Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in<em&gt; Xenopus laevis</em

Sommario

Xenopus laevis girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco nero. Questo comportamento è guidato dalla loro visione. Sulla base di questo comportamento, vi presentiamo un semplice test per testare la funzione visiva dei girini.

Abstract

Misurazione della funzione visiva nei girini di rana, Xenopus laevis, consente lo screening per la cecità di animali vivi. La risposta optocinetico è una visione-based, un comportamento riflessivo che è stato osservato in tutti i vertebrati esaminati. Occhi girino sono piccole quindi la risposta vibrazione coda è stato usato come misura alternativa, che richiede un tecnico addestrato per registrare la risposta sottile. Abbiamo sviluppato un saggio comportamento alternativo basato sul fatto che girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un serbatoio quando posto in una vasca con lati sia in bianco e nero. Il saggio qui presentato è un poco costoso, semplice alternativa che crea una risposta che può essere facilmente misurata. L'installazione consiste in un cavalletto, webcam e serbatoi di prova nidificati, facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori di Xenopus. Questo articolo include un filmato che mostra il comportamento dei girini, prima e dopo aver tagliato il nervo ottico. Al fine di testare la funzione di un occhio, includiamo anche rappresentantirisultati rappresentative di un girino in cui ogni occhio ha subito assotomia retinica in giorni consecutivi. Studi futuri potrebbero sviluppare una versione automatizzata di questo test per verificare la visione di molti girini in una volta.

Introduzione

Xenopus laevis sono stati utilizzati come organismo modello per studiare la formazione dell'occhio. Gli occhi si sviluppano rapidamente, crescita verso la maturità in meno di una settimana per i geni di prova o percorsi che hanno un effetto sullo sviluppo visivo e la funzione. Per testare funzione visiva, la risposta optocinetico e optomotor è stato usato in zebrafish e girini Xenopus rispettivamente ^1,2. Perché gli occhi dei girini di Xenopus sono relativamente più piccolo di zebrafish, questo test richiede l'uso di attrezzature specializzate e personale addestrato per rilevare la coda-flip e movimenti oculari comportamento sottile in Xenopus. Un comportamento più robusto in Xenopus è la preferenza per il nuoto in un serbatoio con uno sfondo bianco, che viene qui descritto ^3. Quando si posiziona un girino in mezzo serbatoio nero / mezzo bianco, il girino pre-metamorfica nuota rapidamente al lato bianco del serbatoio. Abbiamo già usato questo test per determinare se pluripotenti cellule derivategli occhi erano funzionali ^4. Qui riportiamo una versione dettagliata di questo saggio, che può essere utilizzato per testare la funzione visiva di premetamorphic girini Xenopus.

Questo test è più semplice del saggio risposta optomotor, dal momento che richiede solo una videocamera montata digitale, software fotocamera digitale e dotazione standard trovata nella maggior parte dei laboratori di Xenopus. Inoltre, la risposta registrata richiede alcuna formazione specifica ai risultati ottenuti. I nostri risultati rappresentativi mostrano che lo stesso gruppo di girini, che hanno subito doppio assotomia retinica, nuotano attorno al serbatoio. Abbiamo anche incluso i risultati del test comportamento di un girino rappresentante, mostrando come un occhio può essere testato per la risposta visiva. Un foglio di lavoro è stato incluso in modo che i numeri acquisiti durante il dosaggio possono essere inseriti e analizzati. Questo foglio può essere utilizzato per determinare se i girini testati hanno una risposta visiva.

Protocollo

Animal Care

Il Xenopus laevis girini utilizzati in questo studio sono stati coltivati, allevati e trattati secondo le procedure approvate dal Upstate Medical University IACUC e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Impostazione Pre-comportamento: Girini

1. Ottenere fecondati embrioni di Xenopus da una sorgente disponibile in commercio o in vitro fecondare ovociti, come descritto in precedenza ^6.
2. Posizionare blastula a neurali embrioni stadio piastra a 18 ˚ C in 60 millimetri piastre Petri contenenti 0,1 X. MMR [10 X Marc Modificato soluzione (MMR) stock Ringer (10 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl _2; 50 HEPES mM; 1 M NaCl, regolata a pH 7,5, autoclavato e conservati a RT)] con 50 ug / ml di gentamicina antibiotico. Cambiare 0,1 X. MMR ogni giorno e rimuovere eventuali embrioni morti.
3. Una volta che gli embrioni raggiungono Nieuwkoop e Faber fase ~ ^27-30 Luglio, passare the embrioni in 0,1 X. MMR senza antibiotico per permettere la crescita batterica intestinale.
4. Crescere i girini fino a raggiungere lo stadio di alimentazione (fase 45) e spostarli in 100 millimetri piastre di Petri riempite con 0,1 X. MMR. Alimentarli ortica surnatante polvere ogni altro giorno per una settimana, cambiando il 0,1 X. MMR il giorno intermedio.
5. Dopo una settimana in piatto 100 millimetri Petri, spostare gli animali per mezzo gallone vasche piene d'acqua rana [0.5 g / L oceano immediata e 2 mM sodio fosfato bibasico (Na ₂ HPO _4: mw 141,96) pH 6,8]. Dar loro da mangiare come al punto 2.4, ma cambiare l'acqua solo 2-3 volte a settimana quando l'acqua è torbida. Mantenere gli animali in una 12 ore light/12 ciclo di luce buio con le luci accendere alle 06:00.
6. Posizionare il serbatoio mezzo gallone con i soggetti del test su una superficie bianca, come un underpad banco di laboratorio, almeno 12 ore O / N, prima del test.
7. Girini di prova nelle fasi 45-50 come descritto nel passaggio 3 di seguito.

