Marker cellulare superficiale Purificazione mediata di cellule iPS intermedi da un modello riprogrammabile mouse

Summary

Il fibroblasto embrionale di topo può essere riprogrammato in cellule staminali pluripotenti indotte a bassa efficienza dall'espressione forzata dei fattori di trascrizione Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. I rari intermedi della reazione di riprogrammazione sono FACS isolati tramite marcatura con anticorpi contro i produttori di superficie cellulare Thy-1.2, Ssea-1 ed Epcam.

Abstract

Le cellule mature possono essere riprogrammate in uno stato pluripotente. Queste cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) sono in grado di dare origine a tutti i tipi di cellule del corpo e di conseguenza hanno un vasto potenziale per le applicazioni della medicina rigenerativa. Tradizionalmente le cellule iPS sono generate dall'introduzione virale dei fattori di trascrizione Oct-4, Klf-4, Sox-2 e c-Myc (OKSM) nei fibroblasti. Tuttavia, la riprogrammazione è un processo inefficiente con solo lo 0,1-1% delle cellule che ritornano verso uno stato pluripotente, rendendo difficile lo studio del meccanismo di riprogrammazione. Una metodologia collaudata che ha permesso lo studio del processo di riprogrammazione è quella di separare gli intermedi rari della reazione dalla popolazione refrattaria. Nel caso dei fibroblasti embrionali di topo (MEF), noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule di riprogrammazione subiscono una serie distinta di cambiamenti nel profilo di espressione dei marcatori di superficie cellulare che possono essere utilizzati per la separazione di queste cellule. Durante le prime fasi dell'espressione di OKSM, le cellule riprogrammate perdono con successo il marcatore di identità dei fibroblasti Thy-1.2 e sovraregolano il marcatore associato alla pluripotenza Ssea-1. La transizione finale di un sottogruppo di cellule Ssea-1 positive verso lo stato pluripotente è contrassegnata dall'espressione di Epcam durante le ultime fasi della riprogrammazione. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per isolare gli intermedi di riprogrammazione dalle colture di MEF di riprogrammazione. Al fine di aumentare la riproducibilità sperimentale, utilizziamo un ceppo murino riprogrammabile che è stato ingegnerizzato per esprimere un transattivatore trascrizionale (m2rtTA) sotto il controllo del locus Rosa26 e OKSM sotto il controllo di un promotore responsivo alla doxiciclina. Le cellule isolate da questi topi sono isogeniche ed esprimono OKSM in modo omogeneo dopo l'aggiunta di doxiciclina. Descriviamo in dettaglio l'insediamento dei topi riprogrammabili, la derivazione dei MEF e il successivo isolamento degli intermedi durante la riprogrammazione in cellule iPS tramite smistamento di cellule attivate fluorescenti (FACS).

