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Articolo metodologico

DNA-RNA combinato fluorescente

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DOI:

10.3791/51628

⸱

14 giugno 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

In questo articolo

Sommario

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.

Abstract

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica molecolare che consente il rilevamento di acidi nucleici nelle cellule. FISH DNA è spesso usato in citogenetica e diagnostica del cancro, e può rilevare aberrazioni del genoma, che spesso ha importanti implicazioni cliniche. RNA FISH può essere utilizzato per rilevare molecole di RNA in cellule e ha fornito spunti importanti nella regolazione dell'espressione genica. La combinazione di DNA e RNA FISH all'interno della stessa cellula è tecnicamente impegnativo, in quanto le condizioni adatte per FISH DNA potrebbe essere troppo duro per i fragili, molecole di RNA a singolo filamento. Riportiamo un protocollo facilmente applicabile, che consente, rilevazione simultanea combinata di Xist RNA e DNA codificato dai cromosomi X. Questo protocollo FISH DNA-RNA combinato può probabilmente essere applicata ad altri sistemi in cui sia RNA e DNA devono essere rilevata.

Introduzione

Studiando cellule e tessuti mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH) ha, sin dalla sua introduzione nel tardo 1970 1, ha permesso ai ricercatori di studiare i geni, l'organizzazione della cromatina e l'espressione genica a livello subcellulare. FISH DNA è spesso usato in citogenetica, cariotipo 2, diagnostica oncologica 3 e pre-impianto screening genetico 4, ed ha un ruolo importante nella ricerca molecolare 5-6 in quanto permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo. Singolo analisi di espressione cella RNA FISH in grado di rilevare trascritti primari autoctone ed RNA non codificanti essere trascritto da cromosomi, e offre vantaggi ad altre tecniche che valutano l'espressione genica a livello di popolazione, tra cui ad esempio RT-PCR quantitativa, genoma vasta analisi di espressione o Northern blotting . Visualizzando trascritti di RNA provenienti direttamente dai loro luoghi di origine, è stato per esempionotato che l'espressione genica è stocastico 7, e può a volte essere allele specifico 8. Miglioramenti nella tecnica hanno anche permesso l'individuazione e la quantificazione di molecole di mRNA singoli all'interno delle cellule 9-11.

Il principio di base della FISH consiste di ibridazione di acidi nucleici all'interno della cella a una sonda di acido nucleico mediante altamente specifico Watson e Crick base-accoppiamento. La sonda può essere direttamente o indirettamente rilevato, risultando in un segnale che può essere visualizzata microscopicamente. I tentativi iniziali consistevano di sonde marcati radioattivamente, che aveva inconvenienti basato su questioni di sicurezza, la risoluzione spaziale limitata e la capacità di rilevare solo un obiettivo alla volta 12-14. Il successivo sviluppo di marchi non radioattivi, tra cui fluorocromi, apteni, ed enzimi, ha permesso l'uso diffuso di pesce come una tecnica di biologia molecolare di routine. La sonda FISH può o essere etichettato direttamente con fluorochRomes collegando chimica delle molecole fluorescenti di acido nucleico sequenze 15 e l'integrazione dei nucleotidi fluorescente 16-19, o la sonda può essere indirettamente visualizzate dopo integrazione di apteni (compresi biotina e digossigenina) e rivelazione immunologica di apteni da anticorpi specifici coniugati con aptene reporter fluorescente molecole 20-21. Quest'ultimo approccio permette l'amplificazione del segnale utilizzando diversi strati di fluorescente anticorpi che vengono utilizzati per migliorare il segnale originale, e consente il rilevamento di specie di RNA che sono espressi a livelli bassi. Combinando tecniche di etichettatura diretti e indiretti e vari apteni, diversi obiettivi possono essere contemporaneamente visualizzati all'interno della stessa cella.

Uno dei passi più importanti nei protocolli di pesce è l'ibridazione della sonda al suo obiettivo. Sebbene in teoria, una sonda verrà specificatamente legarsi solo al suo bersaglio, in pratica, questa specificitànon è sempre raggiunto, come sonde possono legarsi a regioni omologhe, e condizioni di ibridazione non sempre ideale per una certa regione di DNA o RNA specie. Lavaggi post-ibridazione sono quindi di particolare importanza, in quanto possono aumentare la severità della procedura FISH, e possono impedire il legame non specifico di sonde FISH, che porterebbe a un elevato livello di rumore di fondo. Come molecole di RNA sono a singolo filamento che possano essere facilmente ibridate ad una sonda FISH. Al contrario, la molecola di DNA a doppio filamento deve prima una fase di denaturazione, dopo che una sonda può ibridare. Ciò viene ottenuto mediante riscaldamento del campione, che provoca la denaturazione del DNA. Tuttavia, in queste condizioni difficili, fragili molecole di RNA a singolo filamento potrebbero essere persi. Pertanto, DNA-RNA combinato FISH richiede significativa ottimizzazione delle condizioni, ed è tecnicamente più difficile rispetto alla rilevazione separata di soli RNA o DNA.

