Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati

Summary

Questo articolo si concentrerà sullo sviluppo di superfici polimeriche rivestite a lungo termine, coltura stabile di cellule staminali derivate epatociti umani.

Abstract

Attualmente, una delle principali limitazioni nella biologia cellulare è il mantenimento del fenotipo cellulare differenziato. Le matrici biologiche sono comunemente utilizzate per la coltura e il mantenimento di epatociti derivati da cellule staminali primarie e pluripotenti. Sebbene le matrici biologiche siano utili, consentono la coltura a breve termine degli epatociti, limitandone l'applicazione diffusa. Abbiamo cercato di superare i limiti utilizzando un rivestimento in polimero sintetico. I polimeri rappresentano una delle più ampie classi di biomateriali e possiedono un'ampia gamma di proprietà meccaniche, fisiche e chimiche, che possono essere messe a punto per lo scopo. È importante sottolineare che tali materiali possono essere scalati in base a standard di qualità garantita e mostrare coerenza da lotto a lotto. Ciò è essenziale se le cellule devono essere espanse per lo screening ad alto rendimento nell'industria farmaceutica o per la terapia cellulare. I poliuretani (PU) sono un gruppo di materiali che si sono dimostrati promettenti nelle colture cellulari. Vengono presentati e discussi i nostri recenti progressi nell'ottimizzazione di una superficie rivestita in poliuretano, per la coltura a lungo termine di epatociti umani che mostrano un fenotipo stabile.

Introduction

I materiali biologici sono stati ampiamente utilizzati per la manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti ^1. Mentre permettendo, questi substrati biologici spesso contengono una miriade di componenti non definiti. Matrigel è un substrato comunemente usato per la cultura e la differenziazione delle cellule staminali. Purtroppo, la sua composizione variabile influenza la funzione delle cellule e fenotipo. Anche se una serie di matrici biologiche alternative, più definite sono state utilizzate ^2-7, la loro origine animale o scarsa scalabilità li rende i candidati non idonei per la produzione industriale. Pertanto, l'individuazione di alternative sintetiche, a composizione definita e prestazioni affidabili, sono obiettivi chiave nella ricerca sulle cellule staminali.

Nel tentativo di superare i limiti dei indefiniti substrati di coltura cellulare, collaborazioni interdisciplinari tra chimica e biologia hanno identificato materiali sintetici con la capacità di supportare fenotipo cellulare. Synthsubstrati ETIC sono scalabili, economiche, e possono essere realizzati in strutture 3D complesse, mimando l'ambiente in vivo. Grazie a queste proprietà substrati sintetici sono stati ampiamente utilizzati per sostenere e guidare la differenziazione di molti tipi di cellule ^8-10.

Test di throughput avanzate e alte hanno facilitato la rapida proiezione di materiali sintetici, dai grandi librerie, e consegnati nuovi materiali con proprietà flessibili con ampie applicazioni nella ricerca e nello sviluppo ^11-13 biomedico. Utilizzando un elevato throughput, polimero tecnologia di screening micro-array, abbiamo rapidamente identificato un semplice poliuretano (PU134), adatto per la manutenzione di cellule staminali derivate epatociti umani. Questo polimero è risultato essere superiore a substrati derivati ​​di origine animale per quanto riguarda la differenziazione e la funzione ^14-16 epatociti. Abbiamo quindi ottimizzato il processo di rivestimento in condizioni, la topografia e la sterilizzazione per accedere effettisulle prestazioni del polimero nella stabilizzazione funzione degli epatociti e la durata della vita. Ciò ha implicazioni significative per quanto riguarda la comprensione fondamenti della biologia degli epatociti per la modellazione basata su cellule e applicazioni di medicina rigenerativa.