Introduction

Staminali embrionali (ES), le cellule sono derivate dalla massa cellulare interna dell'embrione stadio di blastocisti ^1. In appropriate condizioni di coltura si auto-rinnovano e rimangono pluripotenti. Nel 2006 Yamanaka e colleghi hanno dimostrato che le cellule mature possono essere riprogrammate in cosiddetto staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule con espressione forzata di fattori di trascrizione Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ^2. cellule iPS, come le cellule staminali, possono dare origine a tutti i tipi di cellule del corpo, tuttavia, sono privi di vincoli etici che circondano la generazione di cellule ES ^3. Inoltre, le cellule iPS portano la promessa della medicina rigenerativa personalizzata e detengono un enorme potenziale per applicazioni come la modellazione della malattia e in vitro di screening droga ^4,5. Al fine di riprogrammare la tecnologia per realizzare questo potenziale, il meccanismo di base della riprogrammazione nucleare deve essere pienamente compreso. Tuttavia, gli sforzi per sezionare il pat riprogrammazioneHWAY sono stati ostacolati dal fatto che solo un numero molto piccolo di cellule riprogrammare (0,1-1%). Fibroblasti riprogrammazione con successo sono stati riportati a subire una serie distinta di eventi tra cui una di transizione epitelio mesenchimale ^6-10 e, nelle fasi finali di riprogrammazione, l'attivazione del nucleo endogeno pluripotenza rete ^11-14. Noi e altri ^12,13,15-17 recentemente identificato un set di marcatori di superficie cellulare che consente la separazione delle rare intermedi dalla popolazione massa refrattaria. Fibroblasti embrionali di topo (MEF) Riprogrammazione subiscono cambiamenti nell'espressione di Thy-1.2, Ssea1 e EpCAM (tra gli altri) durante la 2-settimane-lungo processo di riprogrammazione ^15. All'inizio durante la riprogrammazione di un sottoinsieme di MEF down-regolare l'espressione del marcatore di identità fibroblasti (Thy-1.2) e quindi avviare esprimere il marcatore pluripotenza-associata SSEA-1 ^12. Durante le fasi finali di cellule Ssea1-positivi riprogrammazione Reactivmangiato geni pluripotenza endogeni, quali Oct-4 ^10-13,15. Questo ultimo passaggio è segnato sulla superficie cellulare mediante espressione rilevabile di EpCAM (vedi Figura 1) o in una fase successiva PECAM ^15. Recentemente, O'Malley et al. Ha riferito l'uso di CD44 e ICAM1 come alternative o complementari a Thy-1.2 e SSEA-1 per l'identificazione di intermedi di riprogrammazione. Abbiamo già FACS estratto intermedi riprogrammazione dal giorno 0, Giorno 3, Giorno 6, culture Giorno 9 e 12 ° giorno di riprogrammazione, nonché da linee di cellule iPS stabiliti sulla base di questi marcatori di superficie cellulare ^15,18. Per il sistema riprogrammazione di seguito descritto e condizioni abbiamo dimostrato a livello di singola cellula che sebbene le popolazioni sono tranquillo omogenea, vi è una certa eterogeneità nelle popolazioni intermedi indicati. Va notato che solo un sottoinsieme di celle all'interno di queste popolazioni sono in grado di avanzare al rispettivo sta successivoge del processo di riprogrammazione e dare origine a colonie di cellule iPS a differenti efficienze, che sono state ampiamente caratterizzate precedenza ^15,19. Inoltre, l'efficienza di riprogrammazione di queste popolazioni dipenderà anche dalle condizioni ri-placcatura e cultura. Per aumentare la riproducibilità sperimentale usiamo un ceppo riprogrammabile topo che è stato progettato per esprimere un transattivatore trascrizionale (m2rtTA) sotto il controllo del locus Rosa26 e una cassetta OKSM policistronica sotto il controllo di un promotore doxiciclina reattivo ^20,21. Usando questo modello di topo elude gli effetti collaterali indesiderati dei metodi tradizionali virali di generazione di cellule iPS, vale a dire, una popolazione eterogenea di partenza con la cella di variabilità delle cellule in numero e l'ubicazione dei siti di integrazione di inserti virali. Due ceppi di topi transgenici (OKSM, m2rtTA), disponibili come animali fondatori omozigoti presso il Jackson Laboratory, devono essere incrociati per stabilire la reprogramodello murino mmable (vedi Figura 2). In questo manoscritto viene descritto in dettaglio come derivare MEF, generare cellule iPS, e isolare gli intermedi di riprogrammazione nelle varie fasi del processo di conversione da FACS.

