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Articolo metodologico

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

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DOI:

10.3791/51647

⸱

19 agosto 2014

 ,  , 
1Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center

In questo articolo

Sommario

Le dinamiche dei glicosomi nei tripanosomi africani sono difficili da studiare con le tradizionali tecniche di biologia cellulare come la microscopia elettronica e a fluorescenza. Come mezzo per osservare il comportamento dinamico degli organelli, un sistema reporter di organelli fluorescenti è stato utilizzato in combinazione con la citometria a flusso per monitorare la dinamica del glicosoma in tempo reale nei parassiti vivi.

Abstract

Trypanosoma brucei è un parassita che causa kinetoplastidi tripanosomiasi umana africana (HAT), o malattia del sonno, e una malattia devastante, nagana, nei bovini 1. I supplenti parassita tra il sangue del mammifero ospite e la mosca tse-tse vettore. La composizione di molti organelli cellulari cambia in risposta a queste differenti condizioni extracellulari 2-5.

Glycosomes perossisomi sono altamente specializzati in cui molti degli enzimi coinvolti nella glicolisi sono compartimenti stagni. Composizione cambia Glycosome in maniera evolutiva e regolamentato l'ambiente 4-11. Attualmente, le tecniche più comuni utilizzate per studiare glycosome dinamiche sono elettroni e microscopia a fluorescenza; tecniche che sono costosi, tempo e lavoro, e non facilmente adattato alle analisi di throughput elevato.

Per superare queste limitazioni, un sistema reporter fluorescente-glycosome inche migliorato proteina fluorescente gialla (EYFP) si fonde a una sequenza di targeting dei perossisomi (PTS2), che dirige la proteina di fusione per glycosomes 12, è stato istituito. Con l'importazione della proteina di fusione PTS2eYFP, glycosomes diventano fluorescenti. Degrado organello e risultati riciclaggio nella perdita di fluorescenza che può essere misurato mediante citometria a flusso. Un gran numero di cellule (5.000 cellule / sec) possono essere analizzati in tempo reale senza una preparazione del campione come la fissazione e il montaggio. Questo metodo offre un modo rapido di rilevare cambiamenti nella composizione organello in risposta alle mutevoli condizioni ambientali.

Introduzione

Trypanosoma brucei causa la malattia africana sonno negli esseri umani e una malattia devastante, nagana, nei bovini. Farmaci utilizzati nel trattamento di queste malattie sono antiquate ed estremamente tossico, i vaccini non sono disponibili, e il potenziale di sviluppo di resistenza ai farmaci richieda l'ricerca di nuovi bersagli farmacologici 1.

Durante il suo ciclo di vita, T. brucei, si alterna tra un insetto vettore e ospite mammiferi; due host che presentano molto diversi ambienti in cui il parassita deve sopravvivere. Una serie di cambiamenti metabolici e morfologici si verificano come il parassita è esposto a diverse condizioni ambientali. Alcuni dei cambiamenti più drammatici sono stati osservati in parassiti microcorpi specifici-single-membrana delimitata, chiamato glycosomes 13.

I livelli di glucosio sono relativamente alti (~ 5 mm) nel sangue e parassiti del sangue (BSF) generano ATP esclusivamente attraverso wh glicolisimetabolismo mitocondriale ile è represso 14. A differenza di altri eucarioti in cui glicolisi avviene nel citoplasma, T. brucei compartimentalizza maggior parte degli enzimi glicolitici in glycosomes 14,15. I parassiti sono prese dalla mosca tse-tse durante un farine e sperimentare un calo di glucosio, che scende a livelli non rilevabili entro 15 min di essere ingerito dalla mosca. Il metabolismo di insetti, forma prociclico (PCF), parassiti è più flessibile e glucosio, nonché aminoacidi come prolina, possono essere utilizzati nella sintesi di ATP 16-18. Studi di proteomica comparativi rivelano ciclo di vita variazioni dipendenti in glycosomal e proteine ​​mitocondriali con le proteine ​​glicolitici aumentato in parassiti del sangue e proteine ​​mitocondriali coinvolte nel ciclo TCA e catena respiratoria 13,19. Mentre molti studi si sono concentrati sulle differenze tra BSF e glycosomes PCF, poco si sa circa i cambiamenti in glycosomes PCF che si verificano in risposta a envmodifiche ironmental.

