Multi-step di preparazione tecnica per recuperare più classi di composti metabolita di approfondita analisi e Metabolomica informativo

Sommario

L'affidabilità dei risultati in esperimenti di metabolomica dipende l'efficacia e la riproducibilità della preparazione del campione. Descritto è un metodo rigoroso e approfondita che consente l'estrazione di metaboliti da fluidi biologici con possibilità di analizzare successivamente fino a migliaia di composti, o solo le classi di composti di interesse.

Abstract

Metabolomica è un settore emergente che consente la profilazione dei campioni da organismi viventi, al fine di ottenere la comprensione dei processi biologici. Un aspetto fondamentale della metabolomica è la preparazione del campione per cui le tecniche incoerenti generano risultati inaffidabili. Questa tecnica comprende la precipitazione delle proteine, estrazione liquido-liquido, e l'estrazione in fase solida come mezzo di frazionamento metaboliti in quattro classi distinte. Migliorata l'arricchimento di molecole a basso abbondanza con un conseguente aumento della sensibilità si ottiene, e in ultima analisi, l'identificazione più sicuri di molecole. Questa tecnica è stata applicata a plasma, fluido di lavaggio broncoalveolare, e campioni di liquido cerebrospinale con volumi a partire da 50 microlitri. I campioni possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle; per esempio, il pellet risultante dalla precipitazione delle proteine ​​possono essere memorizzati per una successiva analisi. Il supernatante dal fatto che la fase subisce estrazione liquido-liquido conacqua e forte solvente organico per separare i composti idrofili e idrofobi. Una volta frazionata, lo strato idrofilo può essere elaborato per una successiva analisi o scartato se non necessario. La frazione idrofoba è ulteriormente trattata con una serie di solventi durante tre fasi di estrazione in fase solida per separare in acidi grassi, lipidi neutri e fosfolipidi. Ciò consente al tecnico la possibilità di scegliere quale classe di composti è preferito per l'analisi. Essa aiuta anche nella identificazione del metabolita più affidabile dal momento che una certa conoscenza della esistenza classe chimica.

Introduzione

Reazioni biologiche generano metaboliti come prodotti finali di processi cellulari. Metabolomica è una raccolta di tutti i composti presenti in un organismo come risultato di questi processi. Esso fornisce un quadro della fisiologia delle cellule e riflette la risposta di un organismo a stimoli esterni o interni ^{1, 2.} Tali stimoli possono essere ambientali, tossicologici, farmacologici, dietetici, ormonali, o correlati alla malattia. Molte applicazioni metabolomica hanno e sono attualmente allo studio da parte dei ricercatori e comprendono scoperta di biomarcatori ^{3, 4} studi di nutrizione, scienze alimentari ⁵ e droga test ^6. Indipendentemente dall'applicazione, variazioni nei dati, contaminazione e presenza di falsi positivi devono essere ridotte o preferibilmente rimosso. Nella scoperta biomarker o in caso di determinazione delle differenze tra un controllo e un gruppo malattia, o studiare gli effetti di farmaci su soggetti, una f biologicoLUID viene scelta in base alle domande poste e le tipologie di metaboliti in fase di studio ^7. Ad esempio, se studiando gli effetti immediati di un farmaco per via inalatoria sui polmoni degli asmatici, poi esplorando metaboliti nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) campioni prima e dopo la somministrazione sarebbe preferenziale. Per garantire che osservate differenze sono dovute alla variazione biologica effettivo anziché improprio tecnica di preparazione del campione, protocollo di laboratorio standardizzato e coerente è essenziale ^8. Informazioni sul campione deve essere attentamente documentato per garantire che variabili come fluido biologico, ceppo animali, tempo di campionamento, età dei soggetti, di genere, per citarne alcuni, sono tutti considerati e presi in considerazione nello studio ^9. Inoltre, per ridurre la possibilità di contaminazione o falsi positivi, si consiglia di sbozzati solvente e sbozzati strumenti analizzati ^10.

Per questo protocollo, il termine metabolismo "lites "saranno utilizzati per riferirsi ai composti reali identificati. Utilizzando il software vendor, un algoritmo iniziale picco constatazione è utilizzato per rilevare i picchi spettrali di massa. Questi picchi sono allineati basato su massa e carica (m / z) rapporto e ritenzione tempo. Un secondo algoritmo viene poi usato per combinare più funzioni in un singolo composto. Questo include caratteristiche come sodio, potassio, ammonio o addotti nella modalità di ionizzazione positiva, e cloruro in modalità ioni negativi. Opzioni aggiuntive del software includono caratteristiche come dimeri e altri addotti. Utilizzando glucosio come esempio, con picchi a 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH _4), e 203,05,261 mila m / z (M + Na), ci sarebbero tre picchi dello stesso composti utilizzando il primo algoritmo. Tuttavia quando il secondo algoritmo, che si basa sulla formula molecolare, viene applicato questi tre addotti diventano raggruppate causando un composto.

I metaboliti possono causare interferenze all'interno di samples causa della complessità dei composti presenti. La presenza di migliaia di metaboliti in uno cause del campione segnalano in particolare la soppressione dei metaboliti abbondanza inferiori. Esempio di pulitura per rimuovere le proteine ​​interferenti, e successiva separazione in più frazioni riduce la complessità del campione migliorando così la separazione dei picchi, aumentando la risoluzione, e riducendo metabolita coelution. Pertanto, è necessaria la pulizia del campione perfezionata separazione dei composti. E 'stato dimostrato che solo precipitazione proteica, anche con l'uso di vari solventi di polarità, non può risolvere questo problema ^{11, 12.} Tuttavia, combinando un forte solvente organico come MTBE con una successiva fase di frazionamento, la copertura metabolita aumenta. Yang et al. ¹² hanno riportato un aumento dei metaboliti da 1.851 o 2.073 con metanolo o metanolo, etanolo alone di precipitazione, rispettivamente, a 3.806 metaboliti mediante estrazione con solvente MTBE combinataseguita da estrazione in fase solida (SPE) passi. Sovrapposizione metabolita ridotti, migliore separazione dei picchi e maggiore abbondanza metabolita è stata osservata con questo metodo.

