Articolo metodologico

Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

DOI:

10.3791/51710

⸱

18 ottobre 2014

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

In questo articolo

Sommario

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Questa presentazione dimostra un metodo in cui l'elettroporazione di cellule aderenti e coltivate viene utilizzata per lo studio della comunicazione intercellulare e giunzionale, mentre le cellule crescono su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente.

Abstract

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In questa tecnica, le cellule vengono coltivate su un vetrino parzialmente rivestito con ossido di indio-stagno (ITO), un materiale trasparente ed elettricamente conduttivo. Una varietà di molecole, come peptidi o oligonucleotidi, può essere introdotta essenzialmente nel 100% delle cellule in modo non traumatico. Qui, descriviamo come può essere utilizzato per studiare la comunicazione giunzionale intercellulare. Il giallo lucifero penetra nelle cellule quando un impulso elettrico, applicato alla superficie conduttiva su cui stanno crescendo, provoca la formazione di pori attraverso la membrana cellulare. Questa è l'elettroporazione. Le cellule che crescono sulla superficie di vetro non conduttiva immediatamente adiacente alla regione elettroporata non assorbono il giallo di Lucifero per elettroporazione, ma acquisiscono il colorante fluorescente quando viene passato a loro attraverso giunzioni gap che le collegano alle celle elettroporate. I risultati del trasferimento del colorante da una cellula all'altra possono essere osservati al microscopio sotto l'illuminazione a fluorescenza. Questa tecnica consente di quantificare con precisione la comunicazione giunzionale gap. Inoltre, può essere utilizzato per l'introduzione di peptidi o altre molecole non permiche e il trasferimento di piccoli peptidi elettroporati attraverso giunzioni gap per inibire il segnale nelle celle adiacenti non elettroporate è una potente dimostrazione dell'inibizione del segnale.

Introduzione

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L'applicazione di corrente elettrica a una cella provoca la formazione di pori nella membrana cellulare, da un processo chiamato elettroporazione. I pori permettono il passaggio di una varietà di molecole nonpermeant attraverso la membrana. Il campo elettrico può essere controllata con precisione, in modo che i pori formati sono molto piccole e richiudersi rapidamente, con il minimo disturbo per la fisiologia cellulare. È interessante notare, cellule aderenti possono essere coltivate su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente (ITO) e elettroporate in situ, che si trova sulla superficie dove crescono, senza essere distaccato per essere elettroporate in sospensione. Le cellule possono crescere molto bene su questa superficie, e come sono collegati ed estese, osservazione microscopica dettagliata è possibile. Usando questa tecnica, piccole molecole nonpermeant possono essere introdotti istantaneamente e in sostanza il 100% delle cellule, che rende questa tecnica particolarmente adatto per studi sull'attivazione di components di un percorso seguito stimolazione ligando di un recettore (recensito in 1).

L'elettroporazione è stata utilizzata principalmente per l'introduzione di DNA (chiamato anche electrotransfection). Tuttavia, elettroporazione in situ può essere utile per l'introduzione di una grande varietà di molecole, come peptidi 2-4, oligonucleotidi antisenso, come RNA, oligonucleotidi a doppio filamento di DNA esca per inibire fattore di trascrizione vincolante, o siRNA 3,5, 6, 7-10 nucleotidi radioattivi, proteine ​​11 12 o pro-farmaci 13. A seguito di elettroporazione, le cellule possono essere lisate per analisi biochimiche o fissate e colorate con anticorpi.

Il rivestimento conduttivo ITO è molto sottile, 800-1,000Å, in modo che la crescita cellulare non è disturbato dalla differenza di altezza delle due superfici, come le cellule crescono lungo il bordo del rivestimento conduttivo. Questo offre il vantaggio che non electropciente cellule possono essere coltivate fianco a fianco con quelli elettroporate, per servire come controlli. Lo stesso approccio può essere utilizzato per l'esame di spazi di giunzione, la comunicazione intercellulare (GJIC), come descritto nel video.

Giunzioni sono canali che collegano gli interni di celle adiacenti 14. Gap giunzionale, comunicazione intercellulare svolge un ruolo importante nella formazione del tumore e metastasi, mentre oncogeni quali Src sopprimono GJIC 15,16. Per esaminare GJIC un colorante fluorescente, come Lucifero giallo (LY) è spesso introdotto in cellule in coltura tramite microiniezione o raschiare carico 17 e la diffusione del colorante nelle cellule vicine all 'osservazione microscopica sotto illuminazione a fluorescenza. Queste tecniche però invariabilmente causano danni alle cellule. Descriviamo ora una tecnica in cui le cellule sono coltivate su un vetrino che è parzialmente ricoperto di ITO 18. Un impulso elettrico è stato applicato in presenza di LY (o altri coloranti) cautilizzando la sua penetrazione nelle cellule in crescita da parte conduttiva della diapositiva, mentre la migrazione colorante per le adiacenti, cellule non elettroporate è stata osservata al microscopio con illuminazione a fluorescenza. Per evitare di cellule sensibili inquietanti che possono tendere a staccarsi dalla monostrato, un'assemblea è stato progettato che non richiedono un elettrodo per essere posizionato sulla parte superiore delle cellule di applicare la corrente elettrica 19. Questo approccio offre la possibilità di quantificare GJIC in un gran numero di cellule, senza alcun disturbo rilevabile al metabolismo cellulare, come indicato dall'assenza di un effetto sulla durata della fase G1 seguente siero stimolazione 12, aumento dei livelli di FOS protooncogene proteine ​​(Raptis, inedito) o due chinasi associate a stress cellulare, il maiale p38 o JNK / SAPK chinasi 1. Questo approccio ha reso possibile l'esame del legame tra i livelli di espressione dell'oncogene, trasformazione e GJIC 18, nonché l'effetto di Src e Stat3 su GJIC in una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule in coltura fresco da campioni di tumore del polmone 20-23. Inoltre, in elettroporazione situ con la configurazione descritta, che manca di un elettrodo superiore è stato impiegato con successo per la manifestazione di chiusura del gap junction sulla differenziazione adipocytic, anche se l'attaccamento cellulare al substrato è ridotto in quella fase 19,24.

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Protocollo

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1 placcatura le cellule del elettroporazione Chambers

  1. In una cappa a flusso laminare, trypsinize le celle utilizzando una tecnica sterile, come al solito.
    NOTA: E 'molto importante eliminare mediante centrifugazione tutte le tracce di tripsina, perché possono ostacolare la diffusione delle cellule sul vetro, quindi la formazione di adherens e giunzioni.
  2. Pipettare 1 ml di sospensione cellulare nelle camere di elettroporazione sterili forniti con il elettroporatore in situ (Figura 1), e posto a 37 ° C, CO 2 incubatore.
    NOTA: l'adesione delle cellule può essere migliorata placcatura su fibronectina, collagene, poli-lisina o di cellule e tessuti adesivo (vedi Materiali Tabella).
  3. Quando le cellule hanno formato uno strato confluente sono pronti per l'esame GJIC.

2 elettroporazione Procedura

Elettroporazione per l'esame GJIC può essere condotta al di fuori di una cappa a flusso laminare,dal momento che richiede solo pochi minuti. Se sono necessari tempi di incubazione più lunghi per un esperimento specifico, allora può essere condotta interamente in una cappa a flusso laminare. In tutti i casi, le sezioni dove si coltivano le cellule devono essere sterili.

  1. Preparare una / ml soluzione gialla Lucifero 5 mg: sciogliere 10 mg di polvere LY (fornito con il elettroporatore) in 2 ml di terreno di coltura privo di calcio. Per esperimenti che richiedono tempi di incubazione più lunghi, filtro-sterilizzare la soluzione e conservare a 4 ° C.
  2. Aspirare il terreno di crescita e lavare le cellule con terreno privo di calcio, facendo attenzione a non graffiare il monostrato o asciugare le cellule. Se le cellule sono asciugati solito hanno nuclei più scuri e raccogliere LY, senza elettroporazione. L'effetto è più pronunciato nel mezzo della slitta che è più esposto a correnti d'aria (Figura 4F).
  3. Con una pipetta Eppendorf, pipetta la soluzione colorante per le cellule (400 microlitri per tutta la camera), sul bordo della camera, being attenzione a non toccare lo strato di cellule.
  4. Posizionare la camera nel supporto fornito con il elettroporatore e applicare un impulso della forza appropriata (vedi discussione).
  5. Aspirare accuratamente alcuni della soluzione LY. Può essere riutilizzato una seconda volta per esperimenti meno importanti.
  6. Aggiungi DMEM privo di calcio contenente siero dializzato del 10%.
  7. Incubare le cellule per 3-5 minuti in incubatrice per consentire il trasferimento colorante attraverso giunzioni gap.
    NOTA: L'inclusione di siero dializzato, a questo punto aiuta chiusura dei pori.
  8. Lavare il colorante costituite in società con DMEM senza calcio per l'osservazione di cellule vive. In alternativa, le cellule possono essere fissate in questa fase, attraverso l'aggiunta di 4% di formaldeide al pozzo, poi lavate con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato). In tutti i casi il lavaggio deve rimuovere tutta sfondo.
    NOTA: In esperimenti preliminari per determinare le condizioni ottimali, se la tensione è troppo bassa, allora è possibile lasciare che le cellule recuperare nel incubator per alcuni minuti e l'elettroporazione stesso vetrino una seconda volta, per risparmiare nel costo di diapositive.

3 Esame microscopico

  1. Osservare le cellule sotto illuminazione a fluorescenza, utilizzando un microscopio invertito equipaggiato con il filtro appropriato per il colorante utilizzato. Per Lucifero giallo, eccitazione è 423nm, 555nm emissione, filtro WBV per un microscopio Nikon IX70.
  2. Eliminare effetti menisco mettendo un vetro di copertura antiscivolo sulla parte superiore della plastica e, dopo il riempimento al top con il liquido, per esaminare la morfologia delle cellule in contrasto di fase. Per le foto migliori, il pozzo può essere staccato dalla diapositiva, e il coprioggetto posto sul telaio. Per cellule fissate, il pozzo può essere riempito con glicerolo per l'osservazione microscopica, mentre per le cellule vive deve essere riempito con terreno di crescita.
    Attenzione: Il lavaggio e la fotografia è più facile se le cellule vengono fissate con formaldeide a seguito del trasferimento del colorante (precedente punto 2.7). Se le cellule sonot fissato, la fluorescenza viene eliminata dalle cellule entro circa 60 minuti a seconda del tipo di cellula, la tensione e la quantità di LY introdotto mentre nelle cellule fissate fluorescenza viene mantenuta per diverse ore. Tuttavia, fluorescenza svanisce o si dissolve dopo O / N incubazione, anche in cellule fissate. Per questo motivo, illustrazioni, devono essere prese subito dopo l'elettroporazione (Figura 2).

4. quantificazione di comunicazione intercellulare

  1. Fotografa le cellule con un obiettivo 20x in fluorescenza e contrasto di fase (Figura 3).
  2. Identificare e contrassegnare con una stella le cellule elettroporate al confine con la zona non elettroporate (figura 2, freccia, bordo elettroporazione).
  3. Identificare e segnare con un punto le cellule fluorescenti sul lato non-elettroporate, in cui il colorante è trasferito attraverso giunzioni gap (Figure 3A e 3B).
  4. Dividere il numero totale dicellule fluorescenti sulla zona non elettroporate per il numero di cellule elettroporate lungo il bordo (Figure 3A e 3B).
    NOTA: Il trasferimento di almeno 200 cellule elettroporate di frontiera contigue viene calcolato per ogni esperimento. Il numero ottenuto è il valore GJIC.

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Risultati

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La figura 2 mostra fegato di ratto cellule epiteliali T51B 22, elettroporate con LY e fotografati sotto fluorescenza (pannello A e B), o contrasto di fase (C) illuminazione, seguito fissaggio e lavaggio. Nel pannello A, il bordo dell'area elettroporate è indicato in rosso. Il gradiente di fluorescenza a destra della linea rossa indica il trasferimento attraverso giunzioni gap. Nella Figura 3A e 3B, viene mostrata la quantificazione di comunicazione gap giunzi...

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Discussione

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Passaggi critici nel protocollo

Materiale elettroporate
La purezza del materiale da elettroporate è molto importante. Se le cellule sono molto piatto, devono essere utilizzate concentrazioni più elevate di poi il colorante inseguimento (fino a 20 mg / ml per LY) e in tali casi, la purezza è ancora più importante che nelle cellule con una forma più sferica 1. Oltre LY una grande varietà di altri coloranti o molecole nonpermeant sono stati impiegati, come ad es...

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Dichiarazioni

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L'autore corrispondente è l'inventore di un brevetto detenuto dalla Queen's University, che è stato concesso in licenza a Cell Projects Inc. L'azienda o l'Università non hanno avuto alcuna influenza sul contenuto dell'articolo.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Lowell Cochran per l'assistenza esperta in videografia. L'assistenza finanziaria del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), della Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), della Canadian Breast Cancer Research Alliance, dell'Ontario Centers of Excellence, del Breast Cancer Action Kingston e del Clare Nelson bequest fund attraverso sovvenzioni a LR è ringraziata. SG è stato il destinatario di una borsa di studio NSERC. MG è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato del Breast Cancer Program dell'esercito degli Stati Uniti, del Ministero della Ricerca e dell'Innovazione della Provincia dell'Ontario e del Comitato consultivo di ricerca della Queen's University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM senza iclone di calcio(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Siero di vitello donatore PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Siero fetale bovino PAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Apparecchio di elettroporazioneCell Projects Ltd Regno Unito: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd Regno UnitoACE-04-CC4 pozzetti
ChambersCell Projects Ltd Regno UnitoACE-08-CC8 pozzetti
Lucifer YellowCell Projects Ltd Regno UnitoACE-25-LYElevata purezza
CelTakBD Biosciences354240Adesivo cellulare e tissutale
FibronectinaSigma AldrichF1141
CollageneBD Biosciences354236
Poli-lisinaSigma AldrichP8920

Riferimenti

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