Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.
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Articolo metodologico
DNA-RNA combinato fluorescente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica molecolare che consente il rilevamento di acidi nucleici nelle cellule. FISH DNA è spesso usato in citogenetica e diagnostica del cancro, e può rilevare aberrazioni del genoma, che spesso ha importanti implicazioni cliniche. RNA FISH può essere utilizzato per rilevare molecole di RNA in cellule e ha fornito spunti importanti nella regolazione dell'espressione genica. La combinazione di DNA e RNA FISH all'interno della stessa cellula è tecnicamente impegnativo, in quanto le condizioni adatte per FISH DNA potrebbe essere troppo duro per i fragili, molecole di RNA a singolo filamento. Riportiamo un protocollo facilmente applicabile, che consente, rilevazione simultanea combinata di Xist RNA e DNA codificato dai cromosomi X. Questo protocollo FISH DNA-RNA combinato può probabilmente essere applicata ad altri sistemi in cui sia RNA e DNA devono essere rilevata.
Introduzione
Studiando cellule e tessuti mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH) ha, sin dalla sua introduzione nel tardo 1970 1, ha permesso ai ricercatori di studiare i geni, l'organizzazione della cromatina e l'espressione genica a livello subcellulare. FISH DNA è spesso usato in citogenetica, cariotipo 2, diagnostica oncologica 3 e pre-impianto screening genetico 4, ed ha un ruolo importante nella ricerca molecolare 5-6 in quanto permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo. Singolo analisi di espressione cella RNA FISH in grado di rilevare trascritti primari autoctone ed RN....
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Protocollo
1. Induzione del differenziamento in cellule staminali embrionali femminile per indurre inattivazione del cromosoma X
NOTA: le cellule staminali embrionali di topo femmina (disponibili su richiesta) sono cresciuti in condizioni di celle standard ES su piastre di coltura gelatinizzati rivestiti con fibroblasti embrionali di topo (MEF). Siamo qui per scontato che il lettore abbia familiarità con le tecniche standard di coltura cellulare 39-41. Per indurre il differenziamento, le cellule staminali coltivate in piatti T25 saranno separati dal MEF, e saranno piastrate in medium di differenziazione.
- Rimuovere ES terreno da....
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Risultati
Utilizzando il protocollo di cui sopra per il combinato DNA-RNA FISH, siamo stati in grado di visualizzare inattivazione del cromosoma X nella differenziazione delle cellule staminali embrionali femminili. Figura 1 mostra un esempio rappresentativo di un esperimento FISH DNA-RNA, dove abbiamo rilevato sia Xist (che è visibile come un cosiddetto Xist RNA nube sul cromosoma X inattivo e un puntino trascrizione basale sul cromosoma X attivo), e una regione del cromosoma X, che è visibile .......
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Discussione
Combinato DNA-RNA pesce può essere tecnicamente impegnativo, in quanto le condizioni adatte per FISH DNA può essere troppo duro per le molecole di RNA meno stabili. Diversi approcci sono stati applicati per studiare sia DNA e RNA nella stessa cella, aggirando la necessità di incubazione simultanea con sonde rilevando sia il DNA e RNA. Ad esempio, in un approccio di sovrapposizione, viene eseguita prima FISH RNA, e le cellule vengono esposte, e le coordinate sono prese. Successivamente, gli stessi vetrini verranno usati .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano tutti i membri precedenti e presenti del dipartimento di Riproduzione e Sviluppo dell'Erasmus MC per le discussioni utili e stimolanti durante gli anni passati. Vogliamo anche ringraziare i tre revisori anonimi per aver fornito un feedback utile. Il lavoro nel laboratorio di Gribnau è sostenuto da finanziamenti del Consiglio olandese per la ricerca (NWO-VICI) e da una sovvenzione iniziale del CER.