Contaminazione da non-metaboliti, come i polimeri, può derivare dalla raccolta del campione, solventi, o il rumore dello strumento, e può comportare la soppressione di metaboliti potenzialmente significative del segnale. Si raccomanda che il tecnico (s) e coloro che raccolgono i campioni prima della preparazione del campione coerente utilizzare la stessa marca, tipo e dimensione di fiale di raccolta del campione, puntali e eventuali altri tubi utilizzati durante la raccolta e la preparazione dei campioni. Questo permette l'analista dati per avere piena fiducia che i cambiamenti osservati sono reali e non a causa delle differenze di fondo provenienti da altre fonti. L'efficacia del trattamento, variazioni tra malattie e gruppi di controllo, o qualsiasi altra analisi metaboliche possono essere esaminati con maggiore fiducia.

Il method discusso qui si concentra sul campione metodi di preparazione combinati ^13-15 che possono essere applicati al plasma, BALF, o nel liquido cerebrospinale (CSF) campioni per non mirato profiling metabolico per cromatografia-spettrometria di massa liquida (LCMS) analisi basata. Entrambi cromatografia liquida (LC) e cromatografia liquida ultra alta prestazione (UPLC) tecniche di separazione possono essere accoppiati a MS successivamente a tale procedura. Molti ricercatori che effettuano studi metabolomic utilizzano una tecnica di precipitazione delle proteine ​​e / o una tecnica di estrazione liquido-liquido ^{16, 17.} Nei nostri studi, questo ha portato ad essere rilevato un minor numero di metaboliti. Il metodo qui descritto ¹² consente il rilevamento e l'identificazione di un maggior numero di metaboliti, che coprono una vasta gamma di metabolome. Tale incremento è dovuto alla maggiore purezza dei campioni e ridotti effetti matrice causati dalla prima separazione delle classi metaboliti.

Un prot inizialeein fase di precipitazione viene eseguita utilizzando metanolo freddo (MeOH) per rimuovere proteine ​​dal campione. Estrazione liquido-liquido (LLE) usando metil tert-butil etere (MTBE) e acqua viene utilizzata per separare i composti idrofili e idrofobi. Quindi viene eseguita l'estrazione in fase solida (SPE) sullo strato idrofobo per separare i composti idrofobici in tre classi - acidi grassi, lipidi neutri e fosfolipidi. Le frazioni idrofobe vengono ricostituiti in metanolo 100%, mentre la frazione idrofila viene ricostituito in 5% acetonitrile in acqua. L'estrazione in fase solida (SPE) passo fornisce un ulteriore livello di fiducia nei risultati, riducendo il numero di composti che coeluiscono che sarebbero altrimenti presenti aveva una fase di separazione non è stata eseguita.

Protocollo

1. Considerazioni iniziali, Preparazione di strumenti e standard

1. Utilizzare sempre il vetro per la conservazione (tubi di coltura in vetro, flaconi autocampionatori vetro) o il trasferimento (pipette di vetro), lipidi e solventi organici.
2. Minimizzare l'esposizione di tutti i campioni di lipidi e gli standard in aria. Seal politetrafluoroetilene (PTFE) tappi ermeticamente per evitare l'esposizione all'aria e l'evaporazione. Risospendere Immediatamente lipidi secchi nella prossima solvente o tenerli in un flusso costante di azoto.
3. Utilizzare 100 ml di campione. Nei casi in cui più (o meno) Il campione è disponibile, regolare i volumi di conseguenza. Tuttavia, durante il frazionamento dei lipidi nella colonna NH ₂ SPE, ha dichiarato volumi devono rimanere come indicato.
4. Accendere centrifuga ea 0 ° C prima di iniziare la preparazione del campione.
5. Questa tecnica utilizza molti solventi volatili in modo da tenere tutti i solventi innevate durante la preparazione del campione.
6. Preparare due tipi di standard per raccomandazione.
7. Preparare un controllo negativo composto da spillo-in standard di tutti a concentrazione costante. Questo è drogata in tutti i campioni così come un campione composito che viene utilizzato come un lotto QC (campione riunito spillo utilizzato per monitorare campione preparato riproducibilità in giorni separati) e strumento QC (spillo campioni compositi preparati in precedenza, sub-aliquotati e usati per monitorare strumento condizioni / oscillazioni durante l'analisi e in giorni separati).
   1. Preparare controlli positivi a 1x, 2x, 4x e picchi normali. I controlli positivi vengono aggiunti a tutti i campioni così come un campione di plasma riunite e sono utilizzati come composti di controllo di qualità per entrambe le fasi di preparazione del campione e fasi di analisi strumentale analizzare ed identificare le differenze cambio piega durante l'analisi dei dati per garantire che tutti gli aspetti del preparazione e l'analisi strumentali sono state eseguite correttamente.
8. Norme conservare a -20 ° C e conservare i campioni a -80 ° C. Alcuni supporto internoARDS che sono inclini al degrado successivo stoccaggio a lungo termine devono essere conservati a -80 ° C.
9. Questa procedura richiede l'uso di solventi nocivi, infiammabili o volatili quali MTBE. Eseguire tutti i passaggi in una cappa aspirante.

