C. elegans è emerso come un nuovo modello genetico per studiare le interazioni ospite-patogeno. Qui si descrive un protocollo per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium accoppiato con la tecnica RNAi doppio filamento interferenze per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nell'ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni tra i padroni di casa e agenti patogeni, tra cui la difesa ospite contro i gram-negativi batterio Salmonella typhimurium. Salmonella stabilisce infezione persistente nell'intestino di C. elegans e si traduce in morte precoce di animali infetti. Un certo numero di meccanismi immunitari sono stati identificati in C. elegans per difendersi contro le infezioni da Salmonella. Autofagia, un evolutivamente conservata degradazione lisosomiale percorso, ha dimostrato di limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi. Qui, un protocollo è descritto per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium, in cui i vermi sono esposti a Salmonella per un tempo limitato, simile alle infezioni da Salmonella nell'uomo. Salmonella infezione riduce notevolmente la durata di C. elegans </ Em>. Utilizzando il gene autofagia essenziale bec-1 come esempio, abbiamo combinato questo metodo infezione da C. elegans RNAi alimentazione approccio e ha mostrato questo protocollo può essere utilizzato per esaminare la funzione di C. geni ospitanti elegans in difesa contro le infezioni da Salmonella. Poiché C. elegans intero genoma librerie RNAi sono disponibili, questo protocollo permette di schermare completamente per la C. elegans geni che proteggono contro la salmonella e altri patogeni intestinali utilizzando le librerie RNAi genome-wide.
Introduzione
Il nematode del suolo a vita libera Caenorhabditis elegans è un semplice e geneticamente trattabili organismo modello utilizzato per studiare molte questioni biologiche. C. elegans esiste prevalentemente come ermafroditi auto-fertilizzazione. I maschi sono spontaneamente generati da non disgiunzione del cromosoma X durante la gametogenesi 1,2. In presenza di cibo abbondante, C. elegans sviluppare continuamente attraverso quattro stadi larvali all'adulto. La temperatura influisce anche C. sviluppo elegans; sviluppo più rapido si osserva a temperature più elevate. In laboratorio, C. elegans è coltivat....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Piastre XLD (xilosio lisina Desoxycholate) Agar
XLD agar è un terreno di coltura selettivo per Salmonella, che appare come colonie nere su piastre di agar XLD. Tuttavia, se non ci sono problemi di contaminazione, un piatto regolare LB può essere sostituito.
- Pesare 5,5 g di agar XLD e risospendere in 5 ml di acqua deionizzata.
- Mescolare accuratamente fino a quando tutti agar è bagnato. Aggiungere 95 ml di acqua deionizzata fino a quando tutti i grumi sono andati e il mezzo è completamente risospese.
- Far bollire il mezzo per sciogliere completamente (non autoclave).
- Raffreddare il terreno....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
A 20 ° C, la durata mediana di wild type vermi N2 è 17 giorni (Figura 2a e Tabella 2). Infezione da Salmonella diminuisce significativamente la durata mediana di vermi N2 a 10,5 giorni (p = 0,0002, log-rank test) (Figura 2A ).
Se una C. gene elegans svolge un ruolo importante nella difesa contro le infezioni da Salmonella, si prevede che la sua inibizione impartirà suscettibilità alle infezioni Salmone.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
C. elegans è un organismo semplice modello genetico che mangia i batteri come fonte di nutrienti. Così, è facile da sostituire la alimentare batterica normale con un patogeno intestinale per indagare le interazioni tra C. elegans e l'agente patogeno scelto. Qui un protocollo è descritto combinare Salmonella infezione e C. elegans RNAi alimentazione trattamento per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella. Protocolli di precedente i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Diane Baronas-Lowell per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant e una borsa di studio invecchiamento della Ellison Medical Foundation di KJ
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| LB Brodo | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Cloruro di sodio | Fisher | S671-500 | |
| Cloruro di calcio | Fisher | C69-500 | |
| Solfato di magnesio | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Colesterolo | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillina | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Piatto 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Piastra di Petri 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Pipetta sierologica Falcon | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 incubatore a scuotimento | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubatrice | Percival | I-36DL |
Riferimenti
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Infezione da Salmonella in C. eleganssaggio di alimentazione RNAiinterazione ospite-patogenogene dell'autofagia bec-1analisi della sopravvivenza di Kaplan-Meierpiastre di agar XLDpiastre di alimentazione NGMvermi ermafroditi allo stadio L4knockdown genico tramite RNAitappeto di Salmonella typhimurium
