L'estrazione del DNA dalla saliva può fornire una fonte prontamente disponibile di DNA ad alto peso molecolare, con poca o nessuna degradazione/frammentazione. Questo protocollo fornisce parametri ottimizzati per la raccolta/conservazione della saliva e l'estrazione del DNA in modo che siano di qualità e quantità sufficienti per i saggi di DNA a valle con elevati requisiti di qualità.
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Articolo metodologico
Raccolta ed estrazione di Saliva DNA per il sequenziamento di nuova generazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fonte preferita di DNA nella ricerca di genetica umana è il sangue, o linee cellulari derivate dal sangue, poiché queste fonti producono grandi quantità di DNA di alta qualità. Tuttavia, l'estrazione del DNA dalla saliva può produrre DNA di alta qualità con poca o nessuna degradazione/frammentazione che è adatto per una varietà di saggi del DNA senza la spesa di un flebotomo e può anche essere acquisito per posta. Tuttavia, al momento, in letteratura non sono stati presentati protocolli di raccolta/estrazione del DNA salivare per il sequenziamento di nuova generazione. Questo protocollo ottimizza i parametri di raccolta/conservazione della saliva e di estrazione del DNA in modo che siano di qualità e quantità sufficienti per i saggi del DNA con gli standard più elevati, tra cui la genotipizzazione con microarray e il sequenziamento di nuova generazione.
Introduzione
Ottenere DNA di alta qualità per gli studi genetici umani è essenziale nel processo di scoperta del gene della malattia. Sangue, anche se richiede una procedura invasiva e anche di essere più costoso di raccolta della saliva, è favorito per la creazione di linee cellulari immortalizzate come una fonte infinita di DNA, o iPSCs per studi funzionali, e, talvolta, il DNA del sangue viene utilizzato quando le linee cellulari non sono disponibili. Tuttavia, il prelievo di sangue richiede un flebotomo addestrato e il sangue ha una emivita più breve di saliva 1. DNA dalla saliva è meno costoso e più facile da ottenere, dal momento che può essere raccolto e inviato attraverso la posta elettronica, senza la necessità di un flebotomo, aumentando così i potenziali soggetti piscine ben oltre il bacino di utenza di ospedali e laboratori 2. Studio iscrizione può essere migliorata quando i soggetti hanno la possibilità di dare un campione di saliva al posto del sangue 3, 4. Preoccupazioni circa la quantità e la qualità del DNA dalla saliva possono aver limitato la sua diffusione di noie nonostante i numerosi studi recenti studi che mostrano l'idoneità di tutta la saliva, con una media di 4,3 x 10 5 cellule per millilitro, per il test del DNA rispetto ai più tamponi buccali metodi che non abbiano conseguito notevoli quantità di saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mentre una modesta letteratura esistente che mostra l'idoneità di tutta la saliva DNA derivato per le applicazioni di genotipizzazione compresi i metodi basati su microarray 8, 9, 10, nessuno studio ha esaminato sequenziamento di nuova generazione (NGS). L'obiettivo di ottimizzare l'intero protocollo di estrazione del DNA della saliva è stato quello di massimizzare la quantità e la qualità per le applicazioni della genetica in un modo economicamente efficace che può essere facilmente implementato in laboratorio con reagenti e materiali di consumo comuni.
Estrazione del DNA dalla saliva richiede diverse procedure: 1) raccolta e conservazione, 2) la lisi cellulare, 3) trattamento RNasi, 4) la precipitazione delle proteine, 5) precipitazione in etanolo, 6) reidratazione del DNA. La soluzione di DNA Stabilizzazione tampone, descrittoin precedenza 2, funzioni adeguatamente senza alterazione. Nessun tentativo di ottimizzare il trattamento RNasi e DNA fasi di reidratazione è stata fatta. Per ogni passo rimanente, diverse variabili che potrebbero influenzare il rendimento sono stati identificati. Ogni variabile è stato manipolato individualmente e miglioramento della resa e la qualità è stata valutata statisticamente. Per le variabili che sono stati mostrati per migliorare il rendimento e / o la qualità del DNA, i valori ottimali sono stati inclusi nel protocollo finale.
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Protocollo
NOTA: Prima di fornire campioni di saliva tutti i soggetti hanno dato il consenso informato conforme alle linee guida per il trattamento di soggetti umani all'ospedale dei bambini a livello nazionale.
1 Saliva Raccolta e conservazione
- Prima della raccolta della saliva, assicurarsi che la bocca del soggetto è libero di cibo o altre sostanze estranee avendo il soggetto sciacquare la bocca con acqua ed evitando di mangiare o bere per 30 minuti prima di raccogliere il campione.
- Aprire una provetta da centrifuga da 15 ml con 2,5 ml di tampone di DNA stabilizzazione 2 avendo cura di evitare di toccare l'interno del tappo o il tubo, e hanno il soggetto sputare 2,5 ml di saliva nella soluzione tampone. Nota: Raccolta di oltre 2,5 ml di saliva può portare al degrado del campione da un rapporto di insufficiente di campione di tampone di stabilizzazione del DNA. Raccolta troppo poco di saliva riduce i rendimenti attesi dal protocollo. Per valutare i volumi di raccolta, utilizzare i gradienti numerati sul lato di tegli tubo.
- Rimettere il tappo e miscelare per inversione fino a quando la miscela è omogeneizzato. Agitazione vigorosa non è necessario. Conservare i campioni a temperatura ambiente per la conservazione a breve termine o 4 ° C per la conservazione a lungo termine (> 3 mesi).
2. Preparazioni iniziali e lisi cellulare
- Prima di iniziare l'estrazione, riscaldare a bagnomaria a 37 ° C, e preparare un secchio di ghiaccio. Saranno necessari tre provette da 15 ml per centrifuga coniche per ogni campione estratto. I tre tubi saranno utilizzati per contenere il cellulare e proteine pellet, la finale estratto gDNA, e le isopropanolo ed etanolo surnatanti.
- Recupera campioni di stoccaggio, e campioni di invertire tempi diversi poi vortice a media velocità per 15 secondi.
- Dispensare 2.5 ml di campione in un ambiente pulito 15 ml tubo da centrifuga, e aggiungere 5 ml di Cell Lysis Solution. Mescolare il campione 50 volte per inversione, e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
3. RNA rimozione
- Aggiungere 40 ml di RNasi A Solution a 100 mg / ml, e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Togliere il campione dal bagno di 37 ° C e acqua fredda su ghiaccio per 3 min.
- Dopo l'incubazione RNasi A, aumentare la temperatura del bagno d'acqua a 65 ° C per la fase di reidratazione DNA del protocollo.
4. Proteine e lipidi di rimozione
- Aggiungere 50 ml di soluzione di proteinasi K a 20 mg / ml, mescolare più volte per inversione, e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 30 min. Nota: Questo è un possibile punto di pausa per il protocollo. Dopo l'aggiunta della soluzione di proteinasi K, il campione può essere conservato a 4 ° C fino al momento dell'estrazione può essere completata. Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore non è stato dimostrato di avere un effetto significativo sui rendimenti di estrazione o la qualità del DNA. Stoccaggio a lungo termine in questa fase non è stata valutata.
- Aggiungere 1,7 ml di proteina Precipitazione Solution, mescolare vigorosamente nel vortex per 20 secondi ad alta velocità, e posto in ghiaccio per 10 min.
- Una volta che i campioni sono raffreddati in ghiaccio per 10 minuti, centrifugare per 10 minuti a 3000 xg e 4 ° C. Le proteine precipitate devono formare un pellet stretto per continuare. Se il pellet non è stretto o la soluzione è ancora torbida, i campioni possono essere raffreddati in ghiaccio per 5 minuti di più e centrifugazione ripetuti. I campioni devono essere tenuti in ghiaccio per garantire un pellet stretto.
5. isolamento e la purificazione di gDNA
- In un ambiente pulito 15 ml tubo da centrifuga, pipetta 5 ml di isopropanolo e 8 ml di puro Soluzione glicogeno a 20 mg / ml.
- Versare il surnatante contenente il gDNA dal punto 4.3 nella provetta contenente la soluzione di isopropanolo e glicogeno, lasciando dietro di sé la proteina pellet precipitato. Una volta aggiunto il surnatante, mescolare delicatamente il campione di 50 volte per inversione e centrifugare per 30 minuti a 3000 xg e 4 ° C.
- Versare lentamente il surnatante in una provetta pulita 15 ml. Dopo la rimozione del surnatante, aggiungere 1 ml di etanolo al 70% perlavare il pellet lentamente a dondolo e spostando delicatamente la etanolo sopra il pellet precipitato più volte. Conservare l'etanolo nel tubo.
- Dopo il lavaggio iniziale, centrifugare il campione per 1 min a 2.000 xg e 20 ° C. Questa fase di centrifugazione può essere fatta sia a 4 ° C o 20 ° C. Nessun effetto significativo della temperatura è stato dimostrato per questo passo.
- Dopo il lavaggio iniziale e la centrifugazione del pellet, versare lentamente il lavaggio etanolo dal tubo ed eliminare, quindi eseguire un secondo lavaggio ripetendo i punti 5.3 e 5.4.
- Dopo la rimozione del supernatante dal secondo lavaggio, permettere il pellet asciugare all'aria per 15 min.
- Se il campione non si è completamente asciugato, aria secca per altri 15 min.
6. reidratazione di gDNA
- Una volta che il campione si è asciugato, aggiungere 300 ml di Tris-EDTA per reidratare il pellet gDNA secca.
- Vortex il campione per 5 secondi a velocità media e posto in un65 ° C in bagno di acqua calda per 1 ora.
- Rimuovere i campioni dal bagnomaria e incubare O / N a RT.
NOTA: Tutti i prodotti ei reagenti utilizzati sono elencati nella tabella dei materiali, così come Tabella 4.
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Risultati
Per determinare i parametri ottimali per il DNA estrazione è stata effettuata una serie di estrazioni di DNA appaiati. Un singolo campione di saliva è stato diviso e ogni porzione sottoposta a uno dei due valori possibili per un dato variabile. Almeno otto repliche di ciascun test accoppiato state eseguite (ad esempio, un singolo campione di saliva è stato aliquotato per testare l'estrazione con e senza iniziale 50 ° C incubazione). L'ottimizzazione è basata su quattro metriche standard: rendimento tota...
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Discussione
La presente procedura è un protocollo di estrazione del DNA ottimizzato che ha notevolmente migliorato la resa del DNA ad alto peso molecolare rispetto ai metodi standard, senza compromettere la qualità del DNA. La fase critica con l'effetto più grande sulla resa più era punto 5.2, che comprende una fase di centrifugazione più a lungo durante precipitazione in etanolo di qualsiasi protocollo pubblicato recensito qui, tranne uno che non è stato ampiamente distribuito 11. Non sono stati rilevati cambiamenti...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da un National Institutes of Health R01 (DC009453 supporto a CWB).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga da 15 ml | Fisher | 12-565-268 | |
| Soluzione di lisi cellulare | Qiagen | 158908 | |
| Proteinasi K | Sigma | P6556 | |
| Soluzione di precipitazione proteica | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanolo | Fisher | A416-4 | |
| Glicogeno | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Etanolo | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0,5 M) Soluzione | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodio Dodecil Solfato | Fisher | BP166-100 | |
| Miscelatore a vortice analogico | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuga 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Riferimenti
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