Nel hindgut della mosca, i livelli di glucosio sono bassi con aumenti transitori nel corso di una alimentazione 20. In più studi in vitro, i parassiti PCF vengono coltivate in terreni contenenti glucosio. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i cambiamenti del metabolismo PCF significativamente in risposta al glucosio disponibilità 17. In assenza di glucosio, prolina captazione e prolina aumento deidrogenasi 18. Questo cambiamento nel metabolismo mitocondriale è probabilmente accompagnato da un cambiamento nella composizione glycosome e morfologia, tuttavia, questo non è stato valutato direttamente.

Elettroni e microscopia a fluorescenza sono comuni tecniche utilizzate per studiare le dinamiche glycosome in T. brucei 2,21-24. Questi protocolli sono tempo e lavoro, costoso e difficile adattarsi agli studi in tempo reale e protocolli ad alto rendimento. Per superare questa limitazione, un sistema reporter fluorescente-organello used per studiare organelli nei sistemi di mammiferi e di lievito è stata modificata per l'uso in T. brucei 12.

Sistemi reporter fluorescente-organelli sono stati ampiamente utilizzati in eucarioti superiori come il lievito, piante e cellule di mammifero 25-27. In tali sistemi, una proteina fluorescente è fuso ad una sequenza di amminoacidi che ha come bersaglio la proteina di organelli specifici. La degradazione o la sintesi delle proteine ​​target viene misurata tramite fluorescenza e cambiamenti nella composizione organelli sono riflesse dai cambiamenti nella fluorescenza delle cellule.

Quando la cornice di lettura aperta della proteina fluorescente gialla maggiore (EYFP) è fusa ad un perossisomica sequenza di targeting di tipo II (PTS2) 12, la proteina PTS2eYFP viene importato in, glycosomes e fluorescenza di importazione-competente maturi può essere monitorato tramite citometria a flusso. Variazioni nella composizione glycosome sono riflesse dai cambiamenti nella fluorescenza cellulare. Questo sistema può aiutare a risolVing i meccanismi che regolano i cambiamenti provocati dall'ambiente in glycosome composizione.

Questo manoscritto descrive la generazione di un sistema glycosome giornalista in parassiti PCF in collaborazione con citometria a flusso per monitorare le dinamiche glycosome in tempo reale in parassiti vivi e fornisce un esempio di come è stato utilizzato per seguire cambiamenti nella composizione glycosome in risposta a diversi ambienti. In sintesi, glycosome composizione è influenzata dalla concentrazione di glucosio extracellulare e passaggio di culture log-fase in mezzi freschi innesca cambiamenti nella glycosome composizione. Questo sistema può essere modificato per studiare il comportamento dinamico di altri organelli in tripanosomi e altri parassiti.

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Protocollo

1. Generale Tripanosoma Zootecnica

  1. Pesare solidi per SDM79 preparazione supporti (Tabella 1).
  2. Conservare a 4 ° C in 50 ml conica o un sacchetto a chiusura ermetica. NOTA: I reagenti sono stabili per almeno 6 mesi.
  3. Scongelare siero fetale bovino (FBS) in un bagnomaria a 37 ° C, e mescolare periodicamente per inversione. NOTA: FBS viene ricevuto dal fornitore come una soluzione sterile. Filtro sterilizzante FBS riduce la sua capacità di sostenere la crescita del parassita.
  4. Una volta che l'intera bottiglia è scongelato, il calore inattivare il siero per 30 minuti in un bagnomaria a 56 ° C, mescolando periodicamente per ridurre al minimo la precipitazione di componenti del siero.
  5. Thaw penicillina / streptomicina soluzione (pen / strep), emina (2 mg / ml in NaOH 50 mM), e la soluzione a medio basale aquila vitamina a temperatura ambiente.
  6. Per 1.000 ml cilindro graduato, aggiungere 20,2 g di solidi SDM79 (Tabella 1) ai componenti liquidi (Tabella 2) e mescolare bene su un piatto mescolare.
  7. Regolare il pH a 7,35, e portare il volume a 850 ml con acqua.
  8. Filtro sterilizzare supporti collegando un tubo di aspirazione sul fondo di una bottiglia filtro. Applicare vuoto finché la soluzione viene filtrata.
  9. Rimuovere il filtro in alto nell'armadio biosicurezza e aggiungere 150 ml di FBS inattivato al calore. Rimuovere rivestimento in plastica dal tappo sterile e bottiglia mezzi di tenuta.
  10. Preparare supporti SDM80 nello stesso modo come SDM79 con le seguenti eccezioni; non aggiungere il glucosio o glucosamina e utilizzare MEM, senza glutammina. Al posto di 150 ml di FBS inattivato al calore, aggiungere 135 ml di dializzato, FBS inattivato al calore, e 15 ml di FBS inattivato al calore.
  11. Cultura PCF parassiti a 25 centimetri pallone 2 con 10 ml di mezzo appropriato a 27 ° C e 5% di CO 2. NOTA: Le cellule devono essere conteggiati tutti i giorni con un emocitometro o un citofluorimetro (vedi paragrafo 6) e le colture devono essere mantenute a densità tra 1 x 10 5 e 5 x 10 6 cellule / ml.

2 Transfection di PCF parassiti con il Reporter Construct fluorescente

NOTA: Per seguire glycosome dinamica, una proteina reporter contenente la sequenza di targeting dei perossisomi (PTS2) di aldolasi fusa alla proteina fluorescente gialla maggiore è espressa nei parassiti. La sequenza codificante la proteina di fusione viene clonato in pXS2bla 12, che contiene il promotore procyclin e le regioni intergeniche tubulina, che ricombinazione omologa diretto nel genoma e il gene di resistenza blasticidin per la selezione. Linee cellulari prociclico che ospitano i geni che codificano la polimerasi e tetraciclina repressore T7 (PF29-13) vengono trasformate con il costrutto di targeting, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Preparare cytomix miscelando i componenti elencati nella Tabella 3. Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.
  2. Linearizza DNA plasmidico con MluI pipettando 10 ml di DNA (1 mg / mL), 5 ml di buffer enzima di restrizione, acqua 33 ml, e 2 μ; L di MluI enzima in una provetta. Incubare a 37 ° C per 1 ora.
  3. Purificare la restrizione digerire con l'aggiunta di 1 volume di tampone di legame per l'enzima di restrizione digest. Mescolare binding buffer e DNA digerito con il vortex. Brevemente centrifugare per raccogliere il campione al fondo della provetta.
  4. Inserire una colonna vincolante in un tubo di raccolta da 2 ml DNA, e il trasferimento di DNA digerito / soluzione tampone a colonna vincolante.
  5. Centrifugare per 10.000 xg per 1 minuto. Dopo centrifugazione, scartare filtrato dal tubo di raccolta e riportare la colonna al tubo di raccolta.
  6. Aggiungere 700 ml di SPW tampone di lavaggio e centrifugare a 10.000 xg per 1 min.
  7. Scarta filtrato dal tubo di raccolta, riportare la colonna al tubo di raccolta e ripetere SPW fase di lavaggio e centrifugazione.
  8. Eliminare filtrato, il ritorno colonna di tubo di raccolta, e centrifugare colonna vuota per 3 min a 10.000 xg per rimuovere l'etanolo residuo.
  9. In un armadio biosicurezza, buttare via coltubo colta e colonna posto in una provetta sterile.
  10. Per eluire il DNA, aggiungere 25 ml di acqua sterile per colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Centrifugare a 10.000 xg per 1 min.
  11. Aggiungere altri 25 ml di acqua sterile in cappa di biosicurezza a colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
  12. Centrifugare a 10.000 xg velocità per 1 min.
  13. In un armadio biosicurezza trasferire intero volume di DNA in una nuova provetta sterile. NOTA: Questo passaggio impedisce la contaminazione dal coperchio aperto durante la centrifugazione.
  14. Aggiungere la sterile, purificato, DNA linearizzato (10 mg) per 400 ml di cytomix sterilizzata per filtrazione.
  15. Contare le celle come descritto nella sezione 6 e raccogliere 5 x10 7 -10 8 cellule per centrifugazione a 800 xg per 15 minuti a temperatura ambiente.
  16. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 450 ml di DNA + cytomix con una pipetta 1 ml sierologica.
  17. Trasferire la soluzione contenente ce LLS, DNA, e cytomix ad una sterile 4 millimetri divario cuvetta e posto cuvetta nella camera di elettroporazione.
  18. Selezionare "decadimento esponenziale" e immettere manualmente le seguenti impostazioni: Tensione: 1.5 kV, Capacità: 25 mF, Resistance: Ω, e Cuvette: 4 mm. Premere impulso. Una volta che il polso, rimuovere cuvetta dalla camera di elettroporazione e tornare al mobile biosicurezza.
  19. In un nuovo beuta sterile, pipetta 10 ml di SDM79. Trasferire le cellule trasformate al pallone con 10 ml di SDM79.
  20. Incubare senza selezione della droga per 24 ore a 27 ° C, 5% di CO 2. Dopo 24 ore, aggiungere G418 (15 mg / ml), igromicina (50 mg / ml), e blasticidin (10 mg / ml). Passare 1 ml di cellule trasformate con la droga in 9 ml di SDM79 con la droga.
  21. Analizzare le cellule quotidianamente come descritto nelle sezioni 6 e 7 Quando le cellule sono fluorescenti, e hanno raggiunto una densità cellulare di 1 x 10 7 / ml, fare stabilates per la conservazione a lungo termine (3.1-3.3).
ve_title "> 3. Fare Stabilates

  1. Per rendere congelamento supporti, aggiungere un volume equivalente di 100% glicerolo a cytomix e filtro sterilizzare.
  2. Aggiungere 200 ml di mezzi di congelamento a 800 ml di cellule (1 x 10 7) in una provetta Microbank ™, mescolare delicatamente per inversione e posto tra due rack di polistirolo e congelare a -80 ° C.
  3. Una volta congelato (~ 24 ore), le cellule di trasferimento per l'azoto liquido. NOTA: E 'importante spostare le celle in LN 2 dopo 24 ore, come una conservazione più lunga a -80 ° C porta ad una diminuzione della vitalità cellulare.

4. Azioni Scongelamento congelati

  1. Rimuovere flacone congelato da -80 ° C e scongelare a temperatura ambiente per circa 10 min.
  2. Pipettare 9 ml di SDM79 con la droga in una nuova boccetta sterile. Aggiungi cellule scongelati a questo fiasco. Passare cellule 1:10 aggiungendo 1 ml di questa coltura a 9 ml di SDM79 in un'altra beuta (concentrazione finale di 1 x 10 5 / ml).
  3. Prima che le cellule raggiungono una densità di 10 7 / ml, iniziare citometro sete saggi di diluizione.

5. citometro Setup

  1. Accendere il citofluorimetro e aprire il programma CFLOW più. NOTA: Prima di eseguire i campioni, i fluidica dovrebbero essere backflush e risciacquati in base alle fasi 5,2-5,7.
  2. Sostituire il tubo di acqua Nanopure in cui il SIP viene memorizzato con un tubo vuoto.
  3. Selezionare il pulsante "controlavaggio".
  4. Una volta backflush, rimuovere provetta da sorseggiare e scarto.
  5. Posizionare una nuova provetta contenente 1 ml di acqua nuova Nanopure sul sorso.
  6. Selezionare un nuovo pozzo in programma CFLOW. Sotto "Limiti Run" impostare il tempo per 2 min. Sotto "Fluidics" selezionare "veloce" e "Run".
  7. Una volta che il limite di tempo di 2 minuti, fare clic sul pulsante "Elimina dati di esempio".

6. conteggio cellulare utilizzando il citometro di flusso

  1. Sostituire l'acqua con il campione da contare. Impostare "Limiti Esegui "per 30 secondi," pneumatica "a" veloce "e quindi selezionare" Esegui ".
  2. Dopo il termine di 30 sec è completa, CFLOW oltre fornirà gli eventi / ml sotto "Ultima esecuzione." Numero di ripetizioni per ogni cultura. NOTA: Prima di cellule raggiungono 1 x 10 7 cellule / ml, procedere con test di diluizione. Le cellule devono essere interrotti dopo un test di diluizione viene completata. Le cellule in coltura per periodi più lunghi perdono la loro capacità di rispondere alle condizioni ambientali.

7 fluorescenza di misura utilizzando il citometro di flusso

  1. Per valutare la fluorescenza, impostare "Limiti Run" a 10.000 eventi, e "pneumatica" per "rallentare". Selezionare "Imposta soglia". Sotto "Threshold Primaria", selezionare "Permanentemente eliminare eventi su", "FSC-H" (nella casella a discesa) e immettere meno di 30.000. Fare clic su "Applica", quindi su "Chiudi".
  2. Selezionare il220, "pulsante in una delle nuove finestre trama e selezionare" Istogramma FSC-A "Dal menu a tendina, selezionare" FL1-A ". NOTA: misure FL1-A fluorescenza a lunghezza d'onda 530 nm.
  3. Selezionare "Esegui" e ripetere per tutte le culture.
  4. Eseguire pulizia soluzione attraverso la linea fluidica per 2 min e acqua per 2 min.

8. diluizione saggi

  1. Passare cellule ad una densità di 1 x 10 5 cellule / ml in 3 ml di SDM79 in un pallone di 25 centimetri 2 cultura e misurare fioritura immediatamente dopo passaggio e poi alle 3 ore e 24 ore.

Analisi dei dati 9.

  1. Selezionare "Analizza" linguetta CFLOW più.
  2. Fare clic apparirà il pulsante "Istogramma" sotto "Crea una nuova trama." Select "FSC-A" e un elenco a discesa. Selezionare il canale "FL1-A."
  3. Evidenziare un bene da analizzare. Selezionare il pulsante "Gate", e disegnare a mano un cancelloper la popolazione di interesse.
  4. Flusso Inoltre fornirà cella "conte" all'interno di questa porta e "% di questo complotto".

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Risultati

In questo sistema, è stato osservato un cambiamento glucosio-dipendente glycosome composizione. Quando le cellule sono coltivate in terreni contenenti glucosio, si osservano due popolazioni; una luminosa e una dim (Figura 2A). Cellule Dim porto glycosomes immaturi, che non hanno importato la PTS2eYFP mentre le cellule luminose ospitano un mix di maturi e immaturi glycosomes 12. Quando il glucosio è presente nei media, mislocalization di glycosome proteine ​​è letale 15,28 e glycoso...

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Discussione

Glycosomes sono,, organelli specifici del parassita dinamiche essenziali. I processi che regolano la biogenesi, la manutenzione, la proliferazione e rimodellamento di questi organelli probabilmente sono bersagli farmacologici che potrebbero essere sfruttati per scopi terapeutici. Nonostante l'elevato potenziale abbondanza di tali bersagli farmacologici, il campo di glycosome biogenesi è rimasta indietro lo studio dei processi simili in altri organismi, prevalentemente a causa della mancanza di un sistema high-throug...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Creative Inquiry Program for Undergraduate Research e dal Calhoun Honors College della Clemson University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdenosinaAvocado Research Chemicals LtdA10781SDM79 Ingrediente
L-AlaninaAvocado Research Chemicals LtdA15804SDM79 Ingrediente
L-ArgininaCalBiochem1820SDM79 Ingrediente
acido p-aminobenzoicoICN Biomedicals102569SDM79 Ingrediente
Soluzione vitaminica basal medium Eagle (100x)SigmaB6891SDM79 Ingrediente
BiotinaFisherBP232-1SDM79 Ingrediente
Cloruro di calcioVWRBDH0224Cytomix
EDTAFisherS311-100Ingrediente Cytomix
Kit di estrazione del gel EZNA OmegaBiotekD2500-01Purificazione del DNA
Siero Fisherdi livello di ricerca03-600-511SDM79 Ingrediente
Acido folicoICN Biomedicals101725SDM79 Ingrediente
Glucosamina HClICN Biomedicals194671SDM79 Ingrediente
GlucosioGIBCO15023-021SDM79 Ingrediente
L-GlutamminaCalBiochem3520SDM79 Ingrediente
GliceroloAcros OrganicsAc15892-0010Mezzi di congelamento
Grazie polvere di mezzi cellulari di insettiGIBCO11300-043SDM79 Ingrediente
HeminMP Biomedicals194025SDM79 Ingrediente
GuanosinaAvocado Research Chemicals LtdA11328SDM79 Ingrediente
HEPESMP Biomedicals194025SDM79 Ingrediente
Clorurodi magnesioFisherBP214-500Ingrediente Cytomix
L-MetioninaFisherBP388-100SDM79 Ingrediente
MEM Aminoacidi (50x)Cellgro25-030-CISDM79 Ingrediente
Miscela NEAA (100x)Lonza13-114ESDM79 Ingrediente
Minimo Essenziale Medium (1x) con L-glutamminaCellgro10-010-CMSDM79 Ingrediente
MOPSFisherBP308-500SDM79 Ingrediente
Biocarbonato di sodioFisherS233-500SDM79 Ingrediente
Penicillina-streptomicina SoluzioneCellgro30-002-CISDM79 Ingrediente
L-FenilalaninaICN Biomedicals102623SDM79 Ingrediente
Cloruro di potassioFisherP217-500Cytomix ingrediente
Fosfato di potassio bibasico anidroFisheerP290-212Ingrediente Cytomix
L-ProlinaFisherBP392-100SDM79 Ingrediente
L-SerinaAcros Organics56-45-1SDM79 Ingrediente
Acido piruvico, salesodico Acros Organics113-24-6SDM79 Ingrediente
L-TaurinaTCI AmericaA0295SDM79 Ingrediente
L-treoninaAcros Organics72-19-5SDM79 Ingrediente
L-tirosinaICN Biomedicals103183SDM79 Ingrediente
E.Z.N.A. Cycle Pure kitOmega BiotekD6492-02Purificazione del DNA
Tampone leganteOmega BiotekPDR041Purificazione del DNA
SPW tampone di lavaggioOmega BiotekPDR045Purificazione del DNA
Gene Pulser XcellBiorad165-2660Trasformazione del tripanosoma
4 mm Cuvette per elettroporazioneVWRTrasformazione del tripanosoma

Riferimenti

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