Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Sommario

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Abstract

Varicella zoster (VZV) è una causa importante di morbilità e mortalità dopo trapianto di sangue del cordone ombelicale (UCBT). Per questo motivo, la profilassi antierpetico è amministrato sistematicamente ai destinatari UCBT pediatrici per evitare complicazioni associate con infezione VZV, ma non vi è un consenso prove basate forte che definisce la sua durata ottimale. Poiché cellule T mediata è responsabile del controllo di infezione VZV, valutare la ricostituzione di VZV specifiche risposte delle cellule T seguente UCBT potrebbe fornire indicazioni sul fatto profilassi possono essere mantenute o possono essere sospesi. A tal fine, un VZV specifico interferone gamma (IFN-γ) immunospot enzimatico (ELISpot) saggio è stata sviluppata per caratterizzare la produzione di IFN-γ da linfociti T in risposta alla stimolazione in vitro con vaccino vivo attenuato irradiato VZV. Questa analisi fornisce una misurazione rapida, riproducibile e sensibile di VZV specifico cell immunità adatto per monitorare la ricostituzione del VZV dell'immunità specifica in ambito clinico e di valutare la risposta immunitaria agli antigeni VZV mediata.

Introduzione

La prima volta nel 1989 UCBT è sempre più utilizzato come parte del trattamento di vari disturbi del sangue neoplastiche e non neoplastiche in bambini ^1. VZV è un alphaherpesvirus umana citopatico che provoca due malattie diverse, varicella (dopo l'infezione primaria) e dell'herpes zoster (dopo la riattivazione). Dopo l'infezione primaria, VZV persiste per tutta la vita dell'ospite riparata entro nervi sensoriali del gangli spinali. Una delle complicanze infettive più minacciosi seguenti UCBT è associato con VZV ^2-4. Nel nostro centro clinico, in assenza di VZV la profilassi, l'incidenza cumulativa di malattia VZV malattia da....

Protocollo

Questo protocollo di ricerca è stato approvato dal Consiglio di CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, dove è stato condotto lo studio Istituzionale valutazione etica. Il consenso informato è stato chiesto e ottenuto da tutti i partecipanti allo studio, i loro genitori o tutori legali. Tutte le procedure eseguite nei giorni 1 e 2 devono essere eseguite in condizioni sterili (cioè sotto una cappa a flusso laminare). Procedure di sicurezza standard per il trattamento del sangue umano devono essere rigorosamente rispettate.

1. Rivestimento delle piastre

1. Permeabilize il difluoruro di polivinilidene (PVDF) membrane i....

Risultati

Il protocollo ELISpot IFN-γ sopra descritto è stato sviluppato ed ottimizzato nel nostro laboratorio per misurare l'entità e la qualità delle cellule risposte immunitarie mediate dirette contro VZV ^4. Diverse fonti di antigene VZV possono essere utilizzati per la fase di stimolazione. Questi includono: a) disponibile in commercio dei detergenti estratti inattivati ​​da VZV infettate cellule Vero ^18; b) le piscine di sovrapposizione peptidi sintetici da specifiche proteine ​​codificate VZV, comp.......

Discussione

Modifiche e risoluzione di problemi: saggi IFN-γ ELISpot sono stati utilizzati per esaminare le risposte immunitarie mediate da cellule contro una varietà di patogeni microbici, inclusi tipo virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) ^24,25, virus dell'epatite C (HCV) ^{26, 27,} e Mycobacterium tuberculosis ^28,29, solo per citarne alcuni. Qui abbiamo descritto lo sviluppo di un ELISpot test IFN-γ per misurare l'immunità cellulare contro, con la speranza di definire corr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta Leucocep	VWR	89048-936/89048-932	provette da 12 ml o 50 ml possono essere utilizzate a seconda del volume di sangue.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Proteggere dalla luce.
Benzonasi nucleasi	Novagen	70746-3	Mantenere a -20 °C.
MultiScreenHTS-IP Piastra filtrante	Millipore	MSIPS4W10	sterile con dimensione dei pori di 0,45 &,micro;m.
Mouse anti-umano IFN-γ catturare l'anticorpo	BD Biosciences	551221	clone NIB42.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolvere il contenuto di una fiala in 40 μ l di DMSO. Utilizzare entro 6 mesi.
Anticorpo monoclonale coniugato con biotina anti-IFN-&gamma	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina	Bio-Rad Life Science	170-3554	Diluire per l'uso lo stesso giorno.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protegge dalla luce.