2. Standard interni

1. Scegliere standard interni (ISTD) sulla base di singoli progetti e il loro disegno sperimentale specifico. Per biofluids come il plasma, BALF, o nelle urine, ISTDS marcati con isotopi che sono di natura simile a quelli trovati biologicamente in questi campioni sarebbe l'ideale. Questi includono ma non sono limitati a aminoacidi, ormoni o lipidi. Per i campioni di piante metabolomica, potrebbero essere utilizzati standard etichettati come i flavonoidi, carotenoidi o. Lo stesso vale per altri studi di metabolomica cui il ricercatore deve scegliere uno standard interno, che è rappresentativo del tipo di campione analizzato.
2. Assicurarsi che la ISTD prescelto copre una vasta gamma di cromatogramma; ad esempio se tegli tempo di acquisizione è di 20 minuti, norme che eluiscono ogni 5 min potrebbero essere utilizzati.
3. Creare soluzioni archivi idrofili a 2 mg / ml utilizzando una varietà di standard marcati con isotopi e / o altri composti polari che sono esogeni al campione analizzato. Da ciascuna soluzione madre, creare una soluzione 1:1 metanolo: acqua con tutti gli standard ad una concentrazione finale di 25 mg / ml creatinina-D _3, 100 pg / ml lisina-D _4, e 200 mcg / ml valina-D ₈ .
4. Creare soluzioni archivi idrofobe utilizzando una varietà di standard marcati con isotopi e / o altri composti non polari che sono esogeni al campione da analizzare; concentrazioni di archivi di 17:00 acidi grassi (4 mg / ml), 19:01 acido grasso (4 mg / ml), 17:00 ceramide (2 mg / ml), 17:00 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), e testosterone-D ₂ (1 mg / ml). Da ogni stock, creare una soluzione in 01:01 cloroformio: metanolo a tutti gli standard ad una concentrazione finale di 50ug / ml 17:00 ceramide, 100 pg / ml 15:00 PC, 100 pg / ml testosterone-D _2, 200 ug / ml 17:00 acidi grassi, 200 mg / ml 19:01 acido grasso, e 200 mg / ml 17:00 PE nel mix standard.
5. Verificare il grado di ionizzazione di ogni livello prima del tempo utilizzando almeno cinque concentrazioni diverse per ogni standard per determinare il limite di rilevazione e la linearità dello strumento per questi composti. La concentrazione della soluzione madre per ogni singolo principio varierà a seconda del disegno sperimentale, e la concentrazione di ciascuno standard nello standard spillo combinata può variare da 20 mg / ml a 2 mg / ml a seconda di quanto bene si ionizzano.
6. Creare un mix picco di controlli positivi e aggiungerli ai campioni a 1x, 2x, 4x o livelli di concentrazione di monitorare quantitativamente la forza della preparazione del campione e l'esattezza dei dati strumentali. Concentrazione finale di controlli positivi puòessere: 2 mg / ml di D-glucosio, 100 pg / ml alanina-D _3, 200 mg / ml di acido metilmalonico-D _3, 20 ug / ml trigliceridi _D-5, e / o altri standard idrofobe e idrofile. Regolare le concentrazioni standard basati sulla sensibilità della strumentazione MS e HPLC utilizzato per l'analisi.

3. Protein Precipitation

1. Scongelare i campioni a RT e Spike 10 ml di ISTD ad ogni campione come descritto di seguito.
2. Spike 10 ml di entrambe le soluzioni standard idrofili e idrofobi (creati dal magazzino in passi 2.3 e 2.4) per ogni campione. Regolare le concentrazioni standard come necessarie in base alla sensibilità della strumentazione MS e HPLC usata per l'analisi
   1. Spike 10 ml di entrambi 1x, 2x o 4x soluzione di controllo positivo (creato dal magazzino al punto 2.6) per ogni campione. Regolare le concentrazioni standard come necessarie in base alla sensibilità della MS e HPLC strumentazione utilizzata per l'analisi
   2. Vortex ogni campione per 10 secondi prima della fase di precipitazione delle proteine
3. Aggiungere 400 ml di metanolo ghiaccio freddo (conservati a -20 ° C) per ogni campione.
4. Vortex per 10 secondi per provetta.
5. Centrifugare a 0 ° C per 15 min a 18.000 x g.
6. Trasferire tutto il surnatante in una nuova provetta di coltura di vetro, e quindi asciugare sotto N _2.
7. Se l'analisi della frazione proteica pellet, procedere ai passaggi 3,8-3,11. Se non analizzare il pellet di proteine, passare alla sezione 4.
   Nota: Il pellet proteina può contenere composti ad elevata idrofobicità che sarebbe utile quando si eseguono gli studi di droga ^18, analizza alimentare che coinvolge flavonoidi idrofobi ¹⁹ o studi di metabolomica relativi alle malattie in cui i composti idrofobici molto accumulano, come neuronali ceroid-lipofuscinoses ²⁰ e lisosomiale da accumulo di lipidi malattie ^21.
8. Aggiungere 1 ml di MTBE ategli bianco (o bianco sporco) proteina pellet, vortex per 30 sec per provetta, quindi si centrifuga a 0 ° C per 15 min a 18.000 x g. Decantare lo strato MTBE in un tubo di vetro cultura.
   Questo è un passo fondamentale in quanto gli errori qui drasticamente influenzare i risultati (vedi Figura 5 a risultati rappresentativi).
   1. Coerentemente aspirare la stessa quantità di MTBE per tutti i campioni in quanto le dimensioni del pellet varierà tra campioni. Pertanto, se solo 900 microlitri possono essere decantato per il campione con la minor quantità di surnatante, poi decantare 900 microlitri per tutti i campioni.
9. Ripetere passo 3.9, e unire lo strato organico alla stessa provetta di coltura vetro preparato al punto 3.7.
10. Campioni secchi da N ₂ di mandata e risospendere in 200 ml di 01:01 cloroformio: metanolo. Vortex brevemente.
11. Trasferire in un tubo da centrifuga. Centrifugare a 0 ° C per 15 minuti a 18.000 xg, poi il trasferimento surnatante per campionatore automatico flaconcini con tappo a vite con vetropipette.