Qui Presenta protocollo dettagliato della produzione combinata e simultanea FISH DNA-RNA che ci ha permesso di studiare inattivazione del cromosoma X (XCI) nella differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo femmina 22-24. XCI è un meccanismo epigenetico cruciale per lo sviluppo embrionale femmina 25, e si traduce in heterochromatinization e quindi silenziamento di uno dei due cromosomi X in individui femmina 26-27. Essenziale per questo processo è l'RNA non codificante Xist 28-30, che è regolata dalle RNF12 22-23 e Rex1 24 proteine. Espressione Xist diventa sovraregolati sul futuro cromosoma X inattivo (Xi) durante lo sviluppo embrionale o sulla differenziazione delle cellule ES in vitro , e può diffondersi lungo il cromosoma X e, quindi, ottenere il rimodellamento della cromatina enzimi che provocano l'arresto della trascrizione del cromosoma X 31. Questa diffusione di Xist RNA possono essere visualizzati da RNA FISH come rivestimento di X cromoalcuni, che è indicato anche come una nube Xist. Dal momento che le cellule staminali femminili possono perdere uno dei loro cromosomi X a causa di instabilità genomica, noi ed altri abbiamo impiegato combinato DNA-RNA FISH a studiare XCI, fare in modo che le cellule solo karyotypically stabili sono valutati nell'analisi di questo importante processo 22,32 -34. Come per ogni tecnica di biologia molecolare, diversi protocolli diversi eccellenti sono stati pubblicati 35-38. Presentiamo qui il nostro metodo, partendo dalla induzione del differenziamento in cellule ES di topo, fissazione delle cellule, etichettatura di sonde FISH di Nick-traduzione, pretrattamento di cellule fissate per consentire permeabilizzazione e conseguente assorbimento sonda, l'ibridazione della sonda al bersaglio, e infine il rilevamento della sonda fluorescente anticorpi. Il protocollo qui presentato permette la rilevazione fedeli di Xist RNA e il cromosoma X entro due giorni, e le basi di questa tecnica può probabilmente essere adattata per oti suoi sistemi e settori di ricerca.

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Protocollo

1. Induzione del differenziamento in cellule staminali embrionali femminile per indurre inattivazione del cromosoma X

NOTA: le cellule staminali embrionali di topo femmina (disponibili su richiesta) sono cresciuti in condizioni di celle standard ES su piastre di coltura gelatinizzati rivestiti con fibroblasti embrionali di topo (MEF). Siamo qui per scontato che il lettore abbia familiarità con le tecniche standard di coltura cellulare 39-41. Per indurre il differenziamento, le cellule staminali coltivate in piatti T25 saranno separati dal MEF, e saranno piastrate in medium di differenziazione.

  1. Rimuovere ES terreno dalla coltura di cellule ES, e lavare due volte con PBS coltura cellulare.
  2. Aggiungere 1,5 ml di tripsina-EDTA (preriscaldata a 37 ° C), e incubare le cellule a 37 ° C per 7 minuti. Dopo 3,5 minuti, agitare delicatamente il piatto per rompere le colonie.
  3. Inattivare la tripsina-EDTA aggiungendo 3,5 ml di terreno di differenziamento delle cellule. Cellule pipette su e giù per ottenere una soluzione singola cella, e raccoglierein una provetta da 15 ml. Spin per 5 minuti a 200 xg, e raccogliere le cellule in 10 ml di terreno di differenziamento.
  4. Aggiungere sospensione cellulare in un piatto di coltura non-gelatinizzato, e incubare per 1 ora in un incubatore di coltura cellulare. NOTA: MEF saranno in grado di aderire al piatto di coltura non-gelatinizzato, mentre le cellule ES rimarranno in sospensione.
  5. Nel frattempo, aggiungere vetrini sterilizzati (24 x 24 mm) a 6 pozzetti, aggiungere 0,2% di gelatina, e incubare per minimo 5 min a temperatura ambiente.
  6. Dopo 1 ora, raccogliere il surnatante della coltura di cellule ES pre-plated, che sarà principalmente costituito da non-aderenti cellule ES. Piatto cellule ES a 6-pozzetti contenenti lamelle. NOTA: L'uso ⅙ th di un piatto confluenti T25 per 6 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. Ciò consentirà una differenziazione confluenti e dopo 3 giorni di differenziamento. Modificare medio su base giornaliera. Per lunghi corsi a tempo differenziazione, piatto pre-plated cellule staminali embrionali in terreno di differenziamento in piatti batteriche, e incubmangiato su un agitatore cella integrata nella incubatore di coltura cellulare. Questo permetterà le cellule formano corpi embrionali, che può essere placcato al coprioggetto 1-2 giorni prima del fissaggio.

