Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

Summary

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Abstract

Il modello di zebrafish è emerso come un sistema rilevante per studiare lo sviluppo del rene, la rigenerazione e la malattia. Entrambi i reni zebrafish embrionali e adulte sono composti da unità funzionali noti come nefroni, che sono altamente conservati con altri vertebrati, compresi i mammiferi. La ricerca in zebrafish ha recentemente dimostrato che due fenomeni distinti trasparire dopo nefroni adulti subiscono danni: in primo luogo, vi è la rigenerazione robusto all'interno di nefroni esistenti che sostituisce le cellule epiteliali del tubulo distrutte; secondo, completamente nuovi nefroni sono prodotte da progenitori renali in un processo noto come neonephrogenesis. Al contrario, gli esseri umani e altri mammiferi sembrano avere solo una limitata capacità di rigenerazione epiteliale nefrone. Ad oggi, i meccanismi responsabili di questi fenomeni di rigenerazione del rene rimangono poco conosciute. Dal momento che i reni zebrafish adulti subiscono sia la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis, forniscono un eccezionale para sperimentaleparadigma per studiare questi eventi. Inoltre, vi è una vasta gamma di strumenti genetici e farmacologici disponibili nel modello zebrafish che possono essere utilizzati per delineare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la rigenerazione renale. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive un insieme di tecniche di etichettatura che possono essere utilizzati per misurare la composizione e la funzionalità renale prova nefrone nel rene zebrafish adulto. Così, questi metodi sono ampiamente applicabili per il futuro caratterizzazione fenotipica di Zebrafish adulti paradigmi danno renale, che comprendono, ma non sono limitati a, i regimi di esposizione nephrotoxicant o metodi genetici di morte delle cellule bersaglio, quali il nitroreduttasi mediata tecnica di ablazione delle cellule. Inoltre, questi metodi potrebbero essere utilizzati per studiare perturbazioni genetiche in formazione rene adulto e potrebbero essere applicate anche per valutare lo stato renale durante la modellazione delle malattie croniche.

Introduction

Il rene è un organo complesso che svolge una moltitudine di funzioni fisiologiche del corpo. La funzione più importante del rene è metabolica escrezione dei rifiuti, e questo compito è strettamente intrecciata con il mantenimento dell'omeostasi fluido. Il rene svolge questi posti di lavoro filtrando il sangue e la formazione di urine, mentre in concomitanza regolazione della pressione sanguigna, livelli di elettroliti e dell'equilibrio acido-base. Tubuli altamente specializzati epiteliali chiamate nefroni servono come unità funzionale di base del rene ^1,2. Nei vertebrati adulti, nefroni sono in genere organizzati in una disposizione strettamente avvolto intorno un sistema di drenaggio centralizzato, permettendo così per molti tubuli per il confezionamento in abbastanza piccolo organo. Ad esempio, ogni rene umano può contenere oltre 1 milione di nefroni ^3. Altri mammiferi come il mouse possiedono su ordine di 8-10.000 nefroni al rene ^4. Il grado di complessità renale differisce tra questi mammiferi e altri vertebrates dovute a variazioni nel numero totale nefrone e la loro disposizione architettonica all'interno del rene. Specie di vertebrati formano ben tre strutture renali successivi durante lo sviluppo, ed ogni forma display crescente complessità per quanto riguarda nefrone dotazione e disposizione: le pronephros, mesonefro, e metanefro. L'ultima struttura renale da conservare serve come il rene adulto organo-tipicamente un mesonefro o un metanefro ^2. Ogni forma di rene, tuttavia, ha una composizione basata ^nefrone-2.

Il nefrone è il cavallo di battaglia del rene ed è responsabile per la filtrazione del sangue insieme con la secrezione metabolita e riassorbimento. Nefroni sono semplici strutture tubolari composti da cellule epiteliali e hanno una organizzazione segmentale, in cui discreti, domini altamente specializzati di epiteli differenziati eseguire compiti specifici. In ordine di flusso filtrato attraverso il nefrone, ci sono in genere tre parti principali che comprise ogni unità: (1) il corpuscolo renale, (2) un tubulo prossimale con, intermedio, e segmenti distali, e (3) un condotto di raccolta ^1. Il tubulo prossimale è responsabile del riassorbimento di soluti organici, più in particolare glucosio e aminoacidi ^1. Il tubulo intermedio (o di Henle) è un importante sito di sale e acqua regolazione ^1. Infine, la messa a punto di sale e di altri ioni avviene nel tubulo distale e dotto collettore ed è altamente regolato dal sistema endocrino ^1. Da lì, il filtrato viaggia attraverso l'uretere e vescica, in definitiva uscita dal corpo come prodotto di scarto ^1.

La perdita di funzione renale può derivare da una moltitudine di cause che impediscono la normale attività nefrone. Queste cause possono verificarsi durante lo sviluppo del rene, ad esempio, i difetti congeniti che portano alla malformazione di nefroni ^5, o cause di diversi tipi di danni (derivanti sia da genetica e environmeorigini ntale). Lesioni acquisite sono ampiamente classificati come lesione acuta del rene (AKI) o danno renale cronica (CKD). AKI comporta una perdita improvvisa della funzione renale, spesso derivanti da ischemia o tossina esposizione ^6,7. Nei mammiferi, la riparazione epiteliale nefrone è possibile dopo tali lesioni ^8, e molte persone presentano pieno ripristino della funzione renale dopo AKI. Tuttavia, AKI è anche associata ad alta morbilità e mortalità che sono stati riportati in un ampio 30 - 70% Intervallo di incidenza ^6,7. CKD, al contrario, è associata con perdita progressiva della funzione renale che deriva da anni di danni prolungato, tipicamente associata a fibrosi ^8,9. Inoltre, esiste un'interazione tra AKI e CKD, sia come si può predisporre un individuo all'altro ^10-12. Per esempio, coloro che hanno sofferto di AKI sono più suscettibili di CKD e anche la morte ^13. L'incidenza della malattia renale, sia negli Stati Uniti e nel mondo, ha raggiunto epideproporzioni microfono e si prevede un aumento come la popolazione di età compresa tra espande, quindi non vi è una crescente necessità di individuare interventi di medicina rigenerativa per il rene ^14,15.

Nonostante la consapevolezza che i pazienti AKI possono recuperare, è stato a lungo pensato che il rene è un organo senza innati poteri rigenerativi. Questo punto di vista tradizionale è stato notevolmente modificato negli ultimi anni ^16. Gli studi che indagano danno renale nei topi e nei ratti dopo AKI hanno dimostrato che le cellule epiteliali del tubulo del nefrone possono proliferare e ricostruire nefroni funzionali ^17-20. Anche se i mammiferi possiedono questa capacità di adattamento di rigenerare nefroni, ci sono notevoli limitazioni e le risposte disadattivi possono essere innescate che portano alla fibrosi renale e CKD ^21. Ad esempio, un recente studio ha dimostrato che la ripetuta ablazione delle cellule epiteliali in nefroni murini è stato associato con rigenerazione diminuita e nefroni fibrosi renale suggerendo-HAVEA limitata soglia di rigenerazione ^22. Non ci sono prove che l'adulto rene mammiferi forma nuovi nefroni per sostituire quelli persi o danneggiati, così la loro distruzione porta ad un deficit permanente nefrone ^8,9. È interessante notare che alcuni vertebrati rispondono a AKI rigenerando nefrone epiteli e producendo anche nuovi nefroni, un processo denominato neonephrogenesis o nefrone neogenesi ^23. Neonephrogenesis avviene nei pesci dopo l'esposizione ad una tossina o resezione parziale, e modelli di pregiudizio hanno storicamente incluso il pesce rosso ^24,25, tilapia ^26, pattino ^27, Medaka ^28, e, più recentemente, il pesce zebra ^29,30. Di questi, zebrafish fornire un modello di ricerca genetica praticabile per scoprire le vie cellulari e molecolari responsabili della rigenerazione renale.

In questo articolo il video, dimostriamo come etichettare i segmenti del nefrone in zebrafish adulto. Conoscenze di anatomia nefrone, caratteristiche molecolari,e caratteristiche funzionali sono essenziali per gli studi renali futuro di successo utilizzando zebrafish. Il rene zebrafish adulto è una struttura mesonefro ed è intrinsecamente meno complessa in termini di numero nefrone e di organizzazione che la struttura metanefro trovati in mammiferi adulti, avians, e rettili ^31. Tuttavia, zebrafish organizzazione segmento nefrone è analogo ai mammiferi, ed è stata la prima volta nel rene embrionale sulla base di studi di espressione genica ^31-35. Nefroni zebrafish contengono segmenti lineari tubulari che includono il tubulo contorto prossimale (PCT), tubulo prossimale dritto (PST), distale precoce (DE), e distale tardi (DL) ^31-35 (Figura 1). Nefroni Zebrafish adulti in possesso di segmenti tubolari simili ^30,31,36,37 (Figura 1). La PCT può essere identificato anche da un fenotipo funzionale: le cellule epiteliali del PCT incorporeranno composti destrano fluorescente (10-70 kDa dimensioni) presenti nelcircolazione, che è stato utilizzato sia nella zebrafish rene embrionale ed adulto per valutare l'assorbimento endocitica da queste cellule del tubulo prossimale ^38-41 (Figura 1). Una differenza nel nefrone tra zebrafish e mammiferi è che zebrafish mancano di un tubulo intermedio, o di Henle ^30-37; dal momento che questo funzioni segmento nei mammiferi per conservare l'acqua, e zebrafish sono una specie di acqua dolce, senza l'urgenza di concentrare l'urina, non è sorprendente che zebrafish manca questo segmento ^32,33. Pertanto, la composizione complessiva nefrone è in gran parte conservata tra il pesce zebra e reni mammiferi ^32,33. Queste somiglianze hanno permesso zebrafish ad essere uno strumento di ricerca efficace per studiare le funzioni dei geni-renale espressa nel corso nefrogenesi sviluppo ^32-35,42 e modellare numerose malattie renali ^43,44, aggiungendo così alla lista sostanziale di condizioni umane che possono essere indagato utilizzandozebrafish ^45,46.

