Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

Sommario

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Abstract

Interneuroni inibitori GABAergici svolgono un ruolo centrale nei circuiti neuronali del cervello. Interneuroni comprendono un piccolo sottoinsieme della popolazione neuronale (10-20%), ma mostrano un elevato livello di eterogeneità fisiologica, morfologica, e neurochimici, che riflettono le loro diverse funzioni. Pertanto, l'indagine di interneuroni fornisce importanti informazioni ai principi di organizzazione e funzionamento dei circuiti neuronali. Ciò, tuttavia, richiede un approccio fisiologico e neuroanatomica integrato per la selezione e l'identificazione dei tipi di interneuroni individuali. Whole-cell patch-clamp registrazione da acuta fettine di cervello di animali transgenici, che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto i promotori di marcatori specifici di interneuroni, fornisce un metodo efficace per individuare e caratterizzare elettrofisiologicamente proprietà intrinseche e sinaptiche di tipi di interneuroni specifici. Combinato con etichettatura colorante intracellulare, questo approccio può essere esteso con il post-hoc moanalisi rphological e immunocitochimica, consentendo l'identificazione sistematica dei neuroni registrati. Questi metodi possono essere personalizzati per soddisfare una vasta gamma di questioni scientifiche riguardanti le proprietà funzionali dei diversi tipi di neuroni corticali.

Introduzione

Circuiti neuronali ippocampali sono da tempo oggetto di intenso esame, per quanto riguarda sia l'anatomia e la fisiologia, a causa del loro ruolo essenziale nell'apprendimento e nella memoria, così come la navigazione spaziale in entrambi gli esseri umani e roditori. Analogamente, l'organizzazione laminare prominente, ma semplice dell'ippocampo rende questa regione un soggetto privilegiato di studi che riguardano proprietà strutturali e funzionali di reti corticali.

Circuiti dell'ippocampo sono costituiti da cellule eccitatorie principali (> 80%) e una più piccola (10-20%), ma altamente diversificata coorte di interneu....

Protocollo

Dichiarazione Etica: tutte le procedure e animale manutenzione sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali, la legge tedesca Animal Welfare, il Consiglio direttiva 86/609 / CEE per quanto riguarda la protezione degli animali europea, e le linee guida delle autorità locali (Berlino, T-0215/11 )

1 Preparazione di fette acuta-ippocampali

1. Prendete un topo transgenico (da 17 a 24 giorni di età), che esprime la proteina fluorescente Venere / YFP sotto il promotore vGAT, che etichetta la maggior parte di interneuroni inibitori corticali ^13. Decapitare il ratto. Rapidamente sezionare il cervello (<40 s....

Risultati

A condizione che la qualità fetta è sensibilmente buona, la registrazione da entrambi CA1 PC e FS-in possono essere raggiunti con difficoltà minima. La linea di topo transgenico che esprime Venere / YFP sotto il promotore vGAT ¹³ non identifica inequivocabilmente FS-in, o anzi jacket. Tuttavia registrazioni da INs in ed intorno a str. piramidale, dove la densità di FS-in è in genere alta ^1, si traduce in una elevata probabilità di selezionare FS-in (Figura 2B). FS-in posso.......

Discussione

Descriviamo un metodo che combina tecniche elettrofisiologiche e neuroanatomiche caratterizzare funzionalmente i neuroni morphologically- e neurochimico-identificati in vitro; in particolare i diversi tipi di INs inibitorie corticali. Gli aspetti principali della procedura sono: (1) pre-selezione dei potenziali INs; (2) la registrazione intracellulare e la visualizzazione dei neuroni; e infine (3) analisi morfologica e immunocitochimica di INs registrati. Sebbene questo studio ha affrontato PV-in in particolare, il prot.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ratti transgenici vGAT-venus			vedi Uematsu , et al., 2008
Occhiali per Venus (515 nm)	BLS Ltd., Ungheria
Strumenti da dissezione	i.e. FST		Per l'asportazione del cervello
Vibratomo	Leica	VT1200S	O un altro vibratomo di fascia alta con oscillazione verticale minima
Camere di mantenimento per fette			Realizzate su misura in laboratorio
Microscopio verticale IR-DIC	Olympus, Giappone	BX50WI	Con sistema micromanipolatore; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
Telecamera CCD	Till Photonics	VX55
Sistema LED a 505 nm	Cairn Research	OptiLED system	O lampada a mercurio o altro sistema LED i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		In alternativa 2 amplificatori Axopatch 200B
Software di acquisizione WinWCP	John Dempster, Strathclyde University		Si può usare qualsiasi software di acquisizione di qualità, i.e. EPHUS, pClamp, Igor ecc.
Tiratore di elettrodi	Sutter	P-97	Usato con filamento a scatola
Vetro per pipette borosilicato	Hilgenberg, Germania	1405020	2 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno, senza filamento
Pompa peristaltica	Gilson	Minipuls	Altre pompe o alimentazione a gravità possono essere usate al posto
Termometro digitale			Realizzato su misura
Manometro digitale	Supertech, Ungheria
Stimolatore isolato a tensione costante	Digitimer Ltd.	DS-2A
Biocitina	Invitrogen	B1592	Altrimenti nota come ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) sale disodico	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX sale disodico	Abcam Biochemicals	ab120169	In alternativa NBQX o CNQX
Gabazina (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	In alternativa bicucullina metiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 cloridrato	Tocris	1248
Streptavidina 647	Invitrogen	S32357
Anticorpo monoclonale anti-PV da topo	Swant, Svizzera	235	Concentrazione di lavoro 1:5.000-1:10.000
Anticorpo secondario anti-topo	Invitrogen	A11030	Se si utilizza un roditore Venus o GFP, è consigliabile usare un canale rosso (i.e. 546 nm).
Siero normale di capra	Vector Labs	S-1000
Vetrini per microscopia			Qualsiasi marca di alta qualità
Coverslip di vetro			Di solito 22 x 22 mm
Spaziatori in agar			Blocco di agar tagliato al vibratomo a 300 μm
Microscopio confocale a scansione laser	Olympus, Giappone	Fluoview FV1000	O un altro sistema comparabile
Fiji (Fiji è semplicemente ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji		Vedi Schindelin et al., 2012