Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

Summary

Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l'efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.

Abstract

Elettroporazione ha ricevuto crescente attenzione negli ultimi anni, perché è una tecnica molto potente per introdurre fisicamente non permeanti sonde molecolari esogeni in cellule. Questo lavoro riporta una piattaforma elettroporazione microfluidica in grado di effettuare la consegna molecola multiplo per cellule di mammifero con un controllo preciso e molecolare-dipendente parametro. La capacità del sistema di isolare le cellule con distribuzione di dimensione uniforme permette per meno variazione di efficienza elettroporazione per data intensità di campo elettrico; quindi una maggiore redditività del campione. Inoltre, la sua funzione di visualizzazione di processo consente di osservazione del processo di assorbimento molecolare fluorescente in tempo reale, che permette rapide regolazioni dei parametri consegna molecolari in situ per il miglioramento dell'efficienza. Per mostrare le vaste funzionalità della piattaforma segnalati, macromolecole con diverse dimensioni e cariche elettriche (ad esempio, Destrano con MW di 3.000 e 70.000 Da) sono staticonsegnato alle cellule del cancro al seno metastatico con elevate efficienze di consegna (> 70%) per tutte le molecole testate. La piattaforma sviluppata ha dimostrato il suo potenziale per l'uso nella espansione dei campi di ricerca in cui on-chip tecniche di elettroporazione può essere utile.

Introduction

Negli ultimi anni, l'uso di impulsi elettrici per facilitare l'erogazione citosolico di molecole extracellulari è diventato un dispositivo interessante per manipolare cellule di mammifero. ¹ Questo processo, noto anche come elettroporazione, permeabilizes reversibilmente la membrana cellulare, permettendo membrana intrinsecamente molecole impermeabili per accedere di ambiente intracellulare delle cellule. Perché praticamente qualsiasi molecola può essere introdotto nel citoplasma tramite i pori temporanei creati nella membrana di qualsiasi tipo di celle utilizzando elettroporazione, la tecnica è stata segnalata come più riproducibile, universalment....

Protocol

1 Cella Preparazione

1. Tavola 1 × 10 ⁵ cellule / ml di metastatico linea di cellule di cancro al seno MDA-MB-231 in un volume di 10 ml per tessuti pallone di coltura T75 a Leibovitz L-15 Medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 1 % di penicillina-streptomicina.
2. Incubare MDA-MB-231 cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C con 0% di CO ₂ ambiente.
3. Celle di raccolta per esperimenti di 2 giorni dopo la semina trattando le cellule con il 0,25% tripsina-EDTA per 2 min e inattivano l'attività enzimatica di tripsina con l'aggiunta di 8 ml di terreno di coltura.
4. Cellule pellet di ce....

Results

Il elettroporatore microfluidica parallelo sviluppato consegnato macromolecole con dimensioni diverse e cariche elettriche nelle cellule viventi con carcinoma mammario metastatico. Consegna molecolare di successo è stato qualitativamente determinata monitorando i cambiamenti di intensità di fluorescenza delle cellule orbitanti elettroporate in situ e confermato da misurazioni quantitative mediante citometria a flusso. Figura 4A mostra che il 90% delle cellule trattate uptake 70.000 Da destrano .......

Discussion

Con la nuova piattaforma elettroporazione parallelizzati, aumento di 10 volte in velocità e l'efficienza della consegna multi-molecola è stata ottenuta in aggiunta a tutti i meriti che il sistema monocamerale precedentemente sviluppato fornisce. Meriti ¹⁸ Precedentemente disponibili includono (i) pre-purificazione della colpire le cellule con distribuzione uniforme di formato per la valorizzazione vitalità, (ii) un controllo preciso e individuale dosaggio molecolare, e (iii) a bassa corrente elettrica ope.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 linea cellulare tumorale	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz' s L-15	Medium Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillina-streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Tripsina	Gibco, Life Technologies	25200-056
Citometro a flusso easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Detergente al plasma di ossigeno	Technics Micro-RIE
Dektak 6M profilatore di superficie	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 ELASTOMERO SILICONICO KIT	Dow Corning
Azoto compresso gassoso	Airgas	NI 300
Regolatore ad alta pressione	McMaster-Carr	6162K22
Regolatore a valle	McMaster-Carr	4000K563
Collettore di valvole ad alta velocità 3/2 vie-8	Festo
	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Tubi in poliuretano	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0,17" ID Tubi in poliuretano	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" Tubi in PEEK	Festo	P1533
1/32" Tubi in PEEK	Idex Salute e Scienza	P1569
Raccordi per tubi in PEEK	Idex Salute e Scienza	P881
Generatore di impulsi	HP	8110A
Filo di alluminio	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscopio	Agilent	DSO3062A
provette da centrifuga da 50 ml	VWR	21008-178
provetta da centrifuga da 15 ml	VWR	21008-216
Pallone di coltura T75	VWR	82050-862
Destrano, Tetrametilrodamina, 3.000 MW, Gibco anionico	, Life Technologies	D3307
Destrano, Tetrametilrodamina, 70.000 MW, Neutro	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3.000 MW, Gibco neutro	, Life Technologies	D3329