2. Fissazione delle cellule differenziate ES per la successiva DNA-RNA FISH Analysis

  1. Rimuovere il terreno di differenziamento da colture di differenziazione, e lavare due volte con coltura cellulare PBS. NOTA: Aggiungi attenzione PBS per impedire alle cellule di essere spazzati via.
  2. Rimuovere coltura cellulare PBS e fissare cellule aggiungendo 4% paraformaldeide (PFA) / PBS e incubare per 10 min a temperatura ambiente. ATTENZIONE: PFA è tossico e può causare notevoli rischi per la salute quando viene inalato o quando è in contatto con la pelle o gli occhi. Inoltre, PFA è cancerogeno.
  3. Rimuovere 4% PFA / PBS, e lavare coprioggetto 3x con il 70% di etanolo. NOTA: il lavaggio corretto è importante, come ogni traccia di PFA interferisce con le successive fasi di pesce. Coprioggetto possono essere memorizzati in 70% di etanolo a -20 ° C per diversi mesi prima FAnalisi ISH.

3. Etichettatura di sonde di DNA per gli esperimenti PESCE

NOTA: Ottenere un frammento di DNA del gene di interesse (lunghezza minima> 2 kb per RNA FISH, o> 20 kb per FISH DNA), o un tasso alcolemico che copre il gene di interesse. Per il rilevamento di RNA, una sonda più piccola può essere sufficiente rispetto alla rilevazione del DNA, poiché molto probabilmente trascrizione darà luogo a più trascritti, che possono essere rilevati simultaneamente. Per un segnale forte sul filamento singolo di DNA copia, è necessaria una sonda più lunga, per essere in grado di rilevare un numero sufficiente di apteni incorporati. Preferibilmente, una regione genomica non trascritto è scelto per progettare la sonda di DNA. Inoltre, quando si utilizza una sonda più piccola per rilevare l'RNA, si impedirà che l'loci genomici da cui l'RNA viene trascritto viene rilevato nell'approccio FISH DNA-RNA combinato, anche se questo non può essere completamente escluso. Per rilevare topo Xist, è stata utilizzata una sonda di cDNA di 5,5 kb. Per detezione del cromosoma X, possono essere utilizzate diverse sonde BAC. Buoni risultati sono stati ottenuti con una miscela di BAC RP23-100E1 e BAC CT7-474E4, che si trovano in prossimità del locus Xist. A seconda del gene o cromosoma di interesse, più sonde differenti potrebbero essere necessari per ottenere risultati ottimali. Ogni volta che si lavora con materiali che saranno utilizzati per l'RNA-FISH, utilizzare punte sterili filtri, RNasi libero H 2 O, e lavorare in un ambiente pulito.