4. Estrazione liquido-liquido

1. Usando una pipetta di vetro, aggiungere 3 ml di MTBE al metanolo secco residuo (dalla sezione 3, punto 6), vortice 30 sec, aggiungere 750 ml di acqua, poi vortice 10 sec per provetta.
2. Spin ~ 200 xg per 10 min in una centrifuga a RT.
3. Aspirare 2,5 ml dello strato MTBE (senza acqua) e trasferirla in una provetta pulita cultura del vetro.
   Nota: Questo è un passo fondamentale in quanto le differenze qui sarà influenzare i risultati. 2,5 ml di MTBE vanno attentamente decantato dallo strato superiore perché permette un volume fisso di decantare senza pipettaggio lo strato acquoso sottostante. Se il volume del campione all'inizio dell'esperimento era inferiore ai 100 microlitri indicati per questo metodo, ridimensionare il volume di MTBE per riflettere proporzionalmente questo volume del campione iniziale.
4. Aggiungere 3 ml MTBE alla parte restante acqua del campione, e vortice 10 sec per provetta.
5. Spin ~ 200xg per 10 min in centrifugare a RT.
6. Aspirare 3 ml di MTBE (senza acqua) e si combinano con il tubo MTBE.
7. Concentrare lo strato acquoso residuo mediante essiccazione sotto N _2.
8. Re-sospendere residuo in 100 ml di acqua.
9. Aggiungere 400 ml di ghiaccio MeOH freddo al tubo di cultura del vetro, vortice brevemente, e poi il trasferimento a provetta.
10. Lasciare a -80 ° C per 20-30 min. Spin a 0 ° C per 15 min a 18.000 x g.
    Nota: Si consiglia di posizionare l'intero rack campione in una -80 ° C freezer in quanto questo permetterà a qualsiasi proteina residua precipitare nel metanolo. Se un -80 ° C congelatore non è disponibile, altre opzioni sono: memorizzazione a -20 ° C, ponendo i campioni in ghiaccio secco, o mantenerli in un secchio di ghiaccio. È importante conservare costantemente i campioni in un ambiente freddo e alla stessa temperatura per consentire la precipitazione.
11. Aspirare 450 ml di surnatante e trasferimento auna provetta pulita. Asciugare completamente nel vuoto concentratore centrifugo a non più di 45 ° C. (Ci vogliono circa 1-2 ore).
12. Risospendere surnatante essiccato in 200 ml di 5% acetonitrile / acqua. Vortex brevemente. Congelare a -80 ° C.

5. Estrazione in fase solida

1. Essiccare la frazione MTBE sotto azoto a 35 ° C con un buon flusso di azoto (circa 10-15 min).
2. Quando completamente asciutto, fermare il flusso di azoto e rapidamente risospendere in 1 ml di cloroformio (CHCl ₃₎ usando una pipetta di vetro. Vortex brevemente.
   Nota: Solventi come CHCl ₃ hanno una bassa viscosità. Durante pipettaggio, bassa tensione superficiale provoca la perdita di solvente dalla pipetta. Si raccomanda che la punta della pipetta essere prewet almeno due volte per raggiungere l'equilibrio tra il solvente stati pipettati e lo spazio nella pipetta. Una siringa a tenuta di gas può anche essere utilizzato se disponibile.
3. Impostare un collettore a vuoto SPE e NH ₂ Colonne SPE per frazionamento.
4. Campioni riscaldare a TA e tenere sempre sospesi in un flusso costante di N _2. Riscaldamento a RT permetterà lipidi risospensione e l'azoto impedisce l'ossidazione e la polimerizzazione dei lipidi.
5. Lavare e condizioni SPE 2x cartuccia con 400 microlitri esano. Smaltire i rifiuti e sostituirlo con il nuovo tubo di raccolta di vetro.
6. Aggiungere il campione alla colonna SPE, raccogliere il flusso attraverso in tubi di vetro.
7. Con pipetta di vetro aggiungere 1 ml di 02:01 CHCl _3: IPA, raccogliere il flusso attraverso in tubi di vetro stesse (questa è la frazione neutra).
8. Asciugare la frazione neutra sotto N ₂ per ridurre al minimo l'ossidazione (dura circa 10-15 minuti).
9. Con pipetta di vetro aggiunge 1 ml di acido acetico 5% in etere dietilico, raccogliere fluire attraverso nuovi tubi di vetro (questa è la frazione di acidi grassi).
10. Asciugare la frazione degli acidi grassi in N ₂ per ridurre al minimo l'ossidazione (dura circa 10-15 minuti).
11. Utilizzare punte di plastica per aggiungere 800 &# 181; l di metanolo a cartuccia SPE, e raccogliere a passaggio di flusso 15 provette coniche plastica ml (questa è la frazione fosfolipidica).
12. Trasferimento frazione fosfolipidica a 1,5 ml provette da centrifuga. Essiccare i campioni con un vuoto concentratore centrifugo a 45 ° C (dura circa 1-1,5 ore).
13. Risospendere ciascuno dei campioni delle tre frazioni in 200 ml di metanolo al 100%, vortice, e il trasferimento di autocampionatore fiale con tappo a vite per la conservazione.

6. Campione Condizioni di stoccaggio

1. Conservare tutti i campioni a -80 ° C fino al momento dell'analisi strumento.
   Nota: i campioni d'estrazione, ricostituiti in solvente organico possono essere conservati a -20 ° C. Tuttavia questo non è raccomandato in quanto potenziali metaboliti di interesse si degradano a questa temperatura. Conservazione in azoto liquido non è raccomandato anche come gli investigatori hanno segnalato problemi di contaminazione, sono necessari fiale particolari di conservazione, e non vi è la mancanza di omogeneità nella cau camera dicantare ampie fluttuazioni di temperatura.
2. Se volumi di campione sono piccole (<100 ml), utilizzare inserti nelle fiale per evitare l'evaporazione del solvente nello spazio di testa durante la conservazione.
3. Evitare di congelamento-scongelamento dei campioni. Scongelare i campioni una sola volta, proprio prima analisi dello strumento. Ripetuti freeze-disgelo provocano il degrado del campione.