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Materiali
Le cellule embrionali di di differenziazione cellulare Gelatina 780882 sterilizzato30120086 di ibridazione in autoclave soluzione di salina laboratori con fluorescente per smalto per
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| staminali embrionali femmina di topo | saranno rese disponibili su richiesta | ||
| I fibroblasti | topo possono essere derivati da embrioni E13.5 o tramite fonti commerciali ad esempio | ||
| terreno | di coltura cellulare Millipore ESDMEM, 15% siero fetale di vitello, 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina, aminoacidi non essenziali, 0,1 mM γ-mercaptoetanolo e 1.000 U/ml LIF. Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Siero fetale di vitello | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillina... streptomicina (100x) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Aminoacidi non essenziali | Invitrogen | 11140-050 | |
| γ-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES terreno | IMDM-Glutamax, 15% siero fetale di vitello inattivato termicamente, 100 U/ml penicillina, 100 mg/ml streptomicina, aminoacidi non essenziali, 37,8 μ l/L monotioglicerolo e 50 μ g/ml acido ascorbico | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Acido ascorbico (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monotioglicerolo | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 piastre per colture cellulari | Greiner Bio-one | 690160 | |
| piastre per colture cellulari a 6 pozzetti | Greiner Bio-one | 662160 | |
| grado per colture cellulari PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% (v/v) tripsina/0,2% (p/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| Provette Falcon Falcon | 352196 | ||
| vetrini coprioggetti 24 x 24 mm | Menzle | ||
| Sigma-Aldrich | G1890-100G | preparare una soluzione PBS per gelatina/coltura cellulare allo 0,2% e sterilizzare in autoclave | |
| Pepsina | Sigma-Aldrich | P7000 | Diluire allo 0,2% in 0,01 M HCl (pH 2,0) |
| etanolo assoluto al 100% | Sigma-Aldrich | 32221-2,5L | utilizza acqua priva di etanolo al 100% assoluto e RNAsi per produrre soluzioni prive di etanolo al 70% e al 90% |
| Acqua priva di RNAsi | Baxter | TKF7114 | |
| puntali filtranti sterili | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| Kit per la marcatura della digossigenina (traduzione DIG-Nick) | Roche | 11745816910 | |
| kit per la marcatura della biotina (traduzione Biotin Nick) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| Siringa da 2 ml | BD Plastipak | 300013 | |
| cotone | |||
| Eppendorf tubi | Eppendorf | ||
| lievito tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmone Sperma DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| topo-culla-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| Eppendorf microcentrifuga da banco | Eppendorf | Modello 5417R | |
| Eppendorf centrifuga refrigerata | Eppendorf | Modello 5810R | |
| 2 M NaAc, pH 5,6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ soluzione | 50% formammide, 2x SSC, 50 mM tampone fosfato pH 7, destrano solfato 10% | ||
| pH 7 formammide | Acros organics | 3272350000 | |
| destrano solfato | Fluka | 31403 | |
| 10 mM tampone fosfato, pH 7 | aggiungere 57,7 ml di 1 M Na2HPO4 e 42,3 ml 1 M NaH2PO4; utilizzare acqua trattata con DEPC e tampone | ||
| di denaturazione | 70% formammide/2x SSC/10 mM tampone fosfato pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2 M Tris pH 7.5 soluzione | |||
| lavaggio Tris-saline-Tween (TST) | 100 ml 10x soluzione salina, 50 ml 2M Tris, 500 μ l Tween-20, aggiungere acqua priva di RNAsi fino a 1 L | ||
| 10x soluzione | sciogliere 85 g di NaCl in 1 L di RNAsi libera di H2O e autoclave | ||
| Tris-saline-BSA (TSBSA) | 500 μ l 10x soluzione salina, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml privo di RNAsi H2O | ||
| BSA, purificato, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| anticorpo pecora-anti-dig | Roche diagnostics | Roche utilizza 1:500 diluito in TSBSA | |
| coniglio-anti-pecora anticorpo coniugato con FITC | Jackson labs | utilizza 1:250 diluito in TSBSA | |
| capra-anti-coniglio anticorpo coniugato con FITC | Jackson i | utilizzano 1:250 diluito nell'anticorpo TSBSA | |
| topo anti-biotina | Roche diagnostics | utilizza 1:200 diluito in TSBSA | |
| anticorpo asino-anti-topo coniugato con rodamina | Jackson i laboratori utilizzano | 1:250 diluito in TSBSA | |
| anticorpo capra-anti-cavallo coniugato con Rhodamine | Jackson i laboratori utilizzano | 1:250 diluito in TSBSA | |
| Tris-soluzione salina soluzione di lavaggio (TS) | 10 ml di soluzione fisiologica, 5 ml di Tris 2 M, 85 ml di supporto di montaggio Vectashield privo di RNAsi H2O | ||
| miscroscopio | |||
| unghie | |||
| DAPI | Vectorlabs | H-1200 |
Riferimenti
- Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
- Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62
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Ristampe e permessi