  1. Prendere 1 mg di DNA e diluire in H 2 O in un volume totale di 16 microlitri. Aggiungere 4 ml di digoxigenin o soluzione di etichettatura biotina (vedi reagenti), mescolare nel vortex e incubare a 16 ° C per 90 min. NOTA: La biotina o nucleotidi digossigenina saranno ora inseriti da nick-translation.
  2. Nel frattempo, preparare le colonne G50 per rimuovere i nucleotidi non-integrati. Prendete una siringa da 2 ml, togliere la matrice, e aggiungere il cotone sterilizzato nella siringa. Aggiungere palle G50 in soluzione to riempire la siringa, posizionare siringa in una provetta da 15 ml e centrifugare a 642 xg per 1 min. NOTA: Circa l'80% della siringa dovrebbe ora essere riempito con G50. Ripetere quando meno G50 è presente.
  3. Dopo 90 minuti, aggiungere 40 ml di H 2 O alla miscela di reazione nick-translation, e aggiungere la reazione alla colonna G50. Aggiungere un tubo vuoto nella colonna, e centrifugare a 642 xg per 2 minuti. Raccogliere il flusso attraverso un tubo di reazione.
  4. Misurare il volume del flusso attraverso con una pipetta e aggiungere H 2 O per raggiungere un volume totale di 200 microlitri. Precipitare il flusso attraverso l'aggiunta di 13,3 ml di DNA di sperma di salmone (10 mg / ml), 13,3 microlitri tRNA di lievito (10 mg / ml), 26,7 microlitri topo Cot-1 DNA (1 mg / ml) e 28 microlitri 2 M NaAc, pH 5.6. Mescolare nel vortex, e aggiungere 533 ml di ghiaccio freddo al 100% di etanolo. Agitare la provetta e centrifugare a 16.200 xg per 30 min a 4 ° C.
  5. Rimuovere il surnatante, e lavare pellet due volte con etanolo al 70%. Centrifugare a 16.200 xg per 5 min a4 ° C, e asciugare il pellet. Aggiungere 50 ml di soluzione al 50 + ibridazione, e incubare a 37 ° C per 30 min per facilitare dissoluzione. NOTA: etichetta sonda può essere conservato per diversi anni a -20 ° C. ATTENZIONE: 50 + soluzione di ibridazione contenente formammide, che è tossico, può irritare la pelle, gli occhi e l'apparato respiratorio, ed è anche un teratogeno.

4. Permeabilization, pre-trattamento e ibridazione di cellule fissate per Combined DNA-RNA FISH

  1. Reidratare cellule fissate su vetrini, rimuovendo il 70% di etanolo e l'aggiunta della coltura cellulare PBS alle piastre a 6 pozzetti. Incubare per 5 min. Ripetere in totale tre volte.
  2. Rimuovere coltura cellulare PBS e aggiungere 0,2% pepsina alle piastre da 6 pozzetti, per permeabilize le cellule. Incubare le piastre a 6 pozzetti in un bagno d'acqua a 37 ° C per 4 min. Rimuovere pepsina e inattivare con RNAsi libera H 2 O.
  3. Cellule post-fix di incubazione con il 4% PFA / PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo fixatisu, lavare due volte con PBS coltura cellulare per 5 min.
  4. Disidratare incubando le cellule con etanolo al 70% per 3 min, 90% di etanolo per 3 min e 100% etanolo per 3 min. Trasferimento coprioggetto su piastre da 6 pozzetti e coprioggetto secco aria per diversi minuti.
  5. Età cellule di incubazione vetrini a 65 ° C per 1 ora su un piatto caldo.
  6. Pre-ibridare sonda FISH con il mouse Cot-1 DNA sommando per ogni vetrino da analizzare, 25 ml di soluzione di 50 + ibridazione, 0,5 microlitri del mouse Cot-1 DNA, 1 ml di sonda Xist biotina marcata e 1 ml di digossigenina sonda BAC marcata rilevare il cromosoma X. Mescolare nel vortex e denaturare a 99 ° C per 5 min. Incubare immediatamente a 37 ° C per 45 minuti, per consentire Cot-1 DNA per ibridare ripetere sequenze presenti nelle sonde.
  7. Dopo l'invecchiamento, individuare 50 microlitri di tampone di denaturazione (comprensivi di 70% formamide/2x tampone fosfato SSC/10 mM) su un vetrino e coprioggetto mettere in cima con cellule rivolto towards buffer denaturazione. Incubare a 65 ° C per 2 min.
  8. Aggiungi coprioggetto torna alla 6 pozzetti e cellule post-fix incubando in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 5 min.
  9. Disidratare cellule da successiva incubazione in etanolo al 70% per 3 min, 90% di etanolo per 3 min e 100% etanolo per 3 min. Rimuovere il coprioggetto da 6 pozzetti e lasciare asciugare per alcuni minuti.
  10. Spot sonda pre-ibridato su un vetrino, e incubare coprioggetto sulla parte superiore. Posizionare i vetrini in una camera umidificata riempita con 50 ml 50% formamide/2x SSC, e incubare una notte a 37 ° C.