. 2 Setup Pre-comportamento: Equipment

1. Mettere da parte una zona del laboratorio per il saggio comportamento. Dovrebbe essere in una tranquilla zona a traffico limitato con l'illuminazione fluorescente standard.
2. Preparare le vasche di prova per gli animali.
   I nidificate, serbatoi di test mezzo gallone sono composti da due parti: un serbatoio interno che conterrà l'acqua e girini; e un serbatoio esterno con stimolo visivo.
   1. Per il serbatoio interno, fare un piccolo segno sugli angoli esterni con un pennarello, 5 cm dal fondo; questa è la linea di galleggiamento (Figura 1A, linea tratteggiata verde).
   2. Inoltre, per il serbatoio interno, riempire le divets nel serbatoio (agli angoli e al centro) con un composto inerte, come Sylgard elastomero. NOTA: I girini si soffermerà in queste aree se non vengono riempiti dentro
   3. Per il serbatoio esterno, coprire esattamente la metà della parte esterna di un serbatoio con nastro isolante nero e l'altra metà con il bianco fazzoletto di carta Figura 1B.
3. Posizionare i carri armati sulinoculando giradischi.
4. Setup la webcam / treppiede in modo che sia sopra le vasche di prova. Regolare la telecamera per permettere la visualizzazione della zona test, come mostrato nella Figura 1C.
5. Collegare la webcam di un computer con software QuickTime Player installato ^5. Accendere la fotocamera. In QuickTime Player, in File, selezionare 'Nuova registrazione filmato.' Il setup del test comportamento sarà visibile sul computer subito.
6. Drappo un panno di cotone leggero su tutta la configurazione di ridurre stimoli esterni che potrebbero influenzare il comportamento girino, nonché, ridurre la luce riflessa sulla superficie dell'acqua.
7. Assicurarsi che la luminanza nel quadro delle misure di stoffa tra 35-50 cd / m ^2.

3. Assay Comportamento

1. Riempire il serbatoio di test interno al segno cinque centimetri di acqua fatta al passo 1.2.1 con acqua rana.
2. Usando una piccola rete, spostare delicatamente l'animale nel serbatoio testing interno.
3. Aperto QuickTime software sul computer e, con il serbatoio esterno come una guida, assicurarsi che la fotocamera è in grado di visualizzare e registrare l'area di prova.
4. Scrivere il nome dell'animale, la data e l'ora su un pezzo di carta e registrare con la macchina fotografica.
5. Posizionare il serbatoio di prova nel serbatoio esterno con il lato nero del serbatoio a destra Figura 2.
6. Avviare la registrazione del filmato subito dopo aver sistemato il serbatoio e impostare timer per 2 min.
7. Quando i segnali acustici del timer, rimuovere il serbatoio di prova interno, ruotare il serbatoio esterno di 180 ° e posizionare il serbatoio di prova interno all'interno del serbatoio esterno. Avviare il timer. Nota: il lato nero dovrebbe essere sull'altro lato.
8. Ripetere passo 3.7, più otto volte per un totale di dieci prove. Utilizzare la figura 2 come una guida, controllando fuori di ogni prova.
9. Ripetere l'analisi condotta in due giorni separati.