Oggi, il rene zebrafish adulto è un modello attraente per gli studi comparativi di rigenerazione renale a causa della sua trattabilità genetica e il palato espansione delle risorse tecnologiche disponibili per interrogare la funzione del gene e vie di segnalazione in questa specie. Diversi studi hanno utilizzato i mesonefro zebrafish per studiare i meccanismi di rigenerazione dopo AKI ^29,30,37. Per la continua ricerca AKI utilizzando il rene zebrafish adulto, è essenziale disporre di metodi squisiti per etichettare diverse regioni e metodi nefrone per esaminare la funzionalità nefrone. Diversi metodi di analisi rene adulto sono stati adattati dai protocolli renali embrionali. Iniezione intraperitoneale di destrano fluorescente etichettati in zebrafish adulto etichette l'epitelio PCT in mesonefro nefroni via endocitosi ^30, come in embrioni di zebrafish ^38-41 (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato per visualize quando tubuli prossimali riacquistano le loro proprietà riassorbire seguente AKI, che consente una valutazione della funzione fisiologica restaurato ³⁰ (Figura 1). Un'altra caratteristica del nefrone tubulo prossimale è che le cellule epiteliali in questo segmento in possesso di un bordo spazzola ³⁷ che mostra alti livelli di fosfatasi alcalina endogena. Così, l'epitelio prossimale può essere localizzato visivamente nel rene adulto zebrafish utilizzando una tecnica a fluorescenza conosciuta come Elf (marcato con enzima Fluorescence) -97 ^47.

Qui, descriviamo come eseguire fluorescenti test di assorbimento di destrano ^30,48 nell'adulto rene zebrafish, in modo da ottenere una valutazione funzionale del tubulo prossimale e mappare le dimensioni e contorni di questo segmento tubulo. Avanti, descriviamo le tecniche di etichettare le regioni del tubulo prossimale del nefrone adulto con la fosfatasi alcalina etichetta fluorescente. In terzo luogo, si mostra per la prima volta che la rhodammina tag lectina Dolichos biflorus agglutinina (DBA), che è stato utilizzato come marcatore generale dei collettori nel rene dei mammiferi ^49, segna i tubuli distali del rene adulto zebrafish. Come DBA è mutuamente esclusivo di fosfatasi alcalina colorazione, queste etichette forniscono un modo per distinguere ampiamente pan-prossimale rispetto tratti pan-distali del nefrone zebrafish adulto. Durante l'attuazione di tali macchie fluorescenti sia in tutto il monte e sezioni istologiche al criostato, mettiamo in relazione queste etichette con i domini di espressione di geni soluto trasportatore che identificano in modo univoco ciascun segmento nefrone. Quindi questo protocollo contiene anche una guida per le procedure di trattamento dei tessuti modificati per tessuti adulti montare tutto ibridazione in situ (WISH) analisi sulla base della nostra embrione protocollo WISH ^50. Tali procedure possono essere utilizzate in varie combinazioni (Figura 2) per documentare caratteristiche morfologiche e funzionali of adulti nefroni renali zebrafish. Così, questi protocolli possono essere applicati a studi di rigenerazione, la caratterizzazione fenotipica di altri modelli di malattia renale, e anche usati per studiare la formazione del rene adulto.

Protocol

Le procedure per lavorare con zebrafish descritto in questo protocollo sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università di Notre Dame. Nota: Una guida per rene e nefrone anatomia del pesce zebra è previsto (Figura 1). Una panoramica delle metodologie descritte in questo protocollo viene fornito come un diagramma di flusso (Figura 2) per illustrare come le procedure di etichettatura multipli possono essere eseguiti sullo stesso campione di rene. Per la Parte 7 sulla preparazione WISH per gli studi renali adulte, i passaggi qui fornite indicano come modificare il trattamento di embrioni di zebrafish, come recentemente pubblicato ^50, per fornire una guida tecnica per il successo analisi WISH dell'organo rene.

1 Zebrafish adulti intraperitoneale Iniezione con Destrano di interesse

1. Preparare il destrano fluorescente magazzino (s) desiderato sciogliendo la polvere destrano in acqua distillata ad una concentrazionedi 50 mg / ml, quindi memorizzare aliquote in provette da microcentrifuga a -20 ° C al buio. Nota: Vari destrani fluorescente sono disponibili in commercio. Selezionare il destrano per l'uso in base alla combinazione di altre etichette che sono voluti, e assicurarsi che i filtri fluorescenti appropriati sono disponibili con i microscopi che verranno utilizzati. Destrani Lisina-risolvibile mostrano fluorescenza senza ulteriori passaggi di etichettatura di campioni di vita, campione di tessuto slegato da campioni eutanasia, e campioni fissati.
2. Scongelare il destrano magazzino desiderato e memorizzare sul ghiaccio al buio durante l'esecuzione di passi 1.3-1.5. Avvolgere la provetta con un foglio d'alluminio per proteggerlo dalla luce durante la manipolazione.
3. Anestetizzare un zebrafish adulto tra i 5-7 mesi di età, ponendo il pesce in un piatto contenente sia 0,02% tricaine o 0,001% 2-fenossietanolo per circa 1 - 2 min. Nota: E 'preferibile utilizzare zebrafish adulti di questa fascia di età, perché i pesci più piccoli possono avere small reni che sono difficili da sezionare, e campioni di rene da vecchi pesci possono contenere masse di tessuto cicatriziale che non possono essere analizzati. Quando adeguatamente anestetizzato, il zebrafish adulto non sarà presente una risposta a toccare stimolazione, che può essere testato utilizzando un cucchiaio o sonda smussato a toccare delicatamente la pinna caudale del pesce.
4. Usando un cucchiaio di plastica, sollevare il pesce dal piatto, decantare la soluzione e posizionare con cura l'animale in uno stampo spugna bagnata, ventrale rivolta verso l'alto.
5. Utilizzando un 31 G 1,0 cc siringa da insulina, iniettare 20 ml di soluzione di destrano scongelato magazzino nello spazio intraperitoneale. Orientare l'ago in modo che l'inserimento avviene con un angolo basso sulla linea mediana ventrale dell'addome. Per evitare la puntura di organi, inserire l'ago poi alzarlo leggermente in modo da sollevare la parete del corpo del pesce e di creare uno spazio in cui iniettare la soluzione di destrano ^48. Nota: In alternativa, lo stock destrano può essere diluito, ad esempio, con un rapporto di 1: 2 o 2: 1 (destrano: DISacqua distillata), per ridurre la fluorescenza di fondo nel campione.
6. Ritorno delicatamente il pesce al serbatoio per consentire il recupero dall'anestesia. Nota: Assorbimento di destrano dal segmento tubulo prossimale avviene entro 8-12 ore e può essere rilevato almeno fino a 3 giorni dopo l'iniezione (dpi). Analisi a 3 dpi fornisce segnale forte tubulo con sfondo bassa fluorescenza nelle popolazioni stromali renali. Procedere alla Parte 2 per l'intero esame monte della captazione destrano da solo, se etichettatura supplementare non è desiderato. Per l'etichettatura combinatoria, passare alla Parte 3 per preparare il tessuto per tutta esame monte della captazione destrano, poi parte 4 a doppia etichetta con fosfatasi e / o nella parte 5 alcalina, effettuare DBA doppio o triplo-etichettatura. Per la ricerca utilizzando sezioni istologiche, passare alla Parte 6 per le istruzioni su come fare sezioni sottili del rene utilizzando un criostato e come macchiare questi con varie etichette e / o immunoistochimica con ANTIB primaria e secondariaodies.