5. Lavaggi post-ibridazione e anticorpi Mediated Rilevamento di sonda

  1. Fill 6 pozzetti con 2x SSC, e pre-riscaldare fino a 42 ° C. Aggiungere coprioggetto dopo incubazione notturna, e incubare a 42 ° C per 5 min.
  2. Rimuovere 2x SSC, e incubare coprioggetto con il 50% formamide/2x SSC per 10 minuti a 42 ° C. Ripetere in totale 3 volte (30 min di lavaggio del tutto).
  3. Rimuovere 50% formamide/2x SSC, e lavare i vetrini con Tris-salino-Tween (TST) da 2 x 5 min a temperatura ambiente.
  4. Spot 50 ml Tris-salino-BSA (TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per bloccare durante 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata.
  5. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  6. Spot 50 ml di anticorpi di pecora anti-dig (1:500 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare coprioggetto upside-down per la prima fase di incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata.
  7. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  8. Spot 50 ml di coniglio anti-pecora anticorpo coniugato con FITC (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per la seconda fase di incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata .
  9. Transfer coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  10. Spot 50 ml di anticorpi di capra anti-coniglio coniugato con FITC (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per la terza fase di incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata .
  11. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  12. Spot 50 ml di topo anti-biotina anticorpi (1:200 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare lamelle a testa in giù per la quarta fase di incubazione durante 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata.
  13. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  14. Spot 50 ml di anticorpi asino-anti-topo coniugati con rodamina (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare lamelle a testa in giù per la quinta fase di incubazione durante 30 minuti a temperatura ambiente in un chamb scuro TST-umidificataER.
  15. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST.
  16. Spot 50 ml di anticorpi di capra anti-cavallo coniugata con Rhodamine (1:250 in TSBSA) per vetrino sui nuovi vetrini e incubare vetrini a testa in giù per la sesta fase di incubazione durante 30 minuti a temperatura ambiente in una camera oscura TST-umidificata . NOTA: l'anticorpo di capra anti-cavallo riconoscerà l'anticorpo asino-anti-topo; quando a disposizione del ricercatore, un anticorpo di capra anti-donkey funzionerà pure.
  17. Trasferimento coprioggetto torna a 6 pozzetti e lavare per 2 x 5 minuti con TST. Lavare ulteriore 5 min con Tris-salino (TS).
  18. Disidratare cellule da successiva incubazione in etanolo al 70% per 3 min, 90% di etanolo per 3 min e 100% etanolo per 3 min. Rimuovere il coprioggetto da 6 pozzetti e lasciare asciugare per alcuni minuti.
  19. Identifica una goccia di mezzo di montaggio con DAPI (vedi reagenti) su un vetrino e aggiungere coprioggetto a testa in giù in cima. Sigillare i vetrini con smalto evalutare i risultati FISH mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1).

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Risultati

Utilizzando il protocollo di cui sopra per il combinato DNA-RNA FISH, siamo stati in grado di visualizzare inattivazione del cromosoma X nella differenziazione delle cellule staminali embrionali femminili. Figura 1 mostra un esempio rappresentativo di un esperimento FISH DNA-RNA, dove abbiamo rilevato sia Xist (che è visibile come un cosiddetto Xist RNA nube sul cromosoma X inattivo e un puntino trascrizione basale sul cromosoma X attivo), e una regione del cromosoma X, che è visibile ...

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Discussione

Combinato DNA-RNA pesce può essere tecnicamente impegnativo, in quanto le condizioni adatte per FISH DNA può essere troppo duro per le molecole di RNA meno stabili. Diversi approcci sono stati applicati per studiare sia DNA e RNA nella stessa cella, aggirando la necessità di incubazione simultanea con sonde rilevando sia il DNA e RNA. Ad esempio, in un approccio di sovrapposizione, viene eseguita prima FISH RNA, e le cellule vengono esposte, e le coordinate sono prese. Successivamente, gli stessi vetrini verranno usati ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano tutti i membri precedenti e presenti del dipartimento di Riproduzione e Sviluppo dell'Erasmus MC per le discussioni utili e stimolanti durante gli anni passati. Vogliamo anche ringraziare i tre revisori anonimi per aver fornito un feedback utile. Il lavoro nel laboratorio di Gribnau è sostenuto da finanziamenti del Consiglio olandese per la ricerca (NWO-VICI) e da una sovvenzione iniziale del CER.

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Materiali

Le cellule embrionali di di differenziazione cellulare Gelatina 780882 sterilizzato30120086 di ibridazione in autoclave soluzione di salina laboratori con fluorescente per smalto per
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
staminali embrionali femmina di toposaranno rese disponibili su richiesta
I fibroblastitopo possono essere derivati da embrioni E13.5 o tramite fonti commerciali ad esempio
terrenodi coltura cellulare Millipore ESDMEM, 15% siero fetale di vitello, 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina, aminoacidi non essenziali, 0,1 mM γ-mercaptoetanolo e 1.000 U/ml LIF. Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
Siero fetale di vitelloInvitrogen10099141
Penicillina... streptomicina (100x)Invitrogen15140-122
Aminoacidi non essenzialiInvitrogen11140-050
γ-mercaptoetanoloSigma-AldrichM7522
ES terrenoIMDM-Glutamax, 15% siero fetale di vitello inattivato termicamente, 100 U/ml penicillina, 100 mg/ml streptomicina, aminoacidi non essenziali, 37,8 μ l/L monotioglicerolo e 50 μ g/ml acido ascorbico
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
Acido ascorbico (50 mg/ml)Sigma-AldrichA4403
monotiogliceroloSigma-AldrichM6145
T25 piastre per colture cellulariGreiner Bio-one690160
piastre per colture cellulari a 6 pozzettiGreiner Bio-one662160
grado per colture cellulari PBSSigma-AldrichD8537
Tripsina-EDTA 0,25% (v/v) tripsina/0,2% (p/v) EDTA in PBSGibco25200-056
Provette Falcon Falcon352196
vetrini coprioggetti 24 x 24 mmMenzle
Sigma-AldrichG1890-100Gpreparare una soluzione PBS per gelatina/coltura cellulare allo 0,2% e sterilizzare in autoclave
PepsinaSigma-AldrichP7000Diluire allo 0,2% in 0,01 M HCl (pH 2,0)
etanolo assoluto al 100%Sigma-Aldrich32221-2,5Lutilizza acqua priva di etanolo al 100% assoluto e RNAsi per produrre soluzioni prive di etanolo al 70% e al 90%
Acqua priva di RNAsiBaxterTKF7114
puntali filtranti steriliRainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
Kit per la marcatura della digossigenina (traduzione DIG-Nick)Roche11745816910
kit per la marcatura della biotina (traduzione Biotin Nick)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
Siringa da 2 mlBD Plastipak300013
cotone
Eppendorf tubiEppendorf
lievito tRNA 10 mg/mlInvitrogen15401-029
Salmone Sperma DNA 10 mg/mlInvitrogen15632-011
topo-culla-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen18440-016
Eppendorf microcentrifuga da bancoEppendorfModello 5417R
Eppendorf centrifuga refrigerataEppendorfModello 5810R
2 M NaAc, pH 5,6Sigma-AldrichS7670
50+ soluzione50% formammide, 2x SSC, 50 mM tampone fosfato pH 7, destrano solfato 10%
pH 7 formammideAcros organics3272350000
destrano solfatoFluka31403
10 mM tampone fosfato, pH 7aggiungere 57,7 ml di 1 M Na2HPO4 e 42,3 ml 1 M NaH2PO4; utilizzare acqua trattata con DEPC e tampone
di denaturazione70% formammide/2x SSC/10 mM tampone fosfato pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7.5 soluzione
lavaggio Tris-saline-Tween (TST)100 ml 10x soluzione salina, 50 ml 2M Tris, 500 μ l Tween-20, aggiungere acqua priva di RNAsi fino a 1 L
10x soluzionesciogliere 85 g di NaCl in 1 L di RNAsi libera di H2O e autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 μ l 10x soluzione salina, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml privo di RNAsi H2O
BSA, purificato, 100xNew England BiolabsB9001S
anticorpo pecora-anti-digRoche diagnosticsRoche utilizza 1:500 diluito in TSBSA
coniglio-anti-pecora anticorpo coniugato con FITCJackson labsutilizza 1:250 diluito in TSBSA
capra-anti-coniglio anticorpo coniugato con FITCJackson iutilizzano 1:250 diluito nell'anticorpo TSBSA
topo anti-biotinaRoche diagnosticsutilizza 1:200 diluito in TSBSA
anticorpo asino-anti-topo coniugato con rodaminaJackson i laboratori utilizzano1:250 diluito in TSBSA
anticorpo capra-anti-cavallo coniugato con RhodamineJackson i laboratori utilizzano1:250 diluito in TSBSA
Tris-soluzione salina soluzione di lavaggio (TS)10 ml di soluzione fisiologica, 5 ml di Tris 2 M, 85 ml di supporto di montaggio Vectashield privo di RNAsi H2O
miscroscopio
unghie
DAPIVectorlabsH-1200

Riferimenti

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
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  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
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