Articolo metodologico
Il protocollo per rilevare le cellule autoreattive T CD4 nel cervello e nel cuore dalla colorazione diretto con complesso maggiore di istocompatibilità di classe II dextramers è stato descritto nella presente relazione. Per un'analisi completa, un metodo affidabile per enumerare le frequenze di cellule CD4 + T antigene-specifiche in situ è pensato anche.
Questo rapporto dimostra l'uso di destrameri di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) per la rilevazione di cellule T CD4 autoreattive in situ nell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotta dalla proteina proteolipide della mielina (PLP) 139-151 nei topi SJL e dalla miocardite autoimmune (EAM) indotta dalla miosina pesante cardiaca α (Myhc) 334-352 nei topi A/J. Sono stati utilizzati due set di cocktail di reagenti destromeri, in cui le cellule dextrmeri + sono state analizzate mediante microscopio confocale a scansione laser (LSCM): EAE,IA / PLP 139-151 dextrameri (specifici) / anti-CD4 e IAs/virus dell'encefalomielite murina di Theiler (TMEV) 70-86 destrameri (controllo) / anti-CD4; e EAM, IAk/Myhc 334-352 destromeri/anti-CD4 e IAk/ribonucleasi bovina (RNasi) 43-56 destratrameri (controllo)/anti-CD4. L'analisi LSCM delle sezioni cerebrali ottenute da topi EAE ha mostrato la presenza di cellule positive per i destromeri CD4 e PLP 139-151, ma non per i dextrameri TMEV 70-86, suggerendo che la colorazione ottenuta con i destrameri PLP 139-151 fosse specifica. Allo stesso modo, le sezioni cardiache preparate da topi EAM hanno rivelato la presenza di Myhc 334-352, ma non di cellule RNasi 43-56-destmer+ come previsto. Inoltre, è stato ideato un metodo completo per analizzare quantitativamente le frequenze delle cellule T CD4 antigene-specifiche nelle immagini seriali "Z".
L'uso del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri per la rilevazione di cellule antigene-specifiche CD4 T è stata una sfida 1-7. Per migliorare la sensibilità di rilevazione di MHC classe II tetrameri, il team di ricerca ha creato tetrameri di prossima generazione, denominati "dextramers" 8. Dextramers contengono dorsali destrano in cui più frazioni streptavidina-fluoroforo sono coniugate, in modo che diversi peptidi-tethered, biotinilati monomeri MHC possono essere collegati ad una molecola destrano 9. Così, grandi aggregati di dextramers MHC che contengono diversi complessi MHC-peptide possono intera....
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Etica Dichiarazione:
Tutte le procedure di polizia sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dalla University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.
1. Induzione di EAE
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In questo rapporto, nella rilevazione in situ di antigene-specifiche, autoreattivi cellule T CD4 di colorazione diretto con MHC di classe II dextramers è descritto. Sezioni cerebrali appena tagliato sono state derivate da topi EAE e colorate con cocktail contenenti PLP 139-151 (controllo) dextramers e anti-CD4 (specifico) o TMEV 70-86. I primi pannelli in figura 1 mostra l'analisi LSCM di sezioni cerebrali costained con PLP 139-151 dextramers (rosso) e di anticorpi CD4 (verde), in .......
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A differenza di tetrameri MHC di classe, l'uso di MHC classe II tetrameri per applicazioni di routine continua ad essere impegnativo, soprattutto per enumerare le frequenze precursori di cellule T CD4 autoreattivi bassa affinità, dovute in parte alla loro dipendenza di attivazione 6,15-17. Recentemente, questo problema è stato aggirato con la creazione della prossima generazione di tetrameri, chiamati "dextramers," ci permette di rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T per un certo numero .......
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Nessun conflitto di interessi sono stati dichiarati.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association e dei Bambini Cardiomiopatia Foundation (SDG2462390204001), e il National Institutes of Health (HL114669). CM è un destinatario di una borsa di assegno di ricerca post-dottorato assegnato dalla Fondazione miocardite, NJ.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Negozio a 4 ° C |
| MTB Estratto di H37Rv | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | negozio a 4 ° C |
| PT | Elenco Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Negozio a 4 ° C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Negozio a 4 ° C |
| Topi femmina A/J | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Topi femmina SJL/J | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Ago sterile, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Ago sterile, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| rubinetto a 3 vie | Smiths Medical ASD, Inc. Dublino, OH | MX5311L | |
| rotoli di bende di garza Kerlix | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarosio, Basso punto di fusione, Grado analitico | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Siero di capra normale immunopuro | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Negozio a -20 ° C |
| Anti-topo CD4 coniugato con colorante PE | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | negozio a 4 ° C |
| Scienze della microscopia elettronica con paraformaldeide | , Hatfield, PA | 19202 | Negozio a 4 ° C |
| Faramount Terreno di montaggio acquoso | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Provetta conica (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Provetta conica (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| Piastre per coltura tissutale a fondo piatto a 24 pozzetti | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Pennelli | per acquerello #2Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Vetrini per microscopio semplici, dimensioni: 3" x 1" x 1,2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Cassette istologiche monouso per stampi a base profonda | Prodcust da laboratorio, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super colla | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Lamette da barba | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store a 4 ° C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Negozio a 4 ° C | |
| MHC classe II/IAs destrameri PLP 139-151 o TMEV 70-86 coniugati con colorante | Conservare a 4 ° C | ||
| MHC classe II/IAk Myhc 334-352 o RNasi 40-56 destrimeri coniugati con colorante | Conservare a 4 ° C | ||
| destrano coniugato SA-APC | Immundex, Copenaghen, Demark | Store a 4 ° C | |
| Forbici e pinze chirurgiche sterili | INOX tool Corporation | ||
| Micro forno | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratomo | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Microscopio confocale a scansione laser | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Microscopio confocale Nikon A1-Eclipse 90i | Nikon Inc. Melville, NY |
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