2 Dissezione e Flat Monte Preparazione del rene Zebrafish adulti da un campione animale non si è fissato per visualizzare fluorescente Destrano Etichettatura del tubulo prossimale

1. Euthanize l'adulto zebrafish destrano-iniettato ponendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7.0 per 4-5 min. Nota: Assicurarsi che il pesce è stato eutanasia prima di procedere, monitorando attentamente se le branchie hanno cessato il movimento e il cuore ha smesso di battere ^36.
2. Usando un cucchiaio di plastica, sollevare il pesce dalla soluzione Tricaine, decantare la soluzione e posizionare l'animale su un tovagliolo di tessuto o carta.
3. Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per fare un taglio dietro l'opercolo branchiale e rimuovere la testa.
4. Subito aprire il corpo del pesce con le forbici dissezione facendo una lunga incisione ventrale dalla testa alla base della pinna caudale.
5. Rimuovere gli organi interni del pesce con un paio di pinze sottili.
6. Utilizzare aghi dissezione Super Fine al pin aperto le pareti del corpo in modo da permettere la visualizzazione dell'organo rene, che è aderente alla parete dorsale dell'animale.
7. Utilizzare una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale.
8. Posizionare delicatamente il rene in un flaconcino di vetro da 5 ml contenente PBS 1X e lavare 3 volte con 3 - 5 ml di fresca 1X PBS per 5 minuti ciascuno. Nota: L'uso di un flacone di vetro per la manipolazione dei campioni renali adulte facilita la visualizzazione del tessuto e permette lavaggi con grandi volumi (relativi alla massa di tessuto) di circa 3 - 5 ml. In alternativa, un piatto di coltura cellulare 12 pozzetti può essere utilizzato. Mentre una provetta di plastica potrebbe essere utilizzato, i tubi di dimensioni standard (1,5 ml) potrebbero limitare il lavaggio.
9. Rimuovere il rene con una pipetta di trasferimento e posto su un vetrino pulito con 1-2 gocce di PBS 1X.
10. Utilizzare una pinza sottile per appiattire il rene sul vetrino, assicurandosi che nessun tessuto è arricciato o altrimenti rovesciatasu se stessa. Nota: In alternativa, uno strumento filo di tungsteno può essere usato per fare piccole incisioni nel tessuto connettivo, per facilitare il posizionamento piana del rene.
11. Mettere piccoli pezzi di plastilina su ogni angolo di un 18 x 18 mm vetro coprioggetto e lentamente impostare il vetrino sul rene. Nota: Leggermente angolo il vetrino durante il posizionamento per ridurre al minimo intrappolare bolle d'aria nella soluzione ^50. Le zolle di modellazione di argilla sono di circa 2 mm di diametro (Figura 2A). In alternativa, divots di grasso per vuoto possono essere sostituiti in luogo di plastilina. Aggiungere una goccia supplementare di 1X PBS per riempire lo spazio tra il vetrino coprioggetto e vetrino se necessario.
12. Osservare e / o immagine rene ponendo il vetrino nel campo di vista su uno stereomicroscopio microscopio o composto con il filtro appropriato. Nota: Fare riferimento alla Figura 2A per l'aspetto macroscopico di questa preparazione del vetrino.

3 Fixazione, Dissezione, Permeabilization e rimozione della pigmentazione del rene Zebrafish adulti

1. Preparare una soluzione di fissativo fresco del 4% paraformaldeide (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO o scongelare un'aliquota congelata del 4% PFA / 1 X PBS e aggiungere 0,1% DMSO. Attenzione: PFA è tossico e soluzioni PFA deve essere trattato in una cappa chimica mentre indossa dispositivi di protezione individuale idonei, compresi i guanti ed un camice da laboratorio. Inoltre, la polvere PFA deve essere maneggiato con cura al momento della soluzione di riserva.
2. Riempire un vassoio dissezione con soluzione fissativa sufficiente a sommergere l'intero animale.
3. Euthanize e montare il zebrafish selezionato in soluzione di fissaggio (vedere i passaggi 2,2-2,6). Nota: Il pesce può essere selezionato un campione di rene trattati zebrafish, o un rene isolato da un zebrafish che in precedenza ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale destrano (parte 1).
4. Fissare il campione di O / N (12-16 ore) a 4 ^{° C.}
5. Il giorno seguente, utilizzare una pinza sottile per la curastaccare completamente il rene dalla parete dorsale del corpo e posizionare l'organo in un flaconcino di vetro con una pipetta di trasferimento. Nota: In alternativa, un 12-ben o 24 ben piatto cultura può essere utilizzato. Mentre una provetta di plastica potrebbe essere utilizzato, i tubi di dimensioni standard (1,5 ml) potrebbero limitare il lavaggio.
6. Lavare il rene sezionato 3 volte con 3 - 5 ml di PBS 1X con il 0,05% di Tween per 5 minuti ciascuno.
7. Rimuovere la PBS 1X con il 0,05% di Tween e sciacquare il rene con 3 ml di una soluzione di saccarosio al 5% (in 1X PBS) per 30 min.
8. Sostituire con 3 ml di soluzione al 30% di saccarosio (in 1X PBS) e negozio di O / N (12-16 ore) a 4 ^{° C.} Nota: Le soluzioni di saccarosio permeabilize le membrane cellulari, successivamente, consentendo un'etichettatura specifica dei reagenti in quanto penetrano il tessuto.
9. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di saccarosio al 30% e lavare il rene 2 volte con 5 ml di PBS 1X con il 0,05% di Tween per 5 minuti ciascuno.
10. Sostituire il PBS 1X con il 0,05% di Tween con 3 -5 ml di soluzione sbiancante per rimuovere la pigmentazione melanocita presente sull'organo rene.
11. Posizionare fiala di vetro su un rotatore e guardare con attenzione come pigmentazione scompare. Nota: Depigmentazione in genere dura circa 20 minuti se effettuata dopo il trattamento saccarosio, ma a volte può richiedere fino a 60 min. Se la soluzione di sbianca viene lasciato sul rene per troppo tempo, disintegrazione dall'organo può verificarsi; si consiglia di monitorare il campione ogni 10-15 minuti per verificare l'integrità dei tessuti.
12. Quando la pigmentazione è stato rimosso dal rene, lavare due volte con 3 - 5 ml di PBS 1X con il 0,05% di Tween.
13. Sostituire il PBS 1X con il 0,05% di Tween con 3 - 5 ml di soluzione al 4% PFA per 1 ora a temperatura ambiente.
14. Rimuovere la soluzione PFA 4% e lavare il rene 3 volte con 3 - 5 ml di PBS 1X con il 0,05% di Tween per 5 minuti ciascuno. Nota: Una volta che la fissazione è completo, il rene può anche essere montato su un vetrino e valutato per sans assorbimento di destrano il PIGM melanocitientazione, eseguendo passaggi 2,8-2,12.
15. Rimuovere la PBS 1X con il 0,05% di Tween e sostituirlo con 3 - 5 ml di soluzione di blocco, poi incubare il rene a RT nel blocco per 2 ore.
16. Quando il blocco è completa, procedere direttamente al protocollo di colorazione selezionata. Nota: Il rene può essere elaborato attraverso una o più procedure al fine di condurre studi in materia di etichettatura con reagenti diversi. Per l'etichettatura intero monte del tubulo prossimale con solo fosfatasi alcalina, procedere alla Sezione 4 Per l'etichettatura tutto il monte del solo tubulo distale andare alla Sezione 5 In alternativa, sezioni 4 e 5 possono essere eseguite in successione lineare per doppia rivelazione in tutto il monte .

4 Etichettatura rene adulto tubulo prossimale Segmenti con fosfatasi alcalina Detection

1. Rimuovere il blocco e lavare il rene 3 volte con 3 - 5 ml di PBS 1X con il 0,05% di Tween per 5 minuti ciascuna, e quindi sostituire il PBS 1X con il 0,05% di Tween con 3 - 5 mldi PBS 1X. Lasciate che il rene ammollo per almeno 10 min. Nota: Durante questo tempo, trasferire il rene a un 12-ben o 24 ben piatto cultura se il tessuto è stato mantenuto in un flaconcino di vetro per fasi di lavorazione precedenti.
2. Sostituire il PBS 1X con la soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina sufficiente di lavoro (fare riferimento al kit di rilevamento si trova nella tabella dei Materiali) per coprire il campione, quindi posizionare il campione su un rotatore per 30 min a RT. Mantenere il campione al riparo dalla luce.
3. Arrestare la reazione mediante lavaggio del rene in soluzione tampone di lavaggio fosfatasi alcalina.
4. Sciacquare il rene con 3 cambi di soluzione tampone di lavaggio più di 10 - 15 minuti. Nota: Dopo questo passo, procedere direttamente alla parte 5, punto 5.1 (quindi omettendo temporaneamente Passi 4,5-4,6) se l'etichettatura con DBA è anche desiderata. Passaggio facoltativo: per etichettare e visualizzare nuclei delle cellule nell'organo, immergere il rene in soluzione di ioduro di propidio. Preparare un propidio ioduro di magazzino sciogliendo la polvere in una concentrazionezione di 1 mg / ml (1,5 mm) in acqua distillata. Diluire il magazzino di 500 nm in 2X SSC e incubare il rene in questa soluzione per 30 min. Risciacquare con PBS 1X e passare al punto 4.5.
5. Rimuovere la soluzione tampone di lavaggio e montare il rene su un vetrino pulito nel mezzo di montaggio fosfatasi incluso nel kit di etichettatura (fate riferimento ai punti 2,9-2,12). Nota: Il mezzo di montaggio ha sostituito il PBS 1X dal punto 2.9.
6. Visualizza la fosfatasi alcalina macchiato di rene utilizzando un microscopio stereomicroscopio o composto con un / filtro DAPI set Hoechst. Nota: Passaggio facoltativo: Visualizzare il ioduro di propidio utilizzando un tetrametil-rodamina (TRITC) o filtro rosso Texas.

5. delimitano rene adulto distale tubulo Segmenti con rodamina DBA

1. Preparare una soluzione di 200 ml DBA lavoro diluendo DBA (2 mg / ml) 1: 100 in PBS 1X.
2. Sostituire il PBS 1X con la soluzione Tween 0,05% con la soluzione DBA 200 ml.
3. Posto su rotatore per1 ora a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione DBA e lavare il rene 3 volte con 3 - 5 ml di 1X PBS per 5 minuti ciascuno. Nota: Passaggio facoltativo: Per etichettare e visualizzare nuclei delle cellule nell'organo insieme con l'etichetta DBA, immergere il rene in soluzione DAPI per rilevare con un / filtro DAPI Hoechst (DBA rodamina macchia può essere rilevata con un TRITC o filtro rosso Texas). Preparare uno stock DAPI sciogliendo la polvere ad una concentrazione di 5 mg / ml (14,3 mm). Diluire il magazzino di 300 Nm in 2X SSC e incubare il rene in questa soluzione per 20 min. Risciacquare con PBS 1X e procedere al punto 5.5. Se è stato eseguito Parte 4 di trasformazione, tenere a mente che DAPI e fosfatasi alcalina sono entrambi rilevati con un filtro / DAPI Hoechst.
5. Rimuovere la PBS 1X e montare il rene su un vetrino pulito (vedere i passaggi 2,9-2,12).
6. Visualizza i segmenti distali DBA macchiato del rene usando un filtro rosso normale TRITC o Texas impostato su un stereomicroscopio o un composto microscopio a fluorescenza. Nota: s opzionalitep: Visualizzare il DAPI utilizzando un filtro / DAPI Hoechst.