7. Cromatografia liquida Condizioni

1. Utilizzare un C-18 2,1 millimetri x 50 mm (1,8 micron) colonna analitica con un C-18 2,1 millimetri x 12,5 millimetri (5 micron) colonna di guardia per analizzare la frazione idrofoba.
2. Impostare la temperatura campionatore automatico a 4   ° C, la temperatura della colonna a 60   ° C, il volume di iniezione di 2 microlitri e la portata di 0,25 ml / min.
3. Utilizzare 0,1% di acido formico in acqua per la fase mobile A e 0,1% di acido formico in isopropanolo: acetonitrile: acqua (60:36:4) per fase mobile B.
4. Eseguire il seguente profilo gradiente di eluizione: Avviare unt 30% B, e aumento al 70% B da 0 a 1 min, poi aumentare fino al 100% B da 1 a 15 min e mantengono per 5 minuti, seguiti da 5 min 10% B lavaggio e 5 min alberino di esecuzione.
5. Utilizzare un HILIC 2,1 millimetri x 50 mm (2,6 micron) colonna analitica con una colonna di protezione per analizzare la frazione idrofila.
6. Impostare la temperatura campionatore automatico a 4   ° C, la temperatura della colonna a 20   ° C, il volume di iniezione di 2 microlitri e la portata di 0,5 ml / min.
7. Utilizzare 50% acetonitrile in acetato di ammonio 10 mM, pH 5,8 per fase mobile A, e 90% acetonitrile in 10 mM acetato di ammonio a pH 5,8 per la fase mobile B.
8. Eseguire il seguente profilo di eluizione in gradiente: Inizia a 100% B da 0 a 2 min, poi diminuire al 50% B da 2 a 15 minuti, seguiti da 5 min 0% B lavaggio e 10 min alberino di esecuzione.

Risultati

L'intera tecnica di preparazione del campione è stata eseguita come descritto sopra e gli aspetti più importanti e / o pertinenti sono presentati di seguito. Standard interni idrofili e idrofobi sono stati trovate nei campioni di plasma pool di effettuare confronti diretti delle norme interne e abbondanze metaboliti endogeni utilizzando vari metodi di estrazione. Cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) dati sono stati analizzati utilizzando il software qualitativa e quantitativa e provocato eccellente recupero e la separazione di entrambi i composti endogeni e standard interni. Figura 1 dimostra l'efficacia del metodo MTBE-SPE ad estrarre entrambi gli standard lipidici (A) e composti endogeni (B).

Nel complesso, migliore estrazione e la copertura dei metaboliti sono stati ottenuti rispetto ad altri metodi quali estrazione metanolo, o 'solo MTBE' estrazione quando il numero ofunzioni f è stato confrontato utilizzando il software qualitativa e quantitativa seguente analisi LC-MS. Ad esempio, utilizzando solo l'estrazione metanolo, la variazione di creatinina _D-3 è stato del 15,2%. Tuttavia, con MTBE LLE, questa è stata ridotta a 1,04% CV. Utilizzando MTBE, la riproducibilità dei lipidi e composti acquosi erano <8% e <5%, rispettivamente, rispetto ad una semplice estrazione metanolo che ha provocato grande variazione del 29% e del 15% rispettivamente per i lipidi e composti acquosi. Gli standard interni utilizzati per monitorare recuperi lipidi - testosterone-D _2, C17 ceramide, 15:00 PC e 17:00 PE aumentata rispettivamente del 26%, 200%, 100%, 400% rispetto all'utilizzo di metanolo da solo. Sono stati rilevati aumenti di giudizio per le norme interne di acidi grassi e fosfatidilcoline e metaboliti endogeni phosphotidylethanolamine. Altri metaboliti endogeni come sphingosines, ceramidi, diacilgliceroli, trigliceridi, colesterolo e sfingomielina erano o non rilevateutilizzando metanolo o sono stati rilevati a livelli trascurabili. Tuttavia questi lipidi endogeni sono stati facilmente individuati mediante estrazione MTBE.

Nella nostra analisi confrontando protocolli standard, sono stati ottenuti i seguenti risultati: Metanolo precipitazione alone provocato 1.851 metaboliti, metanolo-precipitazione con etanolo diede 2.073 metaboliti, MTBE con estrazione liquido-liquido diede 3.125, e MTBE con liquido-liquido e l'estrazione in fase solida recuperata 3806 metaboliti. Quindi questo approccio si traduce in un maggior numero di metaboliti essere estratti, molto probabilmente a causa della soppressione ionica ridotti e dei campioni puliti prima di LC-MS.

La Figura 2 mostra l'efficienza nel separare i metaboliti idrofobici nelle rispettive classi chimiche per l'identificazione del metabolita più sicuri. C'è sovrapposizione minima dei composti identificati nelle tre frazioni lipidiche seguenti SPE. A sostegno, la figura 3 mostrail recupero degli standard interni dimostrano che ISTD di stati eluiti nella frazione relativa alla loro classe chimica.

Campioni di controllo di qualità sono utilizzati per valutare la qualità della preparazione del campione, per determinare eventuali lotti quando più giorni di analisi sono necessari per un grande insieme di esempio, e per monitorare strumento riproducibilità. Cromatogrammi vengono esaminate per garantire che le norme a spillo-in sono superiori del 90% recuperato con l'errore di massa inferiore a ± finestra temporale 3 ppm e la conservazione inferiore a ± 5%. Se non vengono soddisfatti questi criteri, i risultati vengono scartati ed i campioni sono rianalizzati. In un caso di effetti lotti per cui uno spostamento ritenzione è osservata per un lotto, il software di analisi dei dati può correggere questo. Un lotto precedentemente preparato dei campioni di plasma pool ha subito la preparazione del campione. Le frazioni sono state poi sub-aliquotati in fiale della campionatrice automatica e conservati a -80 ° C per l'uso in strumento di monitoraggio condizionizioni di tutto ogni analisi del campione. tabella 1 mostra i risultati di questi standard spike-in. La frazione modalità ionizzazione negativa acido grasso (dati non mostrati in tabella) non è stato utilizzato per l'analisi perché il CV% delle norme spike-in per il campione QC era superiore al 10%. Il set di dati per quella frazione motivo è stata scartata e lo strumento controllato e mantenuto. Tabella 2 mostra i risultati di metaboliti endogeni nei campioni successivi tre diversi giorni di preparazione del campione e iniezioni strumento triplicato. I metaboliti endogeni nella preparazione campioni QC del campione sono riproducibili, a significare la forza della preparazione del campione e la riproducibilità iniezione strumento.

