citometria a flusso sono impiegati. Tipicamente, CFSE richiede eccitazione da una sorgente laser blu (tipicamente a 488 nm) e di rilevamento con filtri passa banda centrato su 520 nm; CTV richiede eccitazione da una sorgente laser violetto (tipicamente a 405 nm) e di rilevamento con filtri passa banda centrato su 450 nm; e CPD richiede eccitazione da una sorgente laser rosso (tipicamente a 633 nm o 640 nm) e di rilevamento con filtri passa banda centrato su 670 nm.

4. Analisi dei dati

  1. Analizzare citometria a flusso di dati utilizzando software standard citometria a flusso (vedi risultato rappresentativo per un esempio del tipo di strategia di gating occupati).
  2. Per il% uccisione specifica, calcolare il numero di cellule in ogni cluster di cellule FTA pulsate con peptidi MHC di classe I-binding ei cluster FTA che non sono stati peptide impulsi ("Nil") e utilizzando la seguente formula per calcolare% Uccidere specifico.
    % Uccidere specifica figure-protocol-1
    Nota: Nella formula precedente "innescato" si riferisce agli obiettivi da animali che si pensa di avere una risposta immunitaria contro i peptidi di destinazione, "ingenuo" si riferisce agli obiettivi da animali naïve, "peptide" si riferisce agli obiettivi pulsate con peptidi e "zero" si riferisce a obiettivi non pulsate con qualsiasi peptidi.
  3. Per l'attivazione delle cellule B come misura dell'attività T H, calcolare la media geometrica intensità di fluorescenza (GMFI) di CD69 anticorpo fluorescenza su cellule FTA B pulsate con peptidi MHC di classe II-binding in animali "innescato" e da questo sottrarre la GMFI di espressione di CD69 sulle celle corrispondenti FTA Breakfast animali "naive" per dare una misura di attività T H.
  4. Dalle statistiche generate nelle fasi 4.2 e 4.3, l'usosoftware di calcolo matematico, come GraphPad Prism per calcolare altri parametri quantitativi e qualitativi, come l'area sotto la curva e EC 50 (una descrizione dettagliata di come questi calcoli vengono eseguiti per l'AUC possono essere trovate all'indirizzo
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, e EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Risultati

Come esempio dell'uso del test FTA, un topo BALB / c è stato immunizzato con il virus vaccinia ricombinante (VV) esprimere epitopi di HIV-I (VV-HIV) e le risposte alle epitopi di HIV-I CTL, Gag, mut Gag, Env e Pol, il VV CTL epitopi F2L e F2L mut, e l'epitopo cellule HIV-I T H, Gag Th (come descritto al punto 2), sono stati valutati utilizzando un parametro di 252 FTA test (Figura 1B). Varianti epitopo Gag (mut Gag) e F2L (F2L MUT) non sono espressi nel vettore VV-HIV e qui...

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Discussione

Il vantaggio di saggi basati FTA è che permettono la discriminazione di> 250 popolazioni di cellule bersaglio valida e perfettamente funzionante da un unico animale ospite mediante citometria a flusso. Questo fornisce un livello di complessità vivo flusso saggi in base citometria a che non è stato possibile prima. Ciò è evidenziato nei due esperimenti sugli animali indicati sopra, dove le risposte alle 7 epitopi virali distinte a 6 concentrazioni potrebbero essere monitorati in replicati di 6 contem...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto Sovvenzioni # 1010395 (BQ e CP) e # 525431 (CR), e un programma di sovvenzioni # 455395 (CP) dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche in Australia, un Centro australiano per l'epatite e HIV Virologia EOI 2012 borsa di studio (CR e RJJ) e una sovvenzione da parte del Bootes Fondazione Gordon e Gretel (BQ e CR). Desideriamo ringraziare Harpreet Vohra e Michael Devoy per la loro eccellente mantenimento del laboratorio JCSMR FACS, Facility australiano Cancer Research Foundation Biomolecolare Resource, JCSMR, ANU, per la sintesi peptidica, e il Dr. David Boyle, CSIRO Laboratories Salute animale, Geelong, Australia per fornire le madri HIV scorte di vaccini.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMISigmaR8758
Siero fetale di vitelloSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 viola brillante 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
CentrifugaEppendorf
Citometro a flusso (Fortessa o equivalente con sorgente laser blu, rossa e viola)BD Bioscience

Riferimenti

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

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