Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Summary

Array CGH per la rilevazione di varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l'analisi del cariotipo G-fasciato. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizio diagnostico.

Abstract

Array CGH per il rilevamento delle varianti del numero di copie genomiche ha sostituito l'analisi del cariotipo in banda G. Questo articolo descrive la tecnologia e la sua applicazione in un laboratorio di servizi di diagnostica clinica. Il DNA estratto dal campione di un paziente (sangue, saliva o altri tipi di tessuto) è marcato con un fluorocromo (cianina 5 o cianina 3). Un campione di DNA di riferimento viene etichettato con il fluorocromo opposto. Segue una fase di pulizia per rimuovere i nucleotidi non incorporati prima che i DNA marcati vengano mescolati e risospesi in un tampone di ibridazione e applicati a un array comprendente ~60.000 sonde oligonucleotidiche da loci in tutto il genoma, con un'elevata densità di sonde in aree clinicamente importanti. Dopo l'ibridazione, gli array vengono lavati, quindi scansionati e le immagini risultanti vengono analizzate per misurare la fluorescenza rossa e verde per ciascuna sonda. Il software viene utilizzato per valutare la qualità di ogni misurazione della sonda, calcolare il rapporto tra fluorescenza rossa e verde e rilevare potenziali variazioni del numero di copie.

Introduction

E 'noto da molti anni che delezioni o copie extra di segmenti cromosomici causano ritardo mentale, dismorfismi e malformazioni congentical, e in alcuni casi causare sindromi genetiche ^1. Tuttavia, l'unica tecnologia disponibile fino alla metà degli anni 2000 per la rilevazione genoma a livello di questi cambiamenti era G fasciato analisi cromosomica, che ha una risoluzione di circa 5-10 MB, a seconda della regione e la natura dello squilibrio, e che non può rilevare cromosomi anormali in cui il materiale è stato sostituito da una regione di un cromosoma differente con lo stesso pattern di bande. Ausiliari tecniche di citogenetica, come ibridazione ....

Protocol

1. L'etichettatura di reazione

1. Prima dell'uso, dUTPs pre-un'aliquota cianinico 3 e 5-etichettati, nucleotidi senza etichetta e primer casuali alle concentrazioni consigliate dal produttore in lastre e negozio a 96 pozzetti a -20 C pronto per l'uso. Ai fini del presente protocollo, aliquota 10,5 ml di adeguata dUTP etichettato e 10,5 ml nucleotidi senza etichetta e primer casuali in ogni pozzetto.
2. Scongelare il piatto pronto all'uso 96 pozzetti di nucleotidi e primer a 4 ° C per circa 1 ora, al riparo dalla luce.
3. Una volta scongelato, equilibrare questo piatto a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, al riparo dal....

Results

Ogni sonda su una matrice ibrida è visualizzato come una miscela di fluorocromi rosso e verde (vedi Figura 1). Il rapporto di rosso al segnale verde fluorescente per ciascuna sonda viene quantificato dallo scanner e il relativo software traccia questi come rapporti log2 base alla loro posizione genomica, e identifica le regioni di confine preimpostati fuori. L'array tracce risultanti permettono l'interpretazione delle regioni identificate come genomicamente sbilanciato. Per esempio, la traccia di un bam.......

Discussion

Array CGH non rileverà riarrangiamenti bilanciati o anomalie ploidia quali triploidia. Inoltre, basso livello squilibri mosaico non possono essere rilevati. Tuttavia, CGH array ha una risoluzione più alta per il rilevamento CNV di analisi cromosomica G-banded quale essa ha sostituito in molti laboratori di citogenetica. E 'quindi il gold standard attuale per tutto il genoma di rilevamento CNV. Essa può essere sostituito da tecnologie di sequenziamento di prossima generazione per il futuro, ma attualmente, il loro co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray CGH 8 x 60K	Agilent	G4126
Buffer di lavaggio Array CGH	Agilent	5188-5226
Buffer di ibridazione Array CGH	Agilent	5188-5380
Kit di purificazione Minelute	Qiagen	28006
Kit di etichettatura Array CGH	Enzo	ENZ-42672-0000