Descriviamo qui il metodo di imaging basato sulla microscopia fluorescente confocale a fibre (FCFM), che fornisce una modalità innovativa per comprendere i fenomeni fisiologici a livello cellulare e subcellulare in soggetti animali.
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Articolo metodologico
Chemioterapia-indotta vascolare Tossicità - in tempo reale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Alcune classi di chemioterapie possono esercitare cambiamenti vascolari acute che possono progredire in condizioni a lungo termine che possono predisporre il paziente ad un aumentato rischio di morbilità vascolare. Tuttavia, anche se l'evidenza clinica di montaggio, vi è una scarsità di chiare studi di tossicità vascolare e quindi l'eziologia di un gruppo eterogeneo di vascolari / disturbi cardiovascolari rimane da chiarire. Inoltre, il meccanismo che può essere alla base della tossicità vascolare può completamente differire dai principi di cardiotossicità indotta da chemioterapia, che è in relazione diretta pregiudizio miociti. Abbiamo stabilito un tempo reale, in vivo piattaforma di imaging molecolare per valutare la potenziale tossicità acuta vascolare di terapie anti-cancro.
Abbiamo creato una piattaforma di in vivo, imaging molecolare ad alta risoluzione nei topi, adatto per la visualizzazione di vasi all'interno di organi ristretti e blo riferimentood navi comprese negli stessi individui, mentre ogni singolo servono come proprio controllo. Pareti dei vasi sanguigni sono stati danneggiati dopo la somministrazione di doxorubicina, che rappresenta un meccanismo unico di tossicità vascolare che può essere il precoce evento lesioni d'organo. Qui, il metodo di microscopia confocale a fluorescenza (FCFM) di imaging basato fibrata è descritto, che fornisce un modo innovativo per comprendere i fenomeni fisiologici a livello cellulare e sub-cellulari in soggetti animali.
Introduzione
Evidenze cliniche indicano che diverse classi di chemioterapie stimolano una varietà di patologie vascolari si manifestano con fenomeno di Raynaud, ipertensione, myocardialinfarction, attacco cerebrovascolare, ed epatica veno-occlusivedisease 1,2. "Farmaci anti-angiogenetici 'accidentale'" è abbastanza nuovo termine, che descrive agenti chemioterapici convenzionali che agiscono come possibili inibitori dell'angiogenesi, anche se non originariamente sviluppati per questo scopo 3-5 ma progettati per eliminare le cellule tumorali imponendo come poco "garanzia danno "alle cellule normali come possibile 3. Diversi chemioterapie sono state implicita come vasculo-sostanze tossiche come osservato negli studi clinici utilizzando biomarcatori sierici. Tra questi sono agenti (quali ciclofosfamide), composti del platino (cisplatino) come e antracicline 1,2,5-7 alchilante.
Complicanze cardiovascolari acute possono verificarsi come Result della tossicità vascolare indotta da chemioterapia. Essi possono progredire in condizioni croniche come l'aterosclerosi e rappresentano il maggior rischio di morbilità vascolare tardi. Eppure, nonostante il montaggio evidenza clinica, vi è una scarsità di studi designati sottolineando il meccanismo di tossicità vascolare e quindi, un'ulteriore delucidazione della patogenesi esatta che infliggono è garantito.
Una sfida importante nel rivelare il meccanismo di tossicità vascolare indotta da chemioterapia deriva dalla complessità di indagare funzione vascolare in vivo. Descriviamo qui una piattaforma ad alta risoluzione in imaging molecolare in vivo nei topi che permette di catturare il flusso di sangue e le caratteristiche delle navi. Questa piattaforma facilita il rilevamento di effetti diretti trattamento indotta vascolari: in tempo reale, nonché loro dopo un periodo di tempo entro gli stessi individui.
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Protocollo
Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale. Cura degli animali è stato secondo le linee guida istituzionali. Topi ICR femminile (7 - 8 settimane di vita; 25 - 30 g) sono stati ospitato in aria condizionata, controllata di luce strutture di animali della Facoltà di Medicina Sackler a Tel-Aviv University. Al termine, gli animali sono stati sacrificati con overdose anestesia.
1. fibrato confocale microscopia a fluorescenza (FCFM) Calibration
- Accendere il dispositivo.
- Collegare la microsonda (mini0 / 30).
- Calibrare il dispositivo secondo le istruzioni del produttore.
2. Mice Preparazione Imaging
- Anestetizzare da una iniezione sottocutanea di entrambi Ketaset (100 mg / kg) e XYL-M2 (6 mg / kg). Verificare il corretto anestesia da insensibilità ai piedi-pizzico.
- Incidere la pelle sotto l'inguine, al fine di rivelare i vasi arteriosi femorali. Mantenere il sito umido con soluzione fisiologica incisione dopo incisione.
- Riscaldare la coda utilizzando un sacchetto (o un guanto) riempita con acqua calda (non troppo caldo al tatto) per circa 30 sec. Preparare un (IV) shunt endovenosa per la somministrazione di destrano FITC (un agente di contrasto) e di una soluzione fisiologica o agente chemioterapico, inserendo un ago (30 G, 1/2 pollice) nella vena della coda e collegamento di una siringa da 1 ml a esso . Assicurarsi che la vena è aperto iniettando soluzione fisiologica.
NOTA: Un'amministrazione IV di FITC destrano (alto peso molecolare, 100 ml, 10 mg / ml; 2.000 kDa) facilita la visualizzazione del microcircolo femorale da FCFM. Doxorubicina (100 ml; 8 mg / kg, Adriamicina) o soluzione salina saranno successivamente somministrati IV nella vena della coda pre-riscaldato. - Posizionare il mouse supinamente su un palco di polistirolo. Fissare il mouse pad e mantenere la posizione con nastro adesivo chirurgico.
NOTA: Il microscopio confocale fibered utilizzato in questo studio è composto da due unità: (1) microsonda (mini0 / 30). (2) unità di scansione laser (LSU-488; 488 nm di lunghezza d'onda).
- Eseguire tutti i time-giri analisi con il nm laser LSU 488.
NOTA: Il rivelatore unità principale rileva il filtrato (500-650 nm) fluorescenza emessa. Le immagini acquisite vengono ricostruite dopo e visualizzate ad una velocità di 12 fotogrammi / sec. - Staccare con attenzione la siringa dall'ago e collegare un nuovo siringa contenente FITC destrano. Somministrare (IV) 100 ml di destrano FITC.
- Spostare la microsonda (mini0 / 30) per un campo di vista adeguato e fissare, seguendo adeguamento l'asse z, in modo da ottenere l'immagine corrispondente. Attendere il segnale iniziale a svanire fino a quando un segnale chiaro e focalizzato è visible.
- Registrazione di un flusso di sangue al basale per un periodo di stabilizzazione a breve (~ 30 sec). Collegare quindi l'ago della siringa un'altra, contenente doxorubicina o soluzione salina. IV amministrare 100 microlitri doxorubicina o soluzione salina.
- Monitorare il flusso di iniezione FITC-destrano continuamente per 20 min. Sul software FCFM-associato, utilizzare il pulsante di diametro sul righello superiore al fine di misurare i vasi sanguigni e classificare come piccole (<15 micron) o grande (> 15 micron).
- Euthanize l'animale con overdose anestesia.
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Risultati
In vivo Imaging continua in tempo reale
L'apparecchiatura di imaging qui utilizzato è ad alta definizione, microscopio confocale fibrata, equipaggiato con una sonda che consente la visualizzazione della vascolarizzazione e la sua risposta a vari stimoli la chemioterapia. Questo metodo è minimamente invasiva poiché sebbene possa facilitare l'imaging di navi profonde o organo, esso richiede una piccola incisione per la sonda. I fasci sonda costituite da decine di migliaia di fibr...
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Discussione
Valutare tossicità vascolare indotta da chemioterapia è difficile a causa della difficoltà nel visualizzare la dinamica del sistema vascolare in risposta ad una stimoli in tempo reale. Numerosi studi clinici hanno implicato che diverse chemioterapie causano danno vascolare diretta, ma il meccanismo e le caratteristiche di questa tossicità resta da chiarire. Abbiamo stabilito un tempo reale, in vivo piattaforma di imaging molecolare per valutare la potenziale tossicità vascolare della chemioterapia in topi compo...
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anestesia generale | Fort Dodge Animal Health, IA, USA e Biove Laboratories, Francia | 100 mg/kg di ketaset e 6 mg/kg di crema | |
| depilatoria | ReckittBenckiser, Bristol, Regno Unito | ||
| 30 G, ago da 1/2 pollice attaccato alla siringa | |||
| destrano FITC (10 mg/ml; MW 2.000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μ l volume |
| Doxorubicina | Teva, Israele | 8 mg/kg, Adriamicina | |
| paclitaxel | Taro, Israele | 1,2 mg/kg, Soluzione | |
| salina |
Riferimenti
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515(2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492(2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
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Ristampe e permessi