Protocol

1 Impostazioni Strumento / Preparazione dei reagenti / Genotipizzazione

1. Preparare media delle cellule iPS: Supplemento 500 mezzi ml Knockout DMEM con 75 ml di siero fetale bovino (FBS), 5 ml di L-glutammina, 5 ml di aminoacidi non essenziali, 500 microlitri β-mercaptoetanolo, 5 x 10 ⁵ unità leucemia fattore inibitorio ( LIF). Si prega di fare riferimento alla Lista dei materiali per il prodotto e acquisti per i reagenti utilizzati nel contesto di questo manoscritto.
2. Preparare medio MEF: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS, 5 ml di L-glutammina, 5 ml aminoacidi non essenziali, 5 ml di sodio piruvato, 500 microlitri β-mercaptoetanolo.
3. Preparare congelamento media: Per 10 ml, combinare 9 ml di FBS con 1 ml di DMSO.
4. Preparare la gelatina rivestito piatti Aggiungere 3-5 ml di 0,1% soluzione di gelatina suina ad un pallone T75, incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti e aspirare a destra prima dell'uso.
5. Preparare FACS media etichettatura: Per 10 ml, combinare 9,9 ml di PBS con 0,1 ml di FBS.
6. Eseguireuna genotipizzazione PCR per il locus Rosa26 m2rtTA: Eseguire reazioni con DNA polimerasi Taq secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare una versione modificata MgCl ₂ -concentration di 3,5 mm e 3 seguenti primer: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG ATG GAT 3 '. Condizioni Ciclismo: 94 ° C per 3 min; 35 cicli di (94 ° C per 30 sec, 65 ° C per 1 min, 72 ° C per 1 min); 72 ° C per 2 min; tenere a 12 ° C. Formato del prodotto previsto: 650 bp per l'allele wild type e 340 bp per l'allele mutante.
7. Eseguire una genotipizzazione PCR per il locus collagene-StemCa / OKSM: Eseguire reazioni con DNA polimerasi Taq come da istruzioni. Utilizzare una versione modificata MgCl ₂ -concentration di 2,5 mm e 3 seguenti primer: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Condizioni Ciclismo: 95 ° C per 1 min: 2 cicli di (94 ° C per 30 sec, 70 ° C per 45 secondi), 6 cicli di (94 ° C per 30 sec, 68 ° C per 45 secondi) e 30 cicli di (94 ° C per 20 sec, 60 ° C per 1 min); 72 ° C per 5 min; tenere a 12 ° C. Formato del prodotto previsto: 331 bp per l'allele wild type e 551 bp per l'allele mutante.
8. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 400 xg per 3 min a 4 ° C.

2 Generazione di fibroblasti embrionali di topo

1. Eseguire un accoppiamento a tempo tra un animale del ceppo OKSM con un membro del sesso opposto del ceppo m2rtTA. Embrioni Harvest a giorno embrionale 13.5 di abbattimento la madre e la rimozione del corno uterino. Prima della rimozione del corno uterino, spruzzare la regione addominale con una soluzione di etanolo al 80%, per evitare la contaminazione microbica.
2. Trasferire il corno uterino in un piatto di coltura di tessuti 10 centimetri contenente 10 ml di sterile tampone fosfato (PBS). Usare le forbici sterilizzate grado chirurgico per tagliare il corno uterino in pezzi contenenti un embrione (vedere Figura 3A, B).
3. Utilizzare un microscopio dissezione (idealmente collocato all'interno di una cappa di coltura tissutale) e pinze sterilizzate per rimuovere con attenzione la busta uterino e le membrane extra-embrionali circostanti ogni embrione. Trasferire ogni embrione di un piatto separato 10 centimetri con 10 ml di PBS.
4. Procedere rimuovendo la testa dell'embrione, gli arti, la coda e gli organi interni (cuore, fegato, intestino, ecc) con la pinza (vedi Figura 3C). Trasferire testa dell'embrione in una provetta da 1,5 ml e congelare giù in modo che possa essere utilizzato per la genotipizzazione se necessario.
5. Trasferire il torso dell'embrione in un 10 centimetri piatto vuoto e usare due lame chirurgiche per tritare l'embrione per 2 min. Aggiungere 200 ml di soluzione di tripsina / EDTA in cima dell'embrione tritato e incubare per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Continuare macinazione per un ulteriore 2 minuti, aggiungere 2 ml di media MEF al attivare la tripsina, e poi trasferire in una provetta da 15 ml.
6. Utilizzare una pipetta 1.000 microlitri di dissociare ulteriormente meccanicamente il tessuto delicatamente pipettaggio. Trasferire in un piatto di 10 centimetri di gelatina rivestito e aggiungere un ulteriore 10 ml di supporti MEF. Nota: Sia incubatori normossiche e ipossia possono essere utilizzati per la cultura, fare riferimento alla discussione per maggiori informazioni.
7. Dopo 24-48 ore la piastra deve essere densamente coperto con MEF.
8. In alternativa, le cellule possono poi essere ulteriormente propagate o congelati verso il basso. Per il congelamento delle cellule, rimuovere il supporto di cultura, sciacquare il piatto con 10 ml di PBS per rimuovere le tracce di media e sovrapposizione con 3 ml di soluzione / EDTA tripsina. Incubare per 3-5 minuti a 37 ° C, inattivare la tripsina digestione con l'aggiunta di 5 ml di media MEF e il trasferimento ad un tubo di centrifugazione 15 ml. Spin down e risospendere il pellet in 3 ml di congelamento dei media. Trasferimento a 3 cryovials e congelare giù in un contenitore di congelamento delle cellule.

3 Riprogrammazione del MEF

ove_content "> NOTA: le cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C e utilizzare normossiche incubatori di coltura di tessuti per la riprogrammazione Può essere utile per derivare ed espandere MEF in condizioni di ipossia (5% di ossigeno, vedi la discussione per ulteriori informazioni. ).

1. Scongelare rapidamente un esageratamente basso passaggio (P0-P1, 2-3 cellule Mio) in un bagno d'acqua (37 ° C) e trasferire il contenuto in una provetta con 10 ml di supporti MEF pre-riscaldato. Cellule pellet, risospendere in 12 ml di mezzi freschi MEF, trasferire in una gelatina rivestita cultura T75 nave, e permettono alle cellule di recuperare per 24-48 ore prima di procedere. Nota: MEF possono essere utilizzati anche direttamente dopo derivazione.
2. Dopo la rimozione della coltura, lavare MEF con PBS e cellularize sovrapponendo con una soluzione di tripsina / EDTA (3 ml per 3-5 minuti a 37 ° C). Quench tripsina con l'aggiunta di 5 ml di media MEF e l'ulteriore dissociare le cellule delicatamente miscelazione con una pipetta 10 ml. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
3. Per reprograesperimenti llo, MEF seme su gelatina rivestite fiasche T75 a densità di 6.7 x 10 ³ cellule / cm ² (~ 0,5 milioni di cellule per pallone) in mezzi IPSC contenente 2 mg / ml di doxiciclina. Fare riferimento alla Tabella 1 per quanto riguarda le raccomandazioni di semina per ottenere circa 2 Mio intermedi di riprogrammazione per ogni punto di tempo. Nota: Riprogrammazione inizia con l'aggiunta di doxiciclina (2 mg / ml) integrato multimediale
4. Per i primi 6 giorni sostituiscono i media ogni giorno con doxiciclina fresca completato iPSC supporti (12 ml di supporto per bombola T75). Al di là di questo punto rinnovare la media su base giornaliera, se ci sono un numero elevato di cellule. Raddoppia il volume cultura se cambia media possono essere eseguite solo a giorni alterni.
5. Intermedi Harvest riprogrammando in punti temporali richiesti (suggerimento: giorni 3, 6, 9, 12) rimuovendo i media, risciacquo con il volume appropriato di PBS (10 ml per un pallone T75) e la sovrapposizione con una soluzione di tripsina-EDTA (3 ml per un pallone T75). Covareper 3-5 minuti a 37 ° C e dissetare con l'aggiunta di 5 ml di iPSC supporti seguiti da dolce pipettaggio.
6. Conte sospensione cellulare con un emocitometro (vedi sopra), pellet per centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS per rimuovere eventuali tracce di tripsina. Agglomerare cellule ancora una volta, aspirare il surnatante e procedere con passo 4.1 per isolare gli intermedi di riprogrammazione. Nota: Le cellule in fase di riprogrammazione possono essere crioconservati e scongelati per l'isolamento FACS in una fase successiva.
7. Per stabilire iPS culture completamente riprogrammati, crescere le cellule in libera-DOX iPSC supporti per altri 4-7 giorni. Nota: le culture riprogrammazione con successo conterrà un gran numero di colonie di giorno 12 (vedi Figura 4). Durante questo tempo, le cellule iPS aberranti che ancora richiedono espressione OKSM spariranno.
8. In alternativa, per propagare le restanti iPS culture completamente riprogrammati: inizialmente, sementi MEF irradiati ad una densità di 15 x 10 ³ cellule / cm ² in 12 ml di iPSC supporti su una gelatina rivestita T75 pallone di un giorno o 6 ore prima di esperimenti.
9. Avanti, colture cellulari cellularize iPS rimuovendo i media, sciacquare il pallone T75 con 10 ml di PBS, sovrapposizione con 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 3-5 minuti a 37 ° C. Quench tripsina con l'aggiunta di 5 ml di supporti IPSC seguita da miscelazione delicata, trasferire in un tubo da 15 ml, spin down e poi risospeso in 10 ml iPS media.
10. Trasferire 500 ml di questa sospensione cellulare sulle MEF irradiati (pallone T75) e consentire alle culture di crescere per 4-5 giorni. Nota: iPS Fondata culture possono essere crioconservati o utilizzati per gli esperimenti. Linee cellulari clonali possono essere derivati ​​con la scelta di singole colonie IPSC sotto un microscopio da dissezione ^22.
11. Cryo preservare culture IPSC confluenti come descritto in 2.8 per MEF.

4 Antibody Etichettatura

1. Pellet cellulari Risospendere di culture di riprogrammazione, come predisposto nella sezione 3, inFACS supporti etichettatura integrato con anticorpi (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotina 1: 400 e anti-EpCAM FITC 1: 400). Utilizzare 200 ml di miscela di etichettatura integrato per 5 milioni di cellule e incubare in ghiaccio.
2. Dopo 10 min picchiettare delicatamente il tubo per risospendere le cellule e incubare per altri 10 minuti in ghiaccio. Aggiungere 10 ml di PBS freddo per tubi e spin down.
3. Per ogni tubo deve essere macchiato preparare 200 ml di etichettatura supporto integrato con 1 ml streptavidina-PeCy7 (1: 200) per 5 milioni di cellule. Quando le cellule sono confettate, aspirare accuratamente il surnatante e risospendere in un volume adeguato di supporti di etichettatura integrati con streptavidina-PeCy7.
4. Mantenere le cellule in ghiaccio per 10 minuti, toccare per risospendere, incubare per altri 10 minuti in ghiaccio, aggiungere 10 ml di PBS freddo per provetta, spin down e aspirare il surnatante.
5. Pellet cellulari Risospendere in etichettatura dei media integrato con ioduro di propidio (PI) (2 mg / ml) a circa 1 x 10 ⁷ cellule / ml. Rimuovere grumi di cellule facendo passare la sospensione attraverso un filtro 70 micron. Trasferire le cellule di un adeguato tubo FACS e tenerli su ghiaccio.
6. Preparare i campioni separati con i singoli anticorpi (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 e anti-EpCAM). NOTA: Questi sono tenuti a effettuare la compensazione del colore nei tre canali utilizzati nell'analisi. Inoltre, sono necessarie cellule senza etichetta per impostare le tensioni e le porte per l'ordinamento. Idealmente le cellule iPS sono utilizzate per la compensazione: le scorte di 0,5-1 x 10 ⁶ cellule iPS mantenute sul MEF irradiati vengono memorizzati in cryovials in azoto liquido. La presenza di MEF è essenziale per ottenere un segnale nel canale Thy-1.2.
7. Scongelare una esageratamente di cellule iPS come descritto per MEF (sezione 3). Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in 800 ml di buffer di etichettatura e 200 ml di questo campione viene messa da parte come controllo senza etichetta.
8. Utilizzare le cellule rimanenti come controlli di compensazione. Le cellule si dividono tra tre tubi 15 ml e anticorpi aggiungerecome segue: Pacific Blue controllo della compensazione: aggiungere 0,5 ml di anticorpo anti-Thy-1.2 Blue Pacific. FITC tubo di compensazione: aggiungere 0,5 ml di anticorpo anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 controllo della compensazione: 0,5 ml di anticorpo anti SSEA-1-biotina.
9. Conservare i campioni di cellule-anticorpo in ghiaccio per 10 minuti, mescolare toccando e incubare per 10 minuti in ghiaccio.
10. Campioni Lavare con 10 ml di PBS freddo per rimuovere l'anticorpo non legato, girare celle in basso e aspirare il surnatante. Pellet cellulari risospendere in 200 ml di FACS mezzi etichettatura.
11. Per anti-SSEA-1-biotina campioni etichettati, aggiungere un coniugato streptavidina-PeCy7 (1 ml ogni 200 cellule microlitri). Cellule Label come descritto per l'anticorpo primario (SSEA-1-biotina).
12. Passare tutti i campioni, tra cui il controllo senza etichetta attraverso un filtro 70 micron e aggiungere PI (2 mg / ml). Trasferire le cellule di tubi FACS e tenere in ghiaccio fino al momento.

5. FACS isolamento di intermedi

Nota:Le cellule vengono ordinati utilizzando una fluorescenza attivato cell sorter con 405 nm, 488 nm e 560 nm laser di eccitazione e un ugello di 100 micron.

1. Impostare le tensioni per scatter in avanti e laterale in modo che la popolazione cellulare viene visualizzato correttamente. Disegnare un cancello intorno alle cellule, come indicato in Figura 5A per escludere detriti. Nota: Il set up corretto di tensioni sul cell sorter può essere complessa e richiede un operatore esperto FACS.
2. Utilizzare forward scatter (FSC) altezza rispetto zona FSC escludere aggregati (Figura 5B).
3. Visualizza il canale PI rispetto FSC per cancello sulle pi negativo cellule vive (Figura 5C).
4. Utilizzare le cellule senza etichetta per regolare le tensioni per i canali fluorescenti di PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. Idealmente posizionare la popolazione di cellule in corrispondenza dell'estremità inferiore del rispettivo canale.
5. Impostare cancelli con le cellule di controllo non marcati come mostrato in Figura 6A, B alla frazione sub culto riprogrammazioneUres in giorno 3, 6 e 9 popolazioni: SSEA-1-/ Thy-1.2 + cellule; SSEA-1-/ Thy-1.2- cellule; e la riprogrammazione di tramite SSEA-1 + / Thy-1.2- cellule.
6. Inoltre suddividere il giorno 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- frazione utilizzando il Pe-Cy7 contro FITC macchia; disegnare cancelli tutto il Sse-A1 + / EpCAM + cellule e le SSEA-1 + / cellule Epcam-. Impostare cancelli con le cellule di controllo non marcati come illustrato in Figura 6C, D.
7. Prefill tubi di raccolta appropriati, con supporto di cellule iPS (1-2 ml) prima cernita delle sottopopolazioni desiderati (vedere la Figura 7 per i profili FACS rappresentativi MEF, Giorno 3/6 ° giorno / Giorno 9 / Giorno 12 culture e cellule iPS).
8. Eseguire FACS smistamento secondo produce protocollo.
9. Dopo l'isolamento FACS presentare alle cellule di profiling molecolare (RNA / estrazione di proteine, immunoprecipitazione della cromatina, il DNA methylome analisi, ecc). In alternativa, le varie frazioni cellulari possono essere coltivate.

Results

Dopo la dissezione, disaggregazione e placcatura di un embrione di topo E13.5, un piatto di 10 cm dovrebbe raggiungere confluenza in circa 1 o 2 giorni. In questa fase, è normale che la cultura di contenere alcuni pezzi di tessuto aderenti che non sono stati cellularized correttamente. Questi scompaiono dopo passaging.

Dopo induzione doxiciclina, MEF riprogrammazione subiscono cambiamenti morfologici distinti. Intorno al giorno 6, patch colonia-come primi dovrebbero cominciare ad emergere (Figura 4C). Questi continueranno a crescere in dimensioni dopo ulteriori cultura (vedi Figura 4D, E). Un esperimento buon riprogrammazione dovrebbe tradursi in> 500 colonie per T75 inizialmente seminato con 5 x 10 ⁵ cellule (Figura 4E). Culture iPS Fondata possiedono caratteristiche colonie a forma di cupola e dovrebbero essere per lo più privi di cellule differenziate (Figura 4F). Di tanto in tanto, passaging supplementare di iPS cultures possono essere tenuti a rimuovere le cellule indifferenziate / parzialmente riprogrammate; un pallone confluenti di cellule può essere suddiviso in un rapporto di 1:10 su un feeder layer di MEF irradiati.

Come accennato in precedenza, i cambiamenti morfologici e molecolari durante la riprogrammazione si riflettono i cambiamenti nei profili FACS per Thy-1.2, SSEA-1 e, in definitiva EpCAM (vedere Figura 7A-F). Come riportato in precedenza ^12,15, mentre il MEF sono prevalentemente positivi per Thy-1.2 e negativo per gli altri marcatori, Day 3 culture già un aspetto notevolmente diverso. Una gran parte delle cellule hanno iniziato a down-regolare l'espressione di Thy-1.2 e un piccolo sottoinsieme di queste cellule negative Thy-1.2 sono diventati positivi per SSEA-1, la riprogrammazione reale intermedio per questo punto di tempo. Il numero di intermedi di riprogrammazione che possono essere estratti dal Day 3 culture è molto imprevedibile come la percentuale di SSEA-1 + / Thy-1.2- di solito si trova in un range tra il 1-10% di viablcellule e. Su Giorni 6 e 9 un aumento della percentuale di cellule SSEA-1 +, di solito ben al di sopra del 10%, può essere rilevato. Intorno al giorno 12 un sottoinsieme di SSEA-1 le cellule positive può essