Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Sommario

Le dinamiche dei glicosomi nei tripanosomi africani sono difficili da studiare con le tradizionali tecniche di biologia cellulare come la microscopia elettronica e a fluorescenza. Come mezzo per osservare il comportamento dinamico degli organelli, un sistema reporter di organelli fluorescenti è stato utilizzato in combinazione con la citometria a flusso per monitorare la dinamica del glicosoma in tempo reale nei parassiti vivi.

Abstract

Trypanosoma brucei è un parassita che causa kinetoplastidi tripanosomiasi umana africana (HAT), o malattia del sonno, e una malattia devastante, nagana, nei bovini ^1. I supplenti parassita tra il sangue del mammifero ospite e la mosca tse-tse vettore. La composizione di molti organelli cellulari cambia in risposta a queste differenti condizioni extracellulari ^2-5.

Glycosomes perossisomi sono altamente specializzati in cui molti degli enzimi coinvolti nella glicolisi sono compartimenti stagni. Composizione cambia Glycosome in maniera evolutiva e regolamentato l'ambiente ^4-11. Attualmente, le tecniche più comuni utilizzate per studiare glycosome dinamiche sono elettroni e microscopia a fluorescenza; tecniche che sono costosi, tempo e lavoro, e non facilmente adattato alle analisi di throughput elevato.

Per superare queste limitazioni, un sistema reporter fluorescente-glycosome inche migliorato proteina fluorescente gialla (EYFP) si fonde a una sequenza di targeting dei perossisomi (PTS2), che dirige la proteina di fusione per glycosomes ^12, è stato istituito. Con l'importazione della proteina di fusione PTS2eYFP, glycosomes diventano fluorescenti. Degrado organello e risultati riciclaggio nella perdita di fluorescenza che può essere misurato mediante citometria a flusso. Un gran numero di cellule (5.000 cellule / sec) possono essere analizzati in tempo reale senza una preparazione del campione come la fissazione e il montaggio. Questo metodo offre un modo rapido di rilevare cambiamenti nella composizione organello in risposta alle mutevoli condizioni ambientali.

Introduzione

Trypanosoma brucei causa la malattia africana sonno negli esseri umani e una malattia devastante, nagana, nei bovini. Farmaci utilizzati nel trattamento di queste malattie sono antiquate ed estremamente tossico, i vaccini non sono disponibili, e il potenziale di sviluppo di resistenza ai farmaci richieda l'ricerca di nuovi bersagli farmacologici ^1.

Durante il suo ciclo di vita, T. brucei, si alterna tra un insetto vettore e ospite mammiferi; due host che presentano molto diversi ambienti in cui il parassita deve sopravvivere. Una serie di cambiamenti metabolici e morfologici si verificano come il parassita....

Protocollo

1. Generale Tripanosoma Zootecnica

1. Pesare solidi per SDM79 preparazione supporti (Tabella 1).
2. Conservare a 4 ° C in 50 ml conica o un sacchetto a chiusura ermetica. NOTA: I reagenti sono stabili per almeno 6 mesi.
3. Scongelare siero fetale bovino (FBS) in un bagnomaria a 37 ° C, e mescolare periodicamente per inversione. NOTA: FBS viene ricevuto dal fornitore come una soluzione sterile. Filtro sterilizzante FBS riduce la sua capacità di sostenere la crescita del parassita.
4. Una volta che l'intera bottiglia è scongelato, il calore inattivare il siero per 30 minuti in un bagnomaria a 56 ° C, mescolando periodic....

Risultati

In questo sistema, è stato osservato un cambiamento glucosio-dipendente glycosome composizione. Quando le cellule sono coltivate in terreni contenenti glucosio, si osservano due popolazioni; una luminosa e una dim (Figura 2A). Cellule Dim porto glycosomes immaturi, che non hanno importato la PTS2eYFP mentre le cellule luminose ospitano un mix di maturi e immaturi glycosomes ^12. Quando il glucosio è presente nei media, mislocalization di glycosome proteine ​​è letale ^15,28 e glycoso.......

Discussione

Glycosomes sono,, organelli specifici del parassita dinamiche essenziali. I processi che regolano la biogenesi, la manutenzione, la proliferazione e rimodellamento di questi organelli probabilmente sono bersagli farmacologici che potrebbero essere sfruttati per scopi terapeutici. Nonostante l'elevato potenziale abbondanza di tali bersagli farmacologici, il campo di glycosome biogenesi è rimasta indietro lo studio dei processi simili in altri organismi, prevalentemente a causa della mancanza di un sistema high-throug.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenosina	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingrediente
L-Alanina	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingrediente
L-Arginina	CalBiochem	1820	SDM79 Ingrediente
acido p-aminobenzoico	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingrediente
Soluzione vitaminica basal medium Eagle (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingrediente
Biotina	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingrediente
Cloruro di calcio	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Ingrediente Cytomix
Kit di estrazione del gel EZNA Omega	Biotek	D2500-01	Purificazione del DNA
Siero Fisher		di livello di ricerca03-600-511	SDM79 Ingrediente
Acido folico	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingrediente
Glucosamina HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingrediente
Glucosio	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingrediente
L-Glutammina	CalBiochem	3520	SDM79 Ingrediente
Glicerolo	Acros Organics	Ac15892-0010	Mezzi di congelamento
Grazie polvere di mezzi cellulari di insetti	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingrediente
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingrediente
Guanosina	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingrediente
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingrediente
Cloruro	di magnesioFisher	BP214-500	Ingrediente Cytomix
L-Metionina	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingrediente
MEM Aminoacidi (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingrediente
Miscela NEAA (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingrediente
Minimo Essenziale Medium (1x) con L-glutammina	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingrediente
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingrediente
Biocarbonato di sodio	Fisher	S233-500	SDM79 Ingrediente
Penicillina-streptomicina Soluzione	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingrediente
L-Fenilalanina	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingrediente
Cloruro di potassio	Fisher	P217-500	Cytomix ingrediente
Fosfato di potassio bibasico anidro	Fisheer	P290-212	Ingrediente Cytomix
L-Prolina	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingrediente
L-Serina	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingrediente
Acido piruvico, sale	sodico Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingrediente
L-Taurina	TCI America	A0295	SDM79 Ingrediente
L-treonina	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingrediente
L-tirosina	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingrediente
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	Purificazione del DNA
Tampone legante	Omega Biotek	PDR041	Purificazione del DNA
SPW tampone di lavaggio	Omega Biotek	PDR045	Purificazione del DNA
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trasformazione del tripanosoma
4 mm Cuvette per elettroporazione	VWR		Trasformazione del tripanosoma