La tecnologia qui descritta costituisce un esempio di come la superficie di un polimero sintetico può essere ottimizzato per preservare fenotipo cellulare. Crediamo che la combinazione di questa tecnologia con un protocollo di differenziazione degli epatociti privo di siero efficace ha il potenziale per fornire una produzione scalabile di epatociti per l'utilizzo nella modellazione in vitro e della medicina rigenerativa.

Protocol

1. Sintesi di PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diol)

Schema 1: Sintesi di PHNAGD Rappresentazione schematica della sintesi di PHNAGD.. PHNAGD è stato preparato dalla reazione di 1,6-Hexanodiol, dietilenglicole, neoppentyl glicole e acido adipico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentilglicole / di (glicole etilenico) Acido -ALt-adipico] diolo.

1. Applicare trattamento termico ai monomeri 1,6-esandiolo, di (etilenglicole) e neopentilglicole a 40 ° C per 48 ore in stufa sotto vuoto per rimuovere l'acqua residua. Lasciare al freddo fino a RT sotto vuoto.
2. Aggiungere 22 mmol di ciascun monomero e acido adipico (55 mmol) in un pallone a fondo tondo a due colli munito di una barra di agitazione e connesso ad un apparecchio di Dean-Stark.
3. Mettere tutta l'assemblea sotto vuoto e scaldare delicatamente il glassware a 40 ° C per 6 ore, in modo da evitare l'assorbimento di umidità durante l'aggiunta della sostanza chimica nel pallone.
4. Aggiungi tramite siringa, goccia a goccia, 0,0055 moli di titanio catalizzatore (IV) butossido.
5. Mescolare la miscela di reazione a 180 ° C, in atmosfera N ₂ per 24 ore, e raccogliere l'acqua residua nella trappola di Dean-Stark. Lasciare raffreddare il prodotto a temperatura ambiente.

2 Sintesi di PU134

Schema 2: Sintesi di PU134 Rappresentazione schematica della sintesi del poliuretano 134 PU134 è stato preparato per reazione di 1,0 equiv di un PHNGAD con 2,0 equiv di un Metilenebis 4,4-(fenil isocianato), seguita dall'aggiunta di 1,0. equiv di una catena extender 1,4-butandiolo.

1. Mescolare un equivalente della PHNGAD poliolo (Mn ~ 1.800 Da, 3.2 mmol) con due equivalenti di 4'4-Metilenebis (fenil isocianato) (6,4 mmol) in anidra N, N -Dimethylformamide (12 ml).
2. Mescolare la miscela di reazione a 70 ° C, in atmosfera di N _2.
3. Aggiungi tramite siringa, goccia a goccia il titanio catalizzatore (IV) butossido (0,8% in peso).
4. Dopo 1 ora, aggiungere uno equivalente della catena extender 1,4-butandiolo (3,2 mmol). Aumentare la temperatura a 90 ° C e agitare per 24 h in atmosfera di N _2.
5. Dopo la reazione, raccogliere il poliuretano per precipitazione con l'aggiunta di etere etilico (esano o acqua potrebbe essere utilizzato anche) gocciolamento nella soluzione di reazione fino a quando si verifica la precipitazione.
6. Centrifugare la soluzione a 5.300 xg per 5 min.
7. Decantare il surnatante e asciugare a 40 ° C in un forno a vuoto fino a quando il solvente evapora.
   Nota: Al fine di garantire che il prodotto finale della reazione possedere i corretti parametri relativi alla distribuzione dei pesi molecolari, il Grou funzionaleps del polimero, e le temperature di fusione e di transizione vetrosa, può essere utilizzato varie tecniche e metodi analitici, quali la cromatografia a permeazione di gel o spettroscopia FITR.

3 Preparazione di PU134 Solutions

1. Pesare 200 mg di PU134 in una bottiglia di vetro.
2. Diluire PU134 ad una concentrazione finale del 2% in diversi solventi: cloroformio, una combinazione di cloroformio e toluene in rapporto 1: 1, tetraidrofurano, e la combinazione di tetraidrofurano e diclorometano nel rapporto 1: 1.
   Nota: L'elezione del solvente destra varia a seconda del polimero da utilizzare. Solventi diversi possiedono diversi punti di ebollizione che possono influenzare la solubilizzazione del polimero.
3. La soluzione viene agitata per 20 minuti a temperatura ambiente usando un agitatore ad una velocità di 200 mot / min, fino a quando la soluzione diventa omogenea e nessun precipitato viene osservata.

4 Rivestimento di diapositive di vetro con PU134

1. Posizionare un rouDN 15 mm ² coprioggetto sulla verniciatura giro.
2. Applicare 50 ml di soluzione di PU134 per ciascuno utilizzando una pipetta. Regolare il volume della soluzione PU134 conseguenza per il formato coprioggetto desiderato mantenendo il volume di superficie rapporto proporzionale.
3. Spin ogni coprioggetto per 7 secondi a 23 x g.
4. Aria coprioggetto asciutto a temperatura ambiente per almeno 24 ore prima della sterilizzazione.

5. irradiazione di Coprioggetti

1. Gamma-irradiare coprioggetto rivestito di polimero, applicando una dose di 10 Grays utilizzando un irradiatore laboratorio per 12 min.
2. UV irradiare polimero rivestito coprioggetto utilizzando un 30 W, lampadina UV per 16 min ogni lato.
3. Posizionare il coprioggetto polimero rivestito in una piastra di coltura tissutale idonea a seconda della dimensione di diapositiva.

6. Microscopia Elettronica a Scansione

1. Oro cappotto polimero coprioggetto per sputtering per 200 sec in un clima di 5 x 10 ^-1 millibar di pressione.
2. Cattura la micrographs del coprioggetto polimero rivestito utilizzando un microscopio elettronico a scansione ad una tensione di accelerazione di 20 kV in modalità di imaging elettroni secondari.

7. Osservazioni Microscopia a Forza Atomica

1. Scansione un'area di 20 x 20 micron della superficie del polimero.
2. Impostare una frequenza di scansione da 1,32 Hz a 1,60 Hz.
3. Impostare una risoluzione di 512 x 512 pixel nella regione scansionata.
4. Calcolare il Root Mean Square (RMS o Rq) del rivestimento, utilizzando la media delle deviazioni di altezza tratti dal piano dati dell'immagine media, espressa come:
   
   Dove Zi è il valore corrente Z, e N è il numero di punti all'interno dell'area dato.
5. 7.5 Calcolare la deviazione o media rugosità superficiale (Ra) dell'immagine utilizzando,
   
   Dove Z (x) è la funzione che descrive tegli superficie profilo analizzato in termini di altezza (Z) e la posizione (x) del campione sulla lunghezza valutazione "L". Ra rappresenta il valore medio della superficie rispetto al piano di mezzeria.

8 coltura cellulare e la differenziazione

1. Cultura e differenziare l'umano linea di cellule staminali embrionali (hESC) H9 come descritto in Hay ^17.
2. Staccare cellule utilizzando un reagente dissociazione e replate su vetrini rivestiti PU134 al giorno 9 del processo di differenziazione, in presenza di un mezzo privo di siero come descritto in Szkolnicka ^18,19.
   Nota: L'uso di una cella di dissociazione enzimatica è preferito al distacco delle cellule fisica.

9. citocromo P450 saggio funzionale

1. Misurare l'attività del CYP3A seguendo le istruzioni del produttore.
2. Incubare hESC epatociti derivati ​​al giorno 13 o il giorno 19, e dei media, senza cellule - come controllo negativo, con il substr appropriatomangiato per 5 ore a 37 ° C.
3. Raccogliere surnatanti di cellule e dei media, eseguire il test secondo le istruzioni del produttore.
4. Misurare il livello di attività CYP e relativa normalizzata alla superficie (cm ^2).

10 Immunostaining

1. Lavare hESC derivato epatociti con PBS, per 1 min, ripetere due volte.
2. Aggiungere il ghiaccio freddo 100% di metanolo per riparare le cellule, posto in -20 ° C per 10 min.
3. Lavare le cellule con PBS per 5 minuti e ripetere due volte.
4. Incubare le cellule con PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA per 1 ora a RT.
5. Aspirare la soluzione PBST e aggiungere l'anticorpo primario appropriato diluito in PBS / T (0,1% di Tween) / 1% BSA, incubare a 4 ° C con agitazione O / N.
6. Lavare le cellule con PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA per 5 min e ripetuto tre volte.
7. Diluire l'anticorpo appropriato in PBS / T (0,1% di Tween) / 1% BSA, aggiungere alle cellule e incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione.
8. Lavare le cellule con PBS per 5 minuti e ripetere per tre volte.
9. Aggiungi Mowiol 488 (contenente DAPI 1: 1.000) per ciascun bene, aggiungere un coprioggetto delicatamente per ridurre il numero di bolle d'aria. Conservare le cellule fissato a 4 ° C al buio. Osservare colorazione utilizzando un microscopio con appositi filtri e lampada fluorescente. Gli anticorpi primari e secondari ottimizzati sono elencati nella Tabella 1.

Results

Solvente del polimero influenza la topografia della superficie del polimero rivestito

Poliuretano 134 è stato solubilizzato in cloroformio, da solo o in combinazione con toluene o tetraidrofurano o diclorometano ei vetrini spin-rivestiti con le diverse formulazioni. Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia a forza atomica (AFM) sono stati usati per caratterizzare le proprietà fisiche dei rivestimenti polimerici (Figura 1). Il rivestimento otte...

Discussion

Molti dei metodi attualmente utilizzati per generare epatociti da cellule staminali si basano su matrici indefinite di origine animale. Questi supporti possono essere costosi e molto variabile, che colpisce la funzione delle cellule e la stabilità, che rappresentano una barriera significativa applicazione. Pertanto, abbiamo effettuato una schermata per materiali sintetici che supportano la cultura di cellule staminali epatociti derivati. Abbiamo identificato, un semplice poliuretano (PU134), formata da polimerizzazione ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sintesi, preparazione, rivestimento e caratterizzazione di vetrini coprioggetti rivestiti in polimero PU134
Shaker	Edmun Bü hler	KS-15
Irradiatore	CIS Biointernational	IBL 637
Sistema di rivestimento speciale	Spin Coater	P-6708
Microscopio elettronico a scansione	Philips	XL30CPSEM
Microscopio a forza atomica	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
Lampadina UV	ESCO
NanoScope software di analisi	VEECO		versione 1.20
Microscopio a fluorescenza	Olympus	TH45200	Usa il software Volocity 4
Piastre per coltura tissutale	Corning, Regno Unito	3527
vetrini Forniture	laboratorio scientifico	MIC3308
Dietilenglicole	Sigma– Aldrich	93171
1,6-esandiolo	Sigma– Aldrich	240117
Glicole neopentilico	Sigma... Aldrich	408255
Acido adipico	Sigma– Aldrich	9582
anidro N,N-Dimetilformammide	Sigma– Aldrich	227056
Etere dietilico	Sigma– Aldrich	676845
titanio (IV) butossido	Sigma– Aldrich	244112
1,4-butandiolo	Sigma– Aldrich	493732
Forno a vuoto	Thermoscientific
4,4'-Methylenebis(fenil isocianato)	Sigma– Aldrich	101688
Tetraidrofurano	Sigma– Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate tampon salino (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Conservare a temperatura ambiente
PBST, PBS composto da 0,1% TWEEN 20	Forniture di laboratorio scientifico Ltd	EC607
Metanolo	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich, Regno Unito	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Composto da Tris HCl e glicerolo secondo le istruzioni
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013