Questo studio presenta una procedura sperimentale dettagliato per misurare le dinamiche di loop di DNA a doppio filamento con singola molecola Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Il protocollo descrive inoltre come estrarre il ciclo di densità di probabilità chiamato il fattore J.
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Articolo metodologico
Studiare Looping DNA a singola molecola FRET
In questo articolo
Sommario
Abstract
Curvatura del DNA a doppia elica (dsDNA) è associato con molti importanti processi biologici quali il riconoscimento DNA-proteine e confezionamento DNA in nucleosomi. Termodinamica di dsDNA curvatura è stata studiata da un metodo chiamato ciclizzazione che si basa sul DNA ligasi di unirsi covalentemente brevi estremità coesive di un dsDNA. Tuttavia, l'efficienza legatura può essere influenzata da molti fattori che non sono legati a dsDNA loop come la struttura del DNA che circonda le estremità appiccicose uniti, e ligasi può anche influenzare il tasso looping apparente attraverso meccanismi quali il legame non specifico. Qui mostriamo come misurare dsDNA cinetica looping senza ligasi rilevando formazione transitoria ciclo DNA mediante FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). molecole di dsDNA sono costruiti utilizzando un protocollo basato su PCR semplice con un paio FRET e un linker biotina. La densità di probabilità loop noto come fattore J viene estratto dal prezzo loop e il tasso di ricottura tra due sezionatoreTed estremità appiccicose. Testando due dsDNAs con curvature diverse intrinseche, mostriamo che il fattore J è sensibile alla forma intrinseca del dsDNA.
Introduzione
Comprendere le proprietà meccaniche di dsDNA è di fondamentale importanza nelle scienze di base e applicazioni di ingegneria. La struttura di dsDNA è più complicato di una scala elicoidale dritto, perché angoli di rollio, inclinazione e torsione tra coppie di basi successive possono variare con la sequenza. Fluttuazioni termiche possono causare dsDNA di sottoporsi a diversi modi di fluttuazioni conformazionali come la flessione, torsione e stretching. Transizioni come fusione e attorcigliamenti possono verificarsi anche in condizioni estreme.
Tra questi movimenti, dsDNA flessione ha l'impatto biologico più evidente 1. dsDNA....
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Protocollo
1. Preparazione dsDNA campione
- Progettare DNA curve globalmente ripetendo una sequenza di 10-mer. Ad esempio, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'è un DNA curvo 186-bp, dove X è una base supplementare casuale e la sequenza fiancheggiante la sequenza ripetuta 10-mer sono sequenze adattatore.
NOTA:. In questo esempio 15 sono stati scelti due 10-mers con preferenze opposte alla formazione dei nucleosomi sulla base di una larga scala studio occupazione nucleosomi da Kaplan et al. Poiché la ripetizione dell'elica di dsDNA è vici....
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Risultati
Molecole di DNA utilizzati per lo studio loop consistono in una regione duplex di sequenza e lunghezza variabile e sporgenze a singolo filamento che sono complementari tra loro. Le sporgenze, che sono lunghe 7-base, possono ricombinarsi tra loro per acquisire lo stato in loop. Ogni sbalzo contiene sia Cy3 o Cy5 che è collegato nella spina dorsale del DNA attraverso la chimica amidite. Il Cy5-sporgenza è anche collegata con biotina-TEG (15-atomo Tetra-glicole etilenico distanziale) per l'immobilizzazione di superfici.......
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Discussione
Un semplice test single-molecule basato su FRET è stato usato per studiare la cinetica di loop di DNA di diverse forme intrinseche. DNA curve possono essere preparati ripetendo una sequenza di 10-mer in fase con il periodo elicoidale di 10,5 bp, e le curvature possono essere stimati usando PAGE. Questi dsDNAs sono progettati con le estremità adesive per permettere la stabilizzazione ciclo transitorio. Abbiamo estratto il tasso loop dalla crescita esponenziale del numero di molecole in loop nel tempo. La costante di velo.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo James Waters, Gable Wadsworth e Bo Broadwater per criticamente la lettura del manoscritto. Ringraziamo anche quattro revisori anonimi per fornire commenti utili. Noi riconosciamo il sostegno finanziario Georgia Institute of Technology, il Burroughs Wellcome Fund Award Career l'interfaccia scientifico, e la borsa di rete di ricerca studente dalla NSF Fisica dei sistemi viventi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di estratto di DNA FRAG piccolo-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrilammide soluzione al 40% 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Soluzione di bis-acrilammide al 2% (p/v) 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1.000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini sistema PAGE verticale | VWR | 89032-300 | |
| Filtro per siringa 0,2 μ m CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | quencher a tripletto di stato |
| Acido protocatechiico (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | sistema di evacuazione dell'ossigeno |
| Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | sistema di evacuazione dell'ossigeno |
| mPEG-silano, MW 2.000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotina-PEG-Silano, MW 3.400 | Laysan Bio | Biotina-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Proteina legante la biotina | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR Kit di estrazione di frammenti di DNA | IBI Scientific | IB47020 | |
| Vetrini per microscopio in vetro piano di alta qualità | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro vetro di copertura, rettangolare, n. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Refrigeratore/riscaldatore a ricircolo | Scientific | Controllo della temperatura | |
| Obiettivo Collare di raffreddamento | Bioptechs | 150303 | controllo della temperatura |
| KMI53 Biological Stadio di misura micrometrico | Semprex | KMI53 | |
| Laser DPSS ad alte prestazioni 532 nm 50 mW | Ottica | Edmund NT66-968 | Eccitazione Cy3 |
| CUBE Fibra Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fibra, Connettore FC/APC | Eccitazione | coerente 1139604 | Cy5 |
| 650 nm Beamsplitter dicroico BrightLine | Semrock | FF650-Di01-25x36 | dicroico |
| a spaccoCombinatore di fasci LaserMUX, riflette 514.5, 532, & Laser da 543,5 nm, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | che combina |
| il filtro a fluorescenza dicroico Brightline 593/40 | di emissione Cy3 | Semrock | FF01-593/40-25 |
| Filtro passa-lungo EdgeBasic LWP da 635 nm, filtro | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 telaio per microscopio invertito | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Olio TIRF | Olympus | ||
| Olio da immersione tipo-F per microscopia a fluorescenza | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diametro 45° Obiettivo dell'asta rivestito in alluminio | Edmund optics | 54-092 | specchio in miniatura |
| 1/4" corsa monoasse traslazione stadio | Thorlabs | MS-1 | traslazione di specchio in miniatura |
| Ø Doppietto acromatico da 1", ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | lente di messa a fuoco |
| Fessura meccanica regolabile | Thorlabs | VA100 | |
| Specchio dielettrico | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø Doppietto acromatico da 1", f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | obiettivo relè |
| Supporto per obiettivo per Ø 1" Ottica | Thorlabs | LMR1 | |
| Filtro Dicroico Supporto | Thorlabs | FFM1 | |
| Gabbia Fissa Cubo Piattaforma | Thorlabs | B3C | |
| Supporto Cinematico per Ø Ottica 1" | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Lente piano-convessa, Ø 1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | lente di collimazione |
| N-BK7 Lente piano-convessa, Ø 6,0 mm, f = 15 mm | Lente telescopica Thorlabs | LA1222-A | |
| N-BK7 Lente piano-convessa, Ø 6,0 mm, f = 150 mm | Obiettivo telescopico Thorlabs | LA1433-A |
Riferimenti
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales prob....
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Ristampe e permessi