Quando le fasi di preparazione del campione non viene rispettato correttamente, tuttavia, risultati inaffidabili e incoerenti sono ottenuti. Figura 4 mostra i risultati quando la precipitazione proteica fase del metodonon è seguito come indicato. Tre operatori, A, B, e C eseguito lo stesso procedimento di preparazione dei campioni su campioni di plasma pool. Un operatore, anziché pipettando la quantità di surnatante da protocollo sperimentale, invece pipettati> 1 ml per entrambe lavaggi con alcuni dei pellet. Questo non solo ha rivelato un numero elevato di falsi positivi per quella frazione, ma aumenta la variabilità dei dati.

La riproducibilità cromatografica dei dati può essere visto in Figura 7. Campioni pool di plasma sono stati preparati in triplicato in giorni separati utilizzando la precipitazione delle proteine, estrazione liquido-liquido, e l'estrazione in fase solida come descritto in questo protocollo. Ogni frazione è stata analizzata utilizzando la separazione cromatografica descritto nella sezione 7 del protocollo. I campioni sono stati poi iniettati in triplicato sulla LC-MS per valutare strumento e preparazione del campione riproducibilità. Questa sovrapposizione coerente dimostra sia la strength della riproducibilità della preparazione del campione quando preparato in tre giorni diversi, così come la forza del metodo cromatografico a produrre risultati riproducibili. Un aumento del rumore chimica si osserva per la modalità di ionizzazione negativa della frazione di acido grasso. Ciò può verificarsi a causa di contaminanti nei solventi LC-MS e può portare a risultati inconsistenti metabolomica quantitativi. Pertanto solo metaboliti che eluite prima 9 min sono stati analizzati.

Durante l'esecuzione di lunghe liste di lavoro, una perdita di sensibilità strumentale e del cambiamento nelle concentrazioni tampone può verificarsi nel tempo con conseguente diminuzione dell'intensità del segnale e lo spostamento del tempo di ritenzione. Se la variazione sovrapposizione tempo di ritenzione è inferiore al 5% e la variazione di intensità del segnale è inferiore al 10%, i dati sono ancora entro limiti laboratorio standard. Software di analisi può essere utilizzato per allineare e normalizzare i dati per correggere strumento e tempo di ritenzione di deriva. Tuttavia, se la variazione è large, allora la ragione deve essere determinato. Una volta che questo viene rettificata, i campioni possono essere nuovamente analizzati.

Figura 1. L'abbondanza di ISTDS lipidi (A) e metaboliti endogeni (B) dopo l'estrazione e la cromatografia in fase inversa (RPC) ^12. Estrazione è stata effettuata e campioni risultanti sono stati separati utilizzando RPC e analizzato utilizzando LC-MS in modalità di ionizzazione positiva e negativa. Questa cifra è stata modificata da Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figura 2. Un confronto di MTBE-SPE frazioni ^12. I metaboliti identificati in ogni frazione sono stati confrontati per identificare la quantità di sovrapposizione durante la parte SPE la prep. I numeri nel diagramma di Venn riflettono il numero di metaboliti rilevati in ogni frazione. Qui minore sovrapposizione si osserva tra le tre frazioni, che rappresentano l'estrazione di composti successo e la separazione di classe metabolita durante la fase SPE. Questa cifra è stata modificata da Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figura 3. Il recupero di ISTDS in frazioni utilizzando il metodo MTBE ^SPE-12. Estrazione è stata effettuata e campioni risultanti sono stati separati utilizzando RPC e analizzato utilizzando LCMS in modalità positiva e negativa come descritto nel testo. Questa cifra è stata modificata da Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figura 4. Risultati dalla frazione di pellet preparato da tre operatori. Tre campione preparato operatori A, B, e C eseguito lo stesso passo preparazione proteina su campioni di plasma pool. I numeri nel diagramma di Venn riflettono il numero di metaboliti rilevati da ciascun operatore. Operatori B e C pipettati il ​​volume richiesto per il protocollo di preparazione del campione mentre operatore A pipettati tutta surnatante e alcuni dei pellet, con conseguente oltre 500 più metaboliti, in maggioranza falsi positivi per quella frazione specifica.

Figura 5. Formazione di proteine ​​pellet durante la precipitazione delle proteine ​​passo <. / Strong> (A) 100 ml di plasma umano prima della preparazione del campione; (B) plasma dopo aggiunta di ghiaccio metanolo freddo; (C) proteine ​​pellet formata sul fondo della provetta dopo centrifugazione a 0 ° C per 15 min a 18.000 x g.

Figura 6. Separazione degli strati idrofili e idrofobi durante l'estrazione liquido-liquido (LLE) passo. Il solvente metil tert-butil etere organico (MTBE) e acqua sono stati usati per separare i metaboliti idrofili e idrofobi. Lo strato MTBE è disciolto composti non polari e lo strato acquoso è sciolta composti polari (A) plasma surnatante dopo rimozione delle proteine;. (B) plasma dopo essiccazione sotto azoto; (C) plasma dopo aggiunta di MTBE; ong> (D) aggiunta di acqua al plasma e MTBE; (E) strato MTBE-acqua formata dopo centrifugazione; (F) rimozione di MTBE strato superiore; (G) principalmente strato idrofilo rimane dopo la rimozione di MTBE.

