Questo articolo si concentrerà sullo sviluppo di superfici polimeriche rivestite a lungo termine, coltura stabile di cellule staminali derivate epatociti umani.
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Articolo metodologico
Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attualmente, una delle principali limitazioni nella biologia cellulare è il mantenimento del fenotipo cellulare differenziato. Le matrici biologiche sono comunemente utilizzate per la coltura e il mantenimento di epatociti derivati da cellule staminali primarie e pluripotenti. Sebbene le matrici biologiche siano utili, consentono la coltura a breve termine degli epatociti, limitandone l'applicazione diffusa. Abbiamo cercato di superare i limiti utilizzando un rivestimento in polimero sintetico. I polimeri rappresentano una delle più ampie classi di biomateriali e possiedono un'ampia gamma di proprietà meccaniche, fisiche e chimiche, che possono essere messe a punto per lo scopo. È importante sottolineare che tali materiali possono essere scalati in base a standard di qualità garantita e mostrare coerenza da lotto a lotto. Ciò è essenziale se le cellule devono essere espanse per lo screening ad alto rendimento nell'industria farmaceutica o per la terapia cellulare. I poliuretani (PU) sono un gruppo di materiali che si sono dimostrati promettenti nelle colture cellulari. Vengono presentati e discussi i nostri recenti progressi nell'ottimizzazione di una superficie rivestita in poliuretano, per la coltura a lungo termine di epatociti umani che mostrano un fenotipo stabile.
Introduzione
I materiali biologici sono stati ampiamente utilizzati per la manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti 1. Mentre permettendo, questi substrati biologici spesso contengono una miriade di componenti non definiti. Matrigel è un substrato comunemente usato per la cultura e la differenziazione delle cellule staminali. Purtroppo, la sua composizione variabile influenza la funzione delle cellule e fenotipo. Anche se una serie di matrici biologiche alternative, più definite sono state utilizzate 2-7, la loro origine animale o scarsa scalabilità li rende i candidati non idonei per la produzione industriale. Pertanto, l'....
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Protocollo
1. Sintesi di PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diol)
Schema 1: Sintesi di PHNAGD Rappresentazione schematica della sintesi di PHNAGD.. PHNAGD è stato preparato dalla reazione di 1,6-Hexanodiol, dietilenglicole, neoppentyl glicole e acido adipico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diolo.
- Applicare trattamento termico ai monomeri 1,6-esandiolo, di (etilengl....
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Risultati
Solvente del polimero influenza la topografia della superficie del polimero rivestito
Poliuretano 134 è stato solubilizzato in cloroformio, da solo o in combinazione con toluene o tetraidrofurano o diclorometano ei vetrini spin-rivestiti con le diverse formulazioni. Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia a forza atomica (AFM) sono stati usati per caratterizzare le proprietà fisiche dei rivestimenti polimerici (Figura 1). Il rivestimento otte.......
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Discussione
Molti dei metodi attualmente utilizzati per generare epatociti da cellule staminali si basano su matrici indefinite di origine animale. Questi supporti possono essere costosi e molto variabile, che colpisce la funzione delle cellule e la stabilità, che rappresentano una barriera significativa applicazione. Pertanto, abbiamo effettuato una schermata per materiali sintetici che supportano la cultura di cellule staminali epatociti derivati. Abbiamo identificato, un semplice poliuretano (PU134), formata da polimerizzazione .......
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Dichiarazioni
DCH è CSO, direttore, fondatore e azionista di FibromEd Products Ltd. MB e JPI sono soci fondatori in FibromEd Products Ltd.
Ringraziamenti
DCH, MB e FK sono stati sostenuti da un EPSRC Segui su Fund. BL-V e DS sono stati supportati da ogni MRC borse di dottorato di ricerca. KC è stato sostenuto da un finanziamento della piattaforma di Medicina Rigenerativa Regno Unito.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sintesi, preparazione, rivestimento e caratterizzazione di vetrini coprioggetti rivestiti in polimero PU134 | |||
| Shaker | Edmun Bü hler | KS-15 | |
| Irradiatore | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Sistema di rivestimento speciale | Spin Coater | P-6708 | |
| Microscopio elettronico a scansione | Philips | XL30CPSEM | |
| Microscopio a forza atomica | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| Lampadina UV | ESCO | ||
| NanoScope software di analisi | VEECO | versione 1.20 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | TH45200 | Usa il software Volocity 4 |
| Piastre per coltura tissutale | Corning, Regno Unito | 3527 | |
| vetrini Forniture | laboratorio scientifico | MIC3308 | |
| Dietilenglicole | Sigma– Aldrich | 93171 | |
| 1,6-esandiolo | Sigma– Aldrich | 240117 | |
| Glicole neopentilico | Sigma... Aldrich | 408255 | |
| Acido adipico | Sigma– Aldrich | 9582 | |
| anidro N,N-Dimetilformammide | Sigma– Aldrich | 227056 | |
| Etere dietilico | Sigma– Aldrich | 676845 | |
| titanio (IV) butossido | Sigma– Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butandiolo | Sigma– Aldrich | 493732 | |
| Forno a vuoto | Thermoscientific | ||
| 4,4'-Methylenebis(fenil isocianato) | Sigma– Aldrich | 101688 | |
| Tetraidrofurano | Sigma– Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate tampon salino (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Conservare a temperatura ambiente |
| PBST, PBS composto da 0,1% TWEEN 20 | Forniture di laboratorio scientifico Ltd | EC607 | |
| Metanolo | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich, Regno Unito | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Composto da Tris HCl e glicerolo secondo le istruzioni |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
Riferimenti
- Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and diffe....
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Ristampe e permessi