6. Embedding, criosezionamento e colorazione (coloranti vitali e immunoistochimica Labeling) del rene Zebrafish adulti Tissue

1. Selezionare pesce per l'analisi, poi eutanasia, fissare, e permeabilize come descritto (Passi 3,2-3,8). Nota: Fissare pesci adulti in 9: 1 etanolo: formaldeide / 0,1% DMSO al posto del 4% paraformaldeide / 1X PBS / 0,1% DMSO per la procedura cryosection di produrre sezioni per destrano, fosfatasi alcalina, e la visualizzazione DBA. Tuttavia, tenere presente che fissazioni basato paraformaldeide-possono essere compatibili per alcune procedure di immunoistochimica. Inoltre, sbiancamento del rene adulto non è necessaria per l'analisi cryosection, perché i melanociti sono superficiali e non influenzano la visualizzazione delle cellule del nefrone che compongono il "dentro" dell'organo rene.
2. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di saccarosio al 30% e sostituirlo con 1: 1 tessuto medio di congelamento: 30% sucrose per 4 ore a temperatura ambiente.
3. Rimuovere l'1: soluzione 1 e incorporare campioni renali in 100% tessuto congelamento di medie cryomolds e posto a -80 ^{° C} per almeno 1 ora.
4. Trasversalmente tagliare sezioni seriali, spessore di circa 12 micron, attraverso l'intero rene adulto.
5. Montare criosezioni congelate su vetrini da microscopio adesivo e lasciare asciugare per 1 ora a 50 ^{° C.}
6. Conservare scivola a -80 ^{° C} fino al momento dell'uso.
7. Quando criosezioni sono pronti per essere etichettato, rimuovere il microscopio vetrini da -80 ^o C e posto sul vetrino più caldo a 50 ^{° C} per 45 min.
8. Utilizzando una penna bloccante liquido, disegnare un cerchio intorno alle criosezioni e lasciare asciugare per 15 minuti sul vetrino più caldo a 50 ^{° C.}
9. Rimuovere i vetrini dalla diapositiva più caldo e mettere piatta in una camera umida a temperatura ambiente.
10. Reidratare le criosezioni aggiungendo 1X PBS con 0,05% Tween alla parte circondato delle diapositive per 20 min. Nota: Circa 200-300 &# 956; l è necessaria per coprire ogni porzione circondata su una diapositiva.
11. Sostituire il PBS 1X con la soluzione Tween 0,05% con fresca 1X PBS e incubare per 10 min.
12. Rimuovere 1X PBS e incubare criosezioni in una soluzione di blocco per 2 ore. Nota: Per un 10 ml di soluzione bloccante, combinare 8 ml di 1X PBS con 0,05% Tween, siero di vitello fetale 2 ml e 150 ml DMSO. Per eseguire immunoistochimica dopo la fase di blocco, incubare il vetrino con l'anticorpo primario diluito in blocco desiderato fresco O / N a 4 ^{° C,} lavare una volta con PBS 1X con il 0,05% di Tween, incubare per 2 ore a temperatura ambiente con una soluzione di anticorpo secondario diluito in 1X PBS con 0,05% Tween, lavare una volta con PBS 1X con il 0,05% di Tween, e montare un coprioggetto sul vetrino con il mezzo di montaggio. Le diluizioni degli anticorpi necessari varieranno e le prove devono essere eseguite per selezionare le diluizioni ottimali. Recupero Antigen può anche facilitare immunomarcatura, e viene eseguito prima di bloccare. Subito dopo vetrini vengono scongelati a ⁵⁰ ° C(Punto 6.8) incubare le criosezioni tra 95 ^{° C-100 ° C} per 40 min in preriscaldato 10 mM tampone citrato di sodio. Raffreddare i vetrini per 30 minuti, poi lavare due volte in PBS 1X con il 0,05% di Tween, e passare al punto 6.11.
13. Rimuovere la soluzione di saturazione e lavare criosezioni 3 volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
14. Sostituire 1X PBS con la soluzione DBA colorazione e incubare per 1 ora. Nota: Diluire 1 ml DBA in 99 ml di PBS 1X per ottenere una soluzione di colorazione 100 ml.
15. Rimuovere la soluzione DBA di colorazione e lavare criosezioni 3 volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
16. Applicare l'etichetta fosfatasi alcalina e incubare su criosezioni per 10 min.
17. Lavare fosfatasi alcalina largo delle criosezioni con una serie di 3 lavaggi di tampone di lavaggio per 10 minuti ciascuno. Nota: Per una soluzione di tampone di lavaggio da 100 ml, unire 5 ml di 0,5 M EDTA e 120 mg di levamisolo in 95 ml di PBS 1X. Per etichettare nuclei, incubare le sezioni con propidio ioduro o DAPI al diluzioni in precedenza osservato (Procedura 4.4, 5.4, rispettivamente) per 30 min a RT. Selezionare una colorazione nucleare compatibile con la combinazione di altre macchie fluorescenti che sono stati scelti.
18. Rimuovere tutto il liquido dai criosezioni e mettere 2 gocce di mezzo di fissaggio sul vetrino da microscopio.
19. Posizionare con cura micro vetro di copertura sul vetrino da microscopio. Criosezioni sono ora pronti per l'immagine con il filtro (s) appropriato.

7 WISH elaborazione per rene Zebrafish adulti Campioni

1. Selezionare il campione di zebrafish desiderati (i), l'eutanasia, fissare e sezionare il rene come descritto (Passi 3,1-3,5). Nota: E 'indispensabile utilizzare una soluzione di fissativo del 4% paraformaldeide (PFA) / 1X PBS con 0,1% di DMSO al permeabilize rene. Posizionare il rene in un flaconcino di vetro per una facile visualizzazione durante le successive fasi di lavorazione.
2. Togliere il fissativo e lavare il rene due volte con 5 ml di 1X PBST.
3. Rimuovere la PBS 1X e lavare il rene due volte with 100% di metanolo, poi incubare il rene a -20 ^{° C} per almeno 20 minuti per permeabilize. Nota: Dissected reni possono essere conservati a tempo indeterminato -20 ^{° C.}
4. Reidratare il rene eseguendo una serie di 5 min lavaggi con 3 - 5 ml di metanolo al 50% / PBST 1X, 30% metanolo / PBST 1X e due volte con PBST 1X.
5. Bleach il rene per rimuovere la pigmentazione come descritto (punti 3,10-3,14).
6. Trattare il rene con 10 mcg / ml proteinasi K / PBST 1X con il 0,1% DMSO per 20 minuti, poi risciacquare due volte con PBST 1X e post-fix nel 4% PFA / PBST 1X per 20 min a O / N. Nota: preparare sempre la proteinasi K soluzione di lavoro immediatamente prima digestione del campione mediante la combinazione di 50 ml di proteinasi appena scongelato K stock (10 mg / ml), 50 ml di 1X PBST, e 50 ml di DMSO.
7. Elaborare il rene per volontà singola o doppia seguendo la procedura per la sintesi riboprobe, prehybridization, ibridazione, anti-digossigenina / anti-fluoroscein incubazione anticorpi e DATECzione come recentemente descritto ^49. Montaggio Tutta l'imaging di macchie renali deve essere effettuato entro alcuni giorni di svolgimento della reazione di colorazione: Nota. Macchie nefrone tendono a svanire molto rapidamente, soprattutto etichette substrato rosse. Per nefrone fotografia, piatto montare il campione di rene, come descritto ai punti 2,10-2,12, e l'immagine utilizzando un stereomicroscopio o composto. I filtri di contrasto di interferenza differenziale può essere impiegato per visualizzare meglio i contorni cellulari di nefroni per facilitare l'analisi del campione.

Results

Ciascuno dei protocolli è stato eseguito su wild type zebrafish. Esempi dei dati ottenuti documento della composizione strutturale normale e proprietà dei nefroni ai zebrafish adulti sani rene. Lo zebrafish adulto possiede un mesonefro, o forma di rene seconda che si trova sulla parete dorsale del corpo (Figura 1A). Il rene adulto è relativamente piatta e contiene una cosiddetta testa, tronco, e la regione di coda con melanociti superficiali sparsi in tutto queste regioni (Figura 1A). Il tessuto renale contiene ramificata array di nefroni che collegano e scaricano nelle collettori centrali (Figura 1A). Ogni nefrone è polarizzata lungo la sua lunghezza, con un filtro di sangue (o corpuscolo renale) ad una estremità, seguita da una serie di segmenti del tubulo, e terminante infine in un condotto che raccoglie la soluzione che verrà escreto (Figura 1A). Ogni nefrone tubulo adulto contiene segmentazione prossimali e distalits di cellule, delimitate mediante l'espressione di specifici trasportatori soluto ^30,31,36,37, che si conserva con il modello segmentale esibito da nefroni embrionali ^31-35 (Figura 1B). Ad esempio, le trascrizioni cubilina segnano il tubulo prossimale ³⁹ (PCT e PST) e trascrizioni clcnk segnano il tubulo distale ³² (DE e DL) (Figura 1B). Inoltre, il segmento PCT si distingue per l'espressione del slc20a1a, il PST si distingue per l'espressione del slc13a1, DE si distingue per l'espressione di SLC12A1, e la DL si distingue per l'espressione di SLC12A3 ³²   (Figura 1B). Differenze tra tubuli del nefrone adulto rispetto a quelle embrionali sono che i segmenti distali visualizzano circonvoluzioni (DE, DL) ei rami segmento DL ampiamente negli adulti, che è distinta dalla lineare, anatomia non ramificato di queste regioni nel EMBRyo ^30,31,36,37 (Figura 1A). In entrambi gli adulti e ³⁰ embrionale ^38-41 tubuli del nefrone, l'epitelio PCT può essere distinto per le sue proprietà endocitiche e possono essere visualizzati e valutati per la funzione di riassorbimento basato sulla capacità di assorbimento coniugati destrano fluorescente (Figura 1B). Inoltre, come dimostrato nelle figure successive, il tubulo prossimale adulto (PCT e PST, o regione pan-prossimale) è marcato da fosfatasi alcalina, mentre il tubulo distale (DE e DL, o la regione pan-distale) è etichettato da DBA (Figura 1B). I metodi utilizzati in questo documento per etichetta adulti nefrone zebrafish con assorbimento di destrano, fosfatasi alcalina, DBA, immunoistochimica o WISH possono essere eseguite in varie combinazioni, in tutto il monte o con sezioni istologiche di tessuto renale (Figura 2). Questo permette una grande flessibilità e varietà quando si valuta la composizione nefrone (Figura 2).

Il rene adulto può essere montato piatto su un vetrino per l'analisi, con zolle di plastilina (o, in alternativa, grasso per vuoto) utilizzato per sospendere il coprioggetto sopra il tessuto (Figura 3A). Poiché la lunghezza rene tipica è di circa 5-7 mm, ha una dimensione favorevole alla formazione immagine su un microscopio stereo o composto (Figura 3A). Nell'ambito di illuminazione chiaro, una popolazione superficiale dei melanociti pigmentati di nero può essere visualizzato in associazione con il tessuto renale e vascolare come l'aorta si vede perché gli eritrociti circolanti hanno una tonalità rossa (Figura 3B). Dopo l'iniezione intraperitoneale di destrano-FITC, domini PCT situati in tutto il mesonefro erano ancora etichettati 3 giorni più tardi, e ripreso con un filtro FITC su un microscopio a fluorescenza (Figura 3C). Mentre melanociti oscurano in parte la visualizzazione dei singoli tubuli renali (Figure 3C '), i melanociti non impediscono quantificazione del numero nefrone o la valutazione di diametro tubulo e lunghezza. Dopo l'iniezione intraperitoneale di destrano fluoro-rubino, sbiancamento del campione fisso eliminato la pigmentazione melanociti, e segmenti di PCT sono stati osservati con la sola illuminazione in campo chiaro (Figura 3D). Goccioline lipidiche dalla cavità addominale del corpo a volte può essere visto in associazione con preparazioni di organi interi rene (Figura 3a) segmenti specifica ha PCT mostrare circonvoluzioni, bobine (Figura 3D '), ma anche possono essere caratterizzati da tratti relativamente lineare (Figura 3D ").

Diversi coniugati destrano forniti diversi livelli di chiarezza complessiva etichettatura tubulo prossimale. In particolare, destrano-FITC o destrano fluoro-ruby ha portato a croccante etichette nefrone con sfondo minima (Figure 3C-D "). Sia la cascata blu destranoe e Lucifero coniugati giallo mostrato tubulo prossimale assorbimento nel rene adulto (Figura 4A, 4B). È interessante notare che, reni esposti a destrano cascata blu hanno mostrato relativamente fluorescenza specifica PCT con qualche sfondo (Figura 4A, 4A '), mentre i reni esposti a destrano lucifer giallo avevano etichettato segmenti PCT ma ha mostrato evidente segnale di fondo, con non specifica colorazione fluorescente presente in tutto in stroma renale, o lo spazio tra i nefroni (Figura 4B, 4B '). Infine, l'uso di destrano-fluoro rubino fornisca un'etichettatura superiore tubulo prossimale, con minima o nessuna sfondo anche se visto in una gamma di diversi ingrandimenti (Figura 4C, 4C '). In tutti i casi, il modello tubolare distintivo di destrano coniugato captazione correlata con l'espressione di trascritti codificanti WISH slc20a1a, un marcatore specifico-PCT stabilita ^30-32 (Figura 4D). Nephrsu segmenti PCT colorate con slc20a1a antisenso riboprobe visualizzato bobine PCT a forma di S, così come i segmenti di PCT meno bruscamente a spirale (Figura 4D '), come osservato durante etichettati saggi coniugato destrano (Figura 3D', 3D ").

Altre preparazioni renali, come il rilevamento del tubulo prossimale alcalina attività di fosfatasi (Figura 5A, 5B, 5C) sono stati eseguiti in modo simile dopo la rimozione della pigmentazione melanociti. Questo ha permesso per l'imaging tubulo prossimale del nefrone e analisi senza alcun ostacolo. Endogena reattività fosfatasi alcalina nel nefrone è una importante caratteristica del tubulo prossimale ^1,47. Fosfatasi alcalina colorazione è altamente specifico per le regioni nefrone prossimali, rispetto al modello di espressione WISH pan-prossimale del gene cubilina ³⁹ (Figura 5D, 5D '). Fosfatasi alcalina reattività è stata più intensa in abetesezione v del tubulo prossimale corrispondente al PCT (Figura 5B), simile al modello di espressione cubilina (Figura 5D, 5D '), che aveva anche alti livelli di trascritto relativi nel PCT. Il PCT si distingueva per il suo diametro leggermente più ampio, specifica espressione del fattore di trascrizione mafba (Figura 5E, 5E '), e specifica espressione del gene slc20a1a soluto trasportatore (Figura 4D, 4D'). Fosfatasi alcalina reattività anche etichettato un tratto di tubulo prossimale con un diametro più sottile che corrisponde al segmento PST (Figura 5B) basato sul confronto all'espressione trascritto specifico segmento del gene slc13a1 soluto trasportatore (Figura 5F, 5F '). I domini di espressione di augurio della slc20a1a marcatore PCT e PST marcatore slc13a1 si escludono a vicenda (Figura 5G cubilina (frecce nere. Figura 5G ', 5G ", 5G"' ).

Per confermare ulteriormente il rapporto di fosfatasi alcalina reattività con l'identità tubulo prossimale, tutto montare co-etichettatura di fosfatasi alcalina colorazione è stata effettuata su reni di zebrafish che hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale di destrano fluoro-ruby 3 giorni prima (Figura 6A-C). Destrano fluoro-rubino mostrato sovrapposizione con fosfatasi alcalina nel solo la porzione più ampia del diametro del dominio tubulo prossimale corrispondente al PCT (esempi della Figura 6D-I). Il dominio destrano-positivo bruscamente interrotta nel sito in cui il diametro del tubulo prossimale assottigliata, cioè, dove il PCT e PST soddisfatte, (freccia biancateste in Figura 6) e solo fosfatasi alcalina reattività è stata osservata nel segmento PST successivo (esempi in figura 6D-I). Fluorescenza di fondo dalla reazione della fosfatasi alcalina anche vagamente delineato la coppia di grandi brani dotto collettore paralleli trovato nel rene adulto ^29,30 -ducts che si distinguono per avere il più ampio diametro di ogni tubo renale associata (asterischi in Figura 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Successivamente, il co-etichettatura dei tubuli nefrone con fosfatasi alcalina e destrano assorbimento è stata osservata in analisi cryosection (Figura 6J, perimetri tubulo delineato con puntini bianchi). Nella sezione trasversale, la fosfatasi alcalina reattività è stata osservata in una banda spessa alla superficie apicale dell'epitelio tubulare, coerente con ultrastruttura a spazzola, mentre la cella tubolare corrispondente spazio citosolico mostrato destrano fluoro-rubino reattività (Figura 6J). In particolare, stained tubuli erano o doppio positivo per la fosfatasi alcalina e destrano, che porta alla loro identificazione come segmenti PCT, o singolarmente positivo per la fosfatasi alcalina (Figura 6J, tubulo perimetro delineato in punti gialli), portando ad una identificazione come un segmento PST (nota: altro tubuli presenti sono risultati negativi per entrambe le macchie, i dati non mostrati) (Figura 6J). Inoltre, fosfatasi alcalina colorazione (Figura 6K) è stato combinato con successo con un'etichetta nucleare, ioduro di propidio (Figura 6L), facilitando il conteggio delle cellule (overlay nella Figura 6M).

Il tubulo distale del nefrone adulto zebrafish è stato marcato con rodamina-coniugato DBA (Figura 7). Tutta montare doppia etichettatura con DBA e fosfatasi alcalina è stata effettuata su reni di tipo selvatico zebrafish (Figura 7A-C). DBA e fosfatasi alcalina reattività non ha mostrato alcuna sovrapposizione nei tubuli del nefrone ( Figura 7G, 7H, 7J), considerando che la ramificazione è stata mai osservata in segmenti tubulari colorate con fosfatasi alcalina. Criosezioni renali sono stati raccolti dal tipo selvatico zebrafish che portano un transgene in cui il promotore enpep guida eGFP (Tg: enpep: eGFP), come etichette GFP sia prossimale e tubuli distali del nefrone ⁵¹ (Figura 7I). L'immunoistochimica è stata eseguita per rilevare GFP, in modo da etichettare tutti i tubuli renali (verde, figura 7I), seguita dalla marcatura fluorescente con fosfatasi alcalina e DBA (turchese e rosso, rispettivamente Figura 7I). Analisi di sezioni tubulari rivelato che tubuli erano o positivo per la fosfatasi alcalina o DBA, ma non entrambe le etichette (Figura 7I). Solo rare vascamoduli ha mostrato reattività né con fosfatasi alcalina né macchia DBA, probabilmente a causa dell'angolo della sezione tubulo (freccia bianca, Figura 7I). Inoltre, DBA colorazione è stato unito con successo in tutto colorazione rene montare con l'etichetta nucleare DAPI (Figura 7J), sottolineando ancora una volta la caratteristica natura ramificata dei segmenti tubulari distali (punte di freccia bianche, Figura 7J).

Accanto, per confrontare ulteriormente i modelli di destrano-FITC assorbimento, fosfatasi alcalina, e DBA, etichettatura tripla è stato esaminato da intraperitoneale iniettando zebrafish adulto con destrano-FITC, seguito da isolamento del rene 3 giorni più tardi seguita da criosezionamento e colorazione per fosfatasi alcalina e DBA (esempi forniti nella Figura 8A-E). Tubuli renali hanno mostrato tre categorie di combinazioni di etichette: tubuli che erano doppio positivo per la fosfatasi alcalina e destrano denotato segmenti PCT (linee bianche tratteggiate), Tubules positivi per la fosfatasi alcalina solo denotati segmenti PST (linee gialle tratteggiate), e tubuli distali sono stati etichettati semplicemente DBA (rossa tratteggiata delinea la figura 8A-E). Punti di ramificazione Inoltre, solo DBA positivo tubuli esposti (Figura 8E). Con analisi WISH, questo modello caratteristico di ramificazione della distale, DBA tubuli positivi correlata con i pattern di espressione genica di trascrizioni soluto trasportatore che sono specifici per segmenti tubulo distale (Figura 8F-I). Trascrizioni codificanti clcnk, che segna l'intero tubulo distale (DE e DL) erano sottili di diametro, abbondante nel rene, e punti di ramificazione contenute (punta di freccia nera figura 8F, 8F '). In confronto, i segmenti tubulari che hanno mostrato l'espressione di SLC12A1 e SLC12A3, che sono marcatori del DE e DL, rispettivamente, erano meno abbondanti nei campioni di rene complessiva rispetto al clcnk espressione (confrontare figura 8 G e 8F, 8H). Inoltre, i segmenti tubulari che esprimevano SLC12A1 erano raramente, se mai, ramificata (Figura 8G, 8G '), mentre le regioni del tubulo che esprimevano SLC12A3 sono stati spesso diramati in caratteristici accordi girandola-like (Figura 8H, 8H', 8H ", 8H" ' , frecce nere). Infine, doppio augurio per il slc20a1a marcatore PCT e il marcatore clcnk distale ha dimostrato che queste macchie non sono stati sovrapposti (Figura 8I). In particolare, i tratti di slc20a1a esprimente segmenti PCT non sono state allegate alla clcnk tubuli esprimente, che era previsto in quanto il PST si trova tra queste regioni (Figura 8I). Nel loro insieme, i saggi di etichettatura tubuli renali con assorbimento di destrano, fosfatasi alcalina reattività, DBA, e desideriamo per specifici trascritti genici, permette il discernimento di prossimale rispetto a segmenti distali.

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Figura 1 Nefrone anatomia del rene zebrafish adulto. Disegni schematici del (A) del rene adulto zebrafish e (B) una tabella di confronto delle caratteristiche molecolari segmento esposti da adulti e nefroni zebrafish embrionali. (A) (in alto a sinistra) Il rene adulto è un organo appartamento situato sulla parete dorsale del corpo. (In alto a destra), quando visto da un punto di vista ventrale, il rene ha una morfologia curva caratteristica, composta da regioni di testa, tronco e coda, e ha anche una popolazione superficie di melanociti associati. L'allargamento (in basso a sinistra) mostra uno schema di un albero nefrone tipica nel rene zebrafish adulti, in cui ogni singolo nefrone possiede un filtro del sangue (corpuscolo renale) su un'estremità, seguito da un tubulo prossimale, tubulo distale e dotto. Dipinto schematico (bottom a destra) mostra uno schema lineare di albero nefrone un adulto per confrontare le caratteristiche dei segmenti con quelli di nefroni embrionali (B). I nefroni embrione di zebrafish contengono segmenti tubulari che includono il tubulo prossimale contorto (PCT), tubulo prossimale dritto (PST), distale precoce (DE), e distale tardi (DL), con i domini di espressione genica rispettivi elencati di seguito. Nefroni in zebrafish adulti hanno una composizione simile segmentale e firma molecolare analogo basato sui domini di espressione di geni che codificano per trasportatori soluto, anche se una distinzione notevole rispetto per l'embrione è che diversi nefroni possono essere uniti tramite un segmento DL ramificata. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 Diagramma di flusso mappa che indica il rapporto tra i metodi descritti in questo protocollo, indicando come i metodi possono essere eseguite singolarmente o in combinazioni assortiti. Dopo l'iniezione intraperitoneale di marcato destrano lisina-fissabile in zebrafish adulto, il rene può essere visualizzato in un intero montare preparazione, da solo o in combinazione con fosfatasi alcalina e / o macchie DBA. In alternativa, il rene zebrafish selezionata può essere esaminato dopo il tessuto istologico sezionamento con un criostato. Le sezioni possono essere colorati per etichettare numerose combinazioni di attributi, utilizzando l'immunoistochimica, la colorazione nucleare, DBA colorazione, e / o della fosfatasi alcalina reattività. Inoltre, sezioni renali possono essere visualizzati direttamente per la presenza di lisina-fissabile assorbimento destrano in segmenti PCT. Infine, reni selezionati possono essere trattati per l'espressione spazio-temporale dell'espressione genica utilizzando WISH. I numeri tra parentesi si riferiscono a corresponding parti del protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 adulti rene zebrafish piatto montare la preparazione e l'applicazione di visualizzare coniugato assorbimento destrano nel segmento PCT di nefroni renali. (A) immagine Brightfield di un campione di rene piatto montare la preparazione, in cui l'organo è stato posizionato piatto su un vetrino, con un coprioggetto posto sulla parte superiore del tessuto che si riposa su quattro zolle di plastilina (colore rosa caldo). Qui la preparazione renale è ripreso accanto a un righello metrico per fornire un confronto in scala. Il tipico rene adulto è di circa 5-7 millimetri (mm) dalla testa alla coda. (B) Brightfield immagine di un greggirene. La pigmentazione nera corrisponde alla popolazione sparsa di melanociti si trovano in associazione con il rene, e l'aorta corre lungo la linea mediana del rene. (C) Visualizzazione di segmenti PCT nefrone 3 giorni dopo l'iniezione intraperitoneale di 40 kDa destrano-fluoresceina (FITC) , senza sbiancamento del rene adulto. Segmenti PCT sono visti in tutto il rene, ma sono in parte oscurati a causa dei melanociti. (C '), zoom digitale di un singolo nefrone, con melanociti (freccia bianca). (D) Immagine di un rene adulto 3 giorni dopo l'iniezione intraperitoneale di 10 kDa destrano fluoro-rubino, fissazione del rene, e candeggio. La pigmentazione melanocita è stato rimosso e le regioni PCT sono stati visualizzati qui in base alla loro adozione endocitica di destrano in condizioni di illuminazione campo chiaro. Goccioline lipidiche (freccia) dal ventre a volte può essere visto in associazione con campioni di tessuto renale. (D ', D ") Repreimmagini rappresentative ritraggono lievi variazioni morfologiche tra i segmenti PCT. Mentre molti PCT nefrone sono strettamente arrotolati (D '), altre nefroni contengono regioni di PCT che hanno minimo avvolgimento (D "). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Etichettatura Figura 4 adulti nefrone rene PCT segmento tubulo zebrafish tipo selvatico sono stati iniettati per via intraperitoneale con una sola coniugato destrano fluorescente; allora il loro rene è stato esaminato 3 giorni dopo l'iniezione per la visualizzazione PCT. (A, A ') a cascata Destrano blu, 10 kDa (B, B'), destrano Lucifero giallo, da 10 kDa e (C, C ') destrano f luoro-rubino, 10 kDa tutti preferenzialmente etichettare i segmenti di PCT in nefroni renali. Entrambi destrano cascata blu e Lucifero spettacolo giallo qualche etichettatura non specifico di popolazioni di cellule stromali situati tra nefroni, con sfondo molto più alta osservata in Lucifero giallo reni trattati. Al contrario, destrano fluoro-rubino mostrato sfondo drasticamente ridotto con l'etichettatura PCT intenso. (D, D ') Un rene adulto macchiata dal desiderio di rilevare la posizione dei trascritti che codificano slc20a1a, un marcatore specifico del tipo di cellula trasportatore PCT. Il dominio espressione slc20a1a corrisponde al modello caratteristico di captazione destrano osservato nel rene, con una distribuzione di vari loop domini strettamente arrotolati / PCT e tratti PCT più allungate che mostrano un diametro ampio coerente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 risultato Rappresentante di colorazione per la fosfatasi alcalina, un marcatore tubulo pan-prossimale, nel rene adulto zebrafish rispetto ad altri marcatori del tubulo prossimale valutati con WISH. (AC) fosfatasi alcalina colorazione (turchese) illumina il nefrone tubulo prossimale, mettendo in evidenza sia il PCT e PST. (DF ') WISH unico per i geni elencati (ciascuno in colorazione viola). (D, D') Il pattern di espressione di cubilina , una pan-prossimale (PCT-PST) marcatore, correla con fosfatasi alcalina (D, D '). In confronto, WISH per mafba segna il PCT (E, E ') e slc13a1 segna il PST (F, F'). In (GG "') doppio WISH per il marcatore PCT slc20a1a </ Em> (rosso) e il marcatore slc13a1 PST (viola) dimostra che i segmenti etichettati da questi marcatori non si sovrappongono, e piuttosto che i loro domini di espressione occupano posizioni adiacenti quando singoli nefroni sono strettamente esaminati (G'-G "'). Frecce nere indicano la giunzione tra PCT e PST segmenti, che in genere è associata ad un cambiamento di diametro tubulo dal grande al piccolo, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6 fosfatasi alcalina e destrano assorbimento spettacolo sovrapposizione nel segmento PCT di nefroni renali adulte, e fosfatasi alcalina colorazione è compatibile con il co-etichettatura nucleare con ioduro di propidio. (AI) (AC) immagine fusa e immagini separate della regione sella di un solo rene. (DF) e (GI) Due set di immagini fuse e le immagini separate di esempio nefroni. (I) analisi Cryosection conferma co-etichettatura di fosfatasi alcalina e destrano fluoro-ruby in segmenti PCT (descritto in puntini bianchi), considerando che la fosfatasi alcalina sola etichetta il PST segmento (descritto in punti gialli). (KM) Un rene è statomarcato con (K) fosfatasi alcalina (turchese) e ioduro (L) di propidio (viola), permettendo (M) fusa visualizzazione delle cellule del tubulo prossimale e dei loro nuclei, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7 fosfatasi alcalina e DBA sono mutuamente esclusive etichette di segmento che segnano rispettivamente il pan-prossimale e le regioni pan-distali,, presenti in nefroni renali zebrafish adulto. (AH) preparazioni a tutto il monte di un rene zebrafish macchiato di fosfatasi alcalina e rodamina-DBA. La fosfatasi alcalina (turchese) e DBA (rosso) non mostrano sovrapposizione nel rene. Livelli di fondo di phospha alcalinatase illuminare la coppia di grandi collettori a ciascun rene (asterischi, *), che sono distintivi a causa della loro grande diametro. DBA tubuli positivi sono più sottili di diametro e caratterizzate frequentemente dalla presenza di punti di ramificazione (frecce bianche). (AC) Fusa immagine e immagini distinte della regione sella di un singolo rene. (DF) Una serie di immagini unite e le immagini separate di esempio nefroni. (G, H) Ulteriori esempi, con tubuli ramificati DBA accanto fosfatasi alcalina tubuli positivi, unite le immagini. analisi (I) Cryosection conferma che la fosfatasi alcalina e di etichette DBA sezioni tubulari distinte, e solo rari tubuli mostrano né etichetta (freccia bianca ), probabilmente a causa dell'angolo di sezione tale tubulo. Per questa analisi, di tipo selvatico pesci transgenici, Tg: enpep: eGFP, sono stati utilizzati e tutti i tubuli renali in questo rene sono stati immunolabeled con un anticorpo primario per rilevare GFP (J). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8 etichettatura tripla di criosezioni renali adulti con assorbimento di destrano, fosfatasi alcalina, e DBA rispetto alle analisi del segmento distale WISH. Reni (AE) di età sono stati iniettati per via intraperitoneale con destrano-FITC (verde), ed i reni raccolto 3 giorni più tardi per l'incorporamento e criosezionamento. Colorazione con fosfatasi alcalina (turchese) e DBA (rosso) ha rivelato tre popolazioni di tubuli: segmenti di PCT che erano positivi per fosfatasi alcalina reattività e DEXTcorse (descritto in puntini bianchi), i segmenti PST che erano positivi solo per la reattività alcalina fosfatasi (descritto in punti gialli), e segmenti tubulari distali che erano positivi per DBA solo (indicato in punti rossi), che ha anche mostrato caratteristici punti di ramificazione distale. ( dC) immagine fusa e le immagini separate di un esempio tratto. (E) Fusa immagine di un'altra sezione di esempio. (FI) Confronto di distali del gene tubulo pattern di espressione da sola (FH '") e doppio (I) WISH. L'(FH ') WISH unico per i geni di cui (in ogni colorazione viola). (F, F') Il pattern di espressione di clcnk, un pan-distale (DE-DL) marcatore, è stato rilevato in tubuli sottili che contenevano punti di diramazione (freccia nera). (G, G ') In confronto, WISH per SLC12A1 segna il DE senza punti ramo rilevati, e (HH' ") SLC12A3 segna il DL, un segmento caratterizzato da numerosi punti di ramificazione in tutto l'organo rene (frecce nere). (I) Doppio WISH per la slc20a1a marcatore PCT (rosso) e il clcnk pan-distale (viola). I segmenti etichettati da questi marcatori non si sovrappongono, e piuttosto i loro domini di espressione occupano posizioni non adiacenti, ad esempio che le singole bobine PCT (in basso a destra) non lo fanno intestano tubuli distali, e quest'ultimo occupano posizioni discrete e possiedono punti di ramificazione Hallmark (punta di freccia nera ). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, abbiamo descritto i metodi che consentono la visualizzazione dei componenti segmento nefrone in zebrafish adulto. L'iniezione di destrano coniugati fluorescenti consente etichettatura PCT preferenziale a causa delle proprietà endocitiche di queste cellule del tubulo prossimale ^30,38. Questo metodo può essere eseguito con grande flessibilità dovuta all'esistenza di destrani che può essere ottenuta con uno stuolo di diversi coniugati fluorescenti. Inoltre, l'uso di destrani lisina-fissabile è un modo particolarmente conveniente per etichettare PCT segmenti, in quanto non sono necessarie procedure di etichettatura secondari. Ciò consente il rilevamento del segnale relativamente semplice ed è compatibile con molte altre etichette fluorescenti, immunomarcatura, e l'uso di linee transgeniche giornalista. Etichettatura fosfatasi alcalina segna anche il tubulo prossimale, con una forte reattività in PCT e leggermente più debole reattività nel PST. Infine, la colorazione DBA consente l'etichettatura dei segmenti tubulari distali, che mostrano una characteristic ramificata morfologia. Diverse molecole lectine, che sono proteine ​​di zucchero vincolanti di origine non immune, sono stati ampiamente utilizzati per distinguere i segmenti del nefrone mammiferi ^47. E 'interessante che DBA in zebrafish correla con segmenti dei tubuli distali, in quanto è utilizzato per contrassegnare dotti collettori dei reni in mammiferi ^47.

Presi insieme, questi metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per documentare la composizione e la funzione renale. Poiché tutti questi metodi possono essere utilizzati in preparazioni renali interi, forniscono strumenti per valutare la struttura e la funzione del nefrone tutto l'organo, senza dipendere interamente da l'uso di più in termini di tempo, i metodi noiosi, ad esempio, il lavoro cryosection e immunomarcatura. Tuttavia, le macchie descritti in questo articolo metodi sono vitali in cryosection. Analisi Cryosection genera campioni (rispetto a tutto mount) che sono più adatti per immunoistochimica per rilevare Pepti specificides, anche se naturalmente questo tipo di analisi richiede la disponibilità di anticorpi primari appropriati. Purtroppo una limitazione importante nel lavoro con il modello animale di zebrafish rimane la scarsa disponibilità di anticorpi. Così WISH rimane il più largamente usato, cioè, 'go-to,' procedura per l'analisi di espressione genica. WISH utilizzando reazioni substrato BCIP, NBT, e / o INT per produrre precipitati viola o rosse non è compatibile con colorazione fluorescente su criosezioni. Una possibilità sarebbe quella di invocare l'uso della rilevazione WISH fluorescente, una procedura che è stata ottimizzata per i campioni embrionali di zebrafish e potrebbe essere adattato per l'uso con il rene adulto. La descrizione dei metodi in questo articolo il video dovrebbe consentire un'ulteriore sperimentazione di tecniche come WISH fluorescente in combinazione con linee di zebrafish transgenici in cui i singoli segmenti vengono etichettati con un giornalista, come eGFP o mCherry. In alternativa, i metodi descritti qui could essere testato in combinazione con altri coloranti vitali, ad esempio, altre lectine. Così, ulteriore adattamento ed espansione dei metodi qui descritti potrebbero essere invocate per soddisfare le esigenze del ricercatore per interi preparati renali montaggio e analisi.

Come tali, questi metodi hanno un potenziale ampio per l'attuazione con il modello di zebrafish per gli studi di rigenerazione in corso e anche in modelli di malattia genetica. Vi è un urgente bisogno di ricerca innovativa e trattamenti per afflizioni renali. Milioni di persone soffrono di qualche forma di malattia renale ogni anno che deriva da cause congenite, acute e / o croniche. Inoltre, la prevalenza della malattia renale continua a crescere in tutto il mondo, rendendo queste malattie un problema di salute pubblica globale ^14,15. Trattamenti come l'emodialisi sono disponibili in base al quale una macchina di dialisi esterno serve per liberare il sangue di scorie metaboliche del paziente se i loro reni non sono in grado di svolgere questo ruolo. Sfortunatamente, Questo intervento ha dei limiti, come trattamento in corso è necessario per la sopravvivenza. Inoltre, i pazienti richiederebbero un trapianto di rene, che può richiedere anni per ricevere una volta che un paziente è posto su una lista d'attesa. Anche dopo l'ottenimento di un trapianto di rene, molti pazienti soffrono gli effetti negativi a seguito della procedura e devono combattere questi effetti per il resto della loro vita. Queste difficoltà dimostrano la grave necessità per lo sviluppo di nuovi trattamenti per aiutare a prevenire o malattie renali o forse per aumentare la rigenerazione dei tessuti ^8,16,52,53. Date le ovvie limitazioni etiche dell'uso di cavie umane nei laboratori biomedici, modelli animali sono essenziali per lo studio della patogenesi delle malattie umane e per la sperimentazione di nuovi trattamenti. Come risultato della sua somiglianza anatomica e la vicinanza evolutiva, il topo è diventato il modello più diffuso delle malattie umane ^45. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni con questo animale, inclusa,ing incapacità di visualizzare lo sviluppo degli organi in vivo e la praticità di completare schermi genetici su larga scala. Zebrafish sono una rilevante e utile organismo modello per lo studio dello sviluppo degli organi e modellazione delle malattie umane ^45,46. Per quanto riguarda la malattia umana, esistono omologhi funzionali in zebrafish per quasi il 70% di tutti i geni umani ^54,55.

Studi recenti hanno messo in evidenza l'utilità di zebrafish per molti settori della ricerca ^31,37,56 rene. Studi di rigenerazione e riparazione in zebrafish dopo AKI suggeriscono che la rigenerazione tubulo epiteliale e neonephrogenesis sono due processi che si verificano e si sovrappongono durante la rigenerazione timecourse ^30,37. L'uso di un aminoglicoside antibiotico chiamato gentamicina è stata utilizzata come un paradigma lesione attraverso cui studiare i risultati di AKI in zebrafish adulto ^29,30,37. Su una di circa due settimane periodo successivo lesioni da gentamicina, la Tubul prossimalees rigenerano, e nel frattempo nuovi nefroni formano tutto l'organo ^29,30,37. In generale, i meccanismi che regolano la rigenerazione epiteliale rimangono molto controversa. In quello proposto meccanismo del processo di riparazione, vi è l'evento lesione acuta iniziale seguita da una desquamazione delle cellule morte nel lume. Avanti, c'è una serie di de-differenziazione, proliferazione, e gli eventi di migrazione, dopo che le nuove cellule si differenziano, ripopolare la membrana basale feriti e funzione di ripristino al sito danneggiato. In alternativa, altri studi hanno suggerito che le cellule di ricambio derivano da cellule staminali / progenitrici che risiedono all'interno tubuli del nefrone. Per quanto riguarda il processo di neonephrogenesis in zebrafish, aggregati cellulari sono stati osservati seguente AKI per iniezione gentamicina ^29,30. Questi aggregati successivamente maturano in nuovi nefroni che Plumb in tubuli già esistenti ^29,30. Il filo comune che unisce la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis è il loro fattore mistero puro e semplice: al momento non vi sono esponenzialmente più domande su come queste gesta di rigenerazione in quanto ci sono approfondimenti disponibili.

Ad oggi, tuttavia, diverse linee emozionanti prove supportano l'idea che la ricerca di rigenerazione renale utilizzando zebrafish può infatti fornire importanti spunti comparativi in AKI umana che può anche avere diretto traslazionale potenziale ^56-58. Lo screening chimico per identificare piccole molecole che aumentano la proliferazione delle cellule progenitrici renali nell'embrione zebrafish recentemente portato all'identificazione della -butanoate inibitore delle istone deacetilasi metil-4-(feniltio) (m4PTB) ^56,57. La somministrazione di questo composto di larve di zebrafish con gentamicina indotta AKI ha rivelato che la sopravvivenza larvale aumentato e che la proliferazione renale tubulare è stata rafforzata ^56,58. Quando i topi con moderata AKI ischemia-indotta sono stati trattati con m4PTB, il loro recupero è stato accelerato in association con una riduzione sia in tubolare di atrofia e arresto del ciclo cellulare delle cellule proliferanti tubulari renali ^58. Questi risultati suggeriscono che le vie responsabili per il normale sviluppo zebrafish renale e / o la risposta rigenerativa di AKI saranno conservati con i mammiferi ^56.

Così, mentre sono necessari ulteriori studi per prendere in giro a parte i meccanismi di rigenerazione, cioè quello di individuare le vie di segnalazione che sono coinvolti e comprendere la loro interazione, il pesce zebra fornisce una strada promettente per perseguire questo importante obiettivo nel campo nefrologia. Strumenti come le etichette cellulari nefrone descritte in questo protocollo rappresenta un gruppo di saggi che possono essere utilizzati per valutare la composizione e la funzionalità renale in modelli di AKI. Inoltre, possono essere applicati per caratterizzare modelli transgenici di malattia renale e possono fornire modi per identificare terapie chimiche in grado di promuovere il ripristino della struttura del nefrone dopo la diga renaleetà.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS			Prodotto diluendo 10 X PBS in acqua distillata.
1X PBST			0,1% Detersivo Tween-20 in 1 X PBS.
1X PBS con 0,05% Tween			0,05% Tween-20 detersivo in 1 X PBS.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			Sciogliere il 4% di PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, portare a ebollizione su una piastra calda in una cappa aspirante. Raffreddare e congelare le aliquote per la conservazione in congelatore a -20°C. Scongelare appena prima dell'uso e non ricongelare le scorte.
Pinzetta Fine Ropeps	Roboz	RS-1050	Dumont Modello #55
Scivolo in vetro	Thermo-Fisher	4445	Bianco Frost
Vetrino coprioggetti	in vetro Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Argilla da modellare	Hasbro	Playdoh	Altre argille da modellare possono essere sostituite e funzionano in modo simile
Supporto per vetrini	Thermo-Fisher	12-587	Opzionale: vassoio di cartone per riporre i vetrini in piano
Soluzione sbiancante			Formula della miscela di candeggina (per una soluzione da 20 ml): 1,6 ml di soluzione di idrossido di potassio al 10% 0,6 ml di soluzione di perossido di idrogeno al 30% 100 μ l di 20% di Tween Riempire fino a 20 ml con acqua distillata
Idrossido di potassio	Sigma	221473
Perossido di idrogeno	Sigma	H1009
Soluzione bloccante			Soluzione bloccante (per una soluzione da 10 ml): 8 ml di 1X PBS con 0,05% di Tween 2 ml di siero fetale di vitello 150 μ l di DMSO
Rilevamento dell'attività della fosfatasi alcalina	Invitrogen	E6601	Utilizziamo il kit di rilevamento della fosfatasi endogena ELF 97. Per preparare la soluzione del substrato di lavoro, diluire il substrato 20 volte nel tampone di rilevamento, secondo le istruzioni del produttore.
Soluzione di lavaggio			Ricetta per la soluzione tampone di lavaggio (per una soluzione da 100 ml): 5 ml di EDTA 0,5 M 120 mg di Levamisolo 95 ml di 1X PBS
Dextran, fluoresceina, 40.000 MW	Invitrogen	D1844	Diluire con acqua distillata per ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml, e conservare le aliquote in congelatore a -20°C.
Destrano, blu a cascata, 10.000 MW	Invitrogen	D1976	Diluire con acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml e conservare le aliquote nel congelatore a -20 °C.
Destrano, giallo lucifero, 10.000 MW	Invitrogen	D1825	Diluire con acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml e conservare le aliquote nel congelatore a -20 °C.
Destrano, tetrametilrodamina (fluoro-rubino), 10.000 MW	di Invitrogen	D1817	Diluire con acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml e conservare le aliquote nel congelatore a -20 °C.
Dolichos biflorus agglutinina (DBA)-rodamina	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Soluzione colorante (per un 100 μ l soluzione): 1 μ l di DBA 99 μ l di 1X PBS
Ioduro di propidio	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield duro set mezzo di montaggio	Vector laboratories	H-1400
Micro vetro di copertura	VWR	48393081
Dimetil solfossido, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Saccarosio	Sigma	S0289
EDTA, soluzione 0,5 M, pH 8,0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Mezzo di congelamento dei tessuti	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek, 10 x 10x 5 mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 vetrini adesivi per microscopio	Tru Scientific	0380W
Bloccante dei liquidi – penna super PAP	Microscopia elettronica Sciences	71312
Camera di umidità per macchie immunologiche	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm&commercio; HM 525 Stereomicroscopio a criostato
	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blu GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; Il set di filtri 83457 P-TRITC	utilizzato è stato il seguente: il filtro Hoechst/DAPI è stato utilizzato per il rilevamento di DAPI, ioduro di propidio, blu a cascata di destrano e fosfatasi alcalina. Il filtro GFP/FITC è stato utilizzato per il destron-FITC, il lucifero di destrano giallo e il rilevamento anti-GFP. Il filtro TRITC è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-fluoro-rubino, PI e DBA.
Microscopio composto	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set utilizzato è stato il seguente: il filtro Hoechst/DAPI è stato utilizzato per il rilevamento di DAPI, ioduro di propidio, blu destrano a cascata e fosfatasi alcalina. Il filtro GFP/FITC è stato utilizzato per il destron-FITC, il lucifero di destrano giallo e il rilevamento anti-GFP. Il filtro Texas Red è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-fluoro-rubino, PI e DBA.