4. Retinica assotomia

1. Mettere animali a 0,02% tricaine fino a che non rispondonoad un pizzico di coda con un # 3 pinze.
2. Sciogliere 1% agarosio in 0,1 X. MMR e quindi aggiungere ad una piastra di Petri 60 millimetri. Una volta raffreddato, fare un piccolo incavo rettangolare in agarosio e aggiungere il girino a incavo con un po '0,02% tricaine, in modo che l'animale è parzialmente immersa nel liquido.
3. Ago nella pelle ad un angolo di 45 gradi dietro la regione dorsale dell'occhio con un ago 25 G, mentre il rinforzo animale contro pinza sul lato opposto.
4. Facendo attenzione a non tagliare la vena, che si trova accanto al nervo ottico, raggiungono attenzione nel foro con # 5 pinze, tagliare il nervo ottico e capovolgere fuori strada. Se c'è sanguinamento grave a causa accidentalmente snipping l'arteria, quindi posizionare rapidamente l'animale in 2% tricaine di eutanasia. ATTENZIONE: Soluzione tricaine 2% può causare intorpidimento negli esseri umani. Questa soluzione deve essere maneggiato con i guanti.
5. Per recuperare l'animale dopo l'intervento chirurgico, collocare animale da 100 mm piastra di Petri con 0,7 X MMR e gentamicina 50 mg / ml per 20 min. Next, trasferimento girino al serbatoio di recupero con acqua rana. Lasciate riposare animale O / N.
6. La mattina successiva, testare la funzione visiva come descritto sopra (punti 3,1-3,9).

5. Analisi dei risultati

1. Dopo le prove sono finite, misurare la quantità di tempo girino rimane sul lato nero del serbatoio.
   1. Visualizzare manualmente i video utilizzando un software che visualizza l'ora e permette frequenti pausa. Guardate il tempo di visualizzazione video. Annotare l'inizio della prova di due minuti, che è quando il recipiente interno nidi successo all'interno della vasca esterna e viene squadrato in vista della telecamera.
   2. Utilizzare la posizione degli occhi del girino per definire quale lato della vasca gli animali sono il nuoto su. Definire attraversando da un lato del serbatoio all'altro solo quando entrambi gli occhi hanno attraversato il / linea bianca nera.
2. Annotare l'inizio e la fine di ciascun intervallo (in secondi) che l'animale trascorre sul lato nero. Pausa e riavvolgere il video per garantire la precisione. Il totale del sec all'interno di ogni prova.
3. Ingresso questi numeri nel foglio di lavoro Behavior allegato. Il foglio calcola la proporzione di tempo che l'animale ha speso sul lato bianco sottraendo il tempo speso per il lato nero del serbatoio dal totale 120 prova sec e dividere per il tempo totale in sec [(120 - secondi totali spesi il lato nero) / 120 sec]. Le medie del foglio di lavoro questo rapporto su tutte le 10 prove.
4. Usa T-test di uno studente, in coppia, distribuzione a due code per determinare se le prove tra le giornate sono significative (P ≤ 0,05).

Risultati

I rapporti precedenti hanno dimostrato che premetamorphic girini Xenopus preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco e nero chiamato questo test, sullo sfondo Preferenza colore Assay ³ Abbiamo modificato questo test per testare la funzione visiva di entrambi gli occhi di girini in meno di una settimana. In questo modo, i loro occhi possono essere raccolti per l'esame istologico.

Mostriamo qui come la risposta è dovuta a stimoli visivi. In Mov...

Discussione

Riportiamo qui un semplice test comportamentale visione-guida che può essere facilmente eseguita in meno di una settimana da personale di laboratorio minimamente addestrato. Mentre altri test richiedono attrezzature specializzate e competenze in comportamento animale, questo test permette un rapido test per determinare la funzione visiva. Un altro test comportamentale, il saggio evitare di Visual, è stato sviluppato per determinare come la Tectum contribuisce alla percezione visiva in Xenopus ^10. Que...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Flex-Tank da 1/2 gallone con coperchio	eNasco	SB19271M	Dimensioni: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Nastro
Carta
Grande giradischi a inoculazione	VWR	50809-022	Dimensioni: diametro 114,3 x H 76,2 mm (4 1/2  x  3")
Sottopiede Durasorb	VWR	82004-836	Dimensioni: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Treppiede		Varie
fotocamere o webcam	iSight Apple	M8817LL/A	Buono per girini più grandi, ma quelli piccoli sono difficili da vedere
Computer portatile	Apple/PC	Vari	Abbiamo usato un MacBook da 13", 2 GHz Intel Core 2 Duo con MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV handycam camcorder	SONY	DCR-HC42	Collegato tramite firewire al computer con un FireWire 400 alfa a 6 conduttori e 4 conduttori
Stazione Handycam	SONY	DCRA-C121	Può essere utilizzata per collegare firewire al
software QuickTime Player	della fotocamera Quicktime	Versione 10.1
26 G Ago (5/8" lunghezza)	VWR	BD305115
Dumont #5 Pinze	Fine Science Tools	11295-10
Monouso
Gentamicina solfato [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	Conservato presso RT
Sylgard 184 elastomero siliconico	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Soluzione madre = 100 g/L conservato presso RT
Sodio fosfato bibasico	Sigma Aldrich	S0876	Soluzione madre = 0,4 M conservato presso RT
In vitro embrioni fecondati	eNasco	LM00490MX	100 embrioni/unità