Figura 7. Cromatogrammi di frazioni da un set di dati selezionato. Preparazione del campione è stata effettuata su tre campioni QC pool di plasma separati e ciascun campione è stato iniettato in triplicato sullo strumento LC-MS. Rappresentata sono cromatogrammi ionici totali dei campioni di plasma acquisiti utilizzando i parametri LC-MS di cui al punto 7 del protocollo di metodo. La rappresentazione cromatografico di altri liquidi biologici può variare a causa di differenze nella composizione metabolita.k "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Frazione	Modalità di ionizzazione	Standard Interno	n	Media Peak Area	Area Peak% CV
Acquoso	Positivo	Creatinina-D 3	31	2217311	3,8%
Lipidi Neutral	Positivo	Trigliceridi-D 5	31	4837032	9,9%
	C17 Ceramide	31	12736707	7,9%
Phospholipid	Positivo	15:00 PC	32	1248929	9,3%
		17:00 PE	32	517.234	7,9%

Risultati Tabella 1. Controllo di qualità da standard interni a spillo. Campioni di plasma pool da un enfisema modello di topo dataset sono stati analizzati per monitorare le condizioni dello strumento su base giornaliera per questo studio multi-settimana. Software di analisi quantitativa è stata utilizzata per determinare le aree dei picchi degli standard interni, (n = numero di strumenti iniezioni QC).

Frazione	Modalità di ionizzazione	Metaboliti endogeni	Media Peak Area	Area Peak% CV
Acquoso	Positivo	Creatinina	2554574	2,3%
		Valina	3712151	3,3%
		Glucosio	2669190	6,9%
Lipidi Neutral	Positivo	3-Dehydrosphinganine	226644	3,9%
			11301	8,2%
		DG (P-14: 0/18: 1)	364.119	1,9%
Phospholipid	Positivo	PC (24:0 / 0:0)	27599	0,9%
		PC16: 0/22: 6)	2873326	4,5%
		PI (16:00 / 18:01)	112.998	4,4%
Acido grasso	Positivo	10-oxo-acido 5 ,8-decadienoic	1363284	2,3%
		16-oxo-acido eptadecanoico	83700
		L'acido valerico 2-metil	285.782	5,7%
Acido grasso	Negativo	Acido 10-idrossi-8-ottadecenoico	10042	4,9%
		(R)-laballenic acido	173.929	6,5%
		2-cheto acido valerico	35488	6,0%

Risultati Tabella 2. Controllo della qualità di metaboliti endogeni. Campioni di plasma raccolti da un dataset malattia umana sono stati analizzati per monitorare preparazione del campione riproducibilità in giorni separati. I campioni sono stati preparati in triplicato nell'arco di tre giorni, (n = 9 prep iniezioni QC).

Discussione

Uno degli obiettivi degli studi di metabolomica clinici è quello di identificare i cambiamenti nel metabolome correlate a malattie o trattamenti. Pertanto le tecniche di preparazione dei campioni devono essere robusti, coerente e trasferibile da tecnico di un tecnico e da laboratorio a laboratorio ^22. I dati risultanti deve essere rappresentativo del campione, e le modifiche individuate bisogno di riflettere il campione set piuttosto che errori di preparazione del campione. Pertanto pipettaggio accurato, temperatura corretta, decantazione efficiente di strati immiscibili, essiccamento sotto azoto, e l'utilizzo delle stesse marche e dimensioni di vetro e suggerimenti sono necessari.

Durante la fase di precipitazione della proteina, è fondamentale che la stessa quantità di soluzione viene decantata da ciascun pellet. Questo riduce la variazione di volume e come tale riduce la variazione nei dati di esempio. Questa precipitazione passo proteina è necessaria per gli studi di metabolomica e non può essere saltata in quanto rimuove proteinei campioni prima piccola molecola profilatura analisi dello spettrometro di massa. Elimina gli agenti patogeni e le grandi macromolecole, e rilascia legato metaboliti dalle proteine ^​​7. Mancanza di accumulo di proteine ​​nei campioni espande la durata della colonna HPLC e aumenta la precisione e la qualità dei risultati. Figura 5 è una rappresentazione del pellet proteina formata durante l'esecuzione di questa tecnica su campioni di plasma. Questo permette la rilevazione di piccole molecole, migliora ione abbondanza, e riduce gli effetti matrice dalle proteine ​​nel campione. Inoltre, poiché si presume che tutte le proteine ​​vengono rimossi in questa fase, gli amminoacidi che vengono rilevati durante l'analisi LC-MS sarebbero provengono da cambiamenti metabolici piuttosto che dal catabolismo proteico.

La fase di estrazione liquido-liquido è critico poiché separa i metaboliti idrofili e idrofobi in due strati immiscibili. Figura 6 mostra la procedura LLE e un rappresentanteresentazione dello strato LLE. Una separazione improprio dei due strati si traduce in metaboliti o essere persi o essere diluiti in entrambe le frazioni. Attenta applicazione di questo passo riduce il numero di composti idrofili che appaiono nella frazione idrofoba. I risultati di questi composti non sono attendibili in quanto non è possibile stabilire quale frazione contiene i risultati rappresentativi. Se fatto correttamente, metabolita sovrapposizione è ridotta.

Per evitare la degradazione ossidativa, soprattutto in lipidi ma anche in piccole molecole che possono contenere gruppi tiolici per esempio, l'esposizione all'ossigeno deve essere mantenuto al minimo. Pertanto, questa procedura viene sempre eseguita sotto azoto per ridurre / impedire l'ossidazione dei lipidi o composti contenenti tiolo. Inoltre, il trasferimento del campione e / o la soluzione è rapido (entro il primo minuto) per ridurre l'esposizione all'ossigeno, poi i campioni sono rapidamente con un flusso continuo di azoto ad asciugare giù. Una volta essiccati, sono immediatamentediatamente risospese in 100% di metanolo per i motivi sopra discussi.

Laboratori possono beneficiare di questo metodo globale in diversi modi; I ricercatori cercano di isolare una classe di composti in grado di scegliere la parte del metodo che meglio si adatta alle loro esigenze. Coloro che cercano di eseguire solo una precipitazione di proteine ​​per ottenere un pool di metaboliti possono farlo. Se metaboliti idrofili sono desiderati, come molti farmaci, amminoacidi e zuccheri, o se solo metaboliti idrofobici sono desiderati, quali trigliceridi, epossidi, vitamine liposolubili e fosfolipidi per esempio, allora i ricercatori possono eseguire l'estrazione liquido-liquido passo successivo precipitazione delle proteine ​​e scartare la frazione indesiderato. Gli investigatori che necessitano di ulteriori sotto-classificazione dei composti idrofobici (lipidi neutri, acidi grassi e fosfolipidi) possono procedere alla fase di frazionamento.

Considerazioni di stoccaggio sono importanti in maintaining la vitalità dei campioni per un'analisi successiva. Se i campioni sono conservati in modo non corretto, possono verificarsi degradazione o decomposizione. Idealmente, i campioni devono essere conservati in flaconi color ambra con tappo a vite al riparo dalla luce per evitare il degrado di luce specie sensibili. I campioni dovrebbero essere conservati congelati a -80 ° C per evitare la degradazione del metabolita ^23-25. Sebbene non discusso in dettaglio qui, i campioni sono sempre mantenuti a 4 ° C nel vassoio autocampionatore durante l'analisi LC-MS. Questo garantisce che tutti i campioni sono mantenuti ad una temperatura costante e che variazioni della temperatura ambiente non influenzano la viscosità, solubilità, stabilità o dei campioni. Si raccomanda che gli aspetti manuali di questa procedura, come LLE e SPE, essere praticate al fine di ottenere la fiducia e il comfort con le fasi.

Esistono alcune limitazioni per questa tecnica. Separazione discreto dei metaboliti idrofobiche e idrofiliche non è garantito come alcuni composti saranno inherdipendentemente suddividere in due frazioni a causa del loro stato di composizione chimica e la carica. Inoltre, come mostrato in Figura 4, la tecnica non corretta durante la fase di estrazione della proteina pellet può provocare scarsa riproducibilità metabolita in entrambi i campioni ed i controlli di qualità. Questo riguarda le statistiche, soprattutto in piccoli insiemi di dati, perché la potenza statistica non è disponibile. Pertanto è fondamentale che questo passo essere eseguita esattamente lo stesso tempo ogni per ogni campione. Un altro limite è il tempo. Anche se ci sono punti di arresto nel corso di questo protocollo in cui i campioni possono essere congelati e la preparazione proseguito il giorno seguente, un intero giorno dovrebbe essere accantonata per eseguire questa procedura. In terzo luogo, non tutti i composti in un campione biologico può essere valutato per soppressione ionica. Poiché non è possibile identificare come la matrice colpisce ogni singolo metabolita, l'opzione corrente è di valutare gli standard interni che teoricamente imitano alcune classi di endogenous metaboliti. Infine, identificazioni assoluti non possono essere eseguite solo con questo metodo. Tandem MS in collaborazione con le ricerche di database e gli standard sono necessari per l'identificazione del metabolita assoluta.

Una parte importante della metabolomica è l'identificazione dei composti. Sebbene non discusso in dettaglio qui, campioni di controllo di qualità sono stati analizzati utilizzando la LC-MS. Più spazi di preparazione dei campioni e gli spazi strumenti sono stati preparati per uso come sfondo sottrazione di ridurre il tasso di falsi positivi da contaminanti, ottenendo in tal modo risultati metaboliti più affidabili. A seguito di questa fase, il numero di "caratteristiche molecolari" quasi raggruppati sulla base di m / z, tempo di ritenzione e il rapporto isotopico, e addotti per produrre un elenco di composti effettivi. Anche se l'elenco dei composti è stata notevolmente ridotta, i risultati erano più affidabili in quanto non erano basati su più addotti dallo stesso composto. Il metodo completo è completo e permette isolation di metaboliti idrofobici quali lipidi neutri, fosfolipidi, acidi grassi, trigliceridi, e steroidi, mentre anche isolando classi idrofili nella frazione acquosa, di cui eicosanoidi, zuccheri, flavonoidi e aminoacidi sono stati identificati ^{12, 26.}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
Metanolo	Fisher Scientific	L-6815
Cloroformio	Fisher Scientific	C606-1
Esano	Sigma Aldrich	34859
Acido acetico	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
Metil tert-butil etere	J.T. Baker	9042-03
Alcool isopropilico	Sigma Aldrich	34965-2.5L
Acqua	Honeywell Burdick Jackson	365-4
Sistema di riscaldamento OA-SYS	Organomation Associates, Inc		Utilizzato per mantenere i campioni sotto un flusso costante di azoto a 35 ° C
Collettore per vuoto a 12 posizioni	Phenomenex
Strata NH2 (55 µ M, 70Å) Cartucce SPE da 100 mg/ml	Phenomenex	8B-S009-EAK
Puntali per pipette in vetro	Fisher Scientific	13-678-20C	Utilizzati per trasferire il campione alla colonna SPE
Puntali per pipette in plastica	USA Scientific	1182-1830	Utilizzati quando non sono necessari puntali in vetro Provette
microcentrifuga	Fisher Scientific	02-681-320
Pipette graduate in vetro	Fisher Scientific	13-678-27B	Utilizzato per trasferire solventi organici durante la preparazione del campione
Provette per coltura in vetro Pyrex	Corning Incorporated	99499-16X	Utilizzato per conservare frazioni acquose e lipidiche fino alla fase successiva
Fiale per autocampionatori	Agilent Technologies	5182-0545
Fiale con tappo a scatto per fiale per autocampionatori	Agilent Technologies	5182-0541
Vetro inserti	Agilent Technologies	5183-2085	Utilizzato per piccoli volumi di campioni
Software di analisi qualitativa Mass Hunter	Agilent Technologies	Versione B.06.00	Utilizzato per monitorare i tempi di ritenzione e le curve di pressione Software
analisi quantitativa Mass Hunter	Agilent Technologies	Versione B.05.02	Utilizzato per analizzare il controllo qualità e i dati dei campioni
Mass Profiler Professional software	Agilent Technologies	Versione B.12.50	Utilizzato per determinare statistiche, cambiamenti di piega ed eseguire l'identificazione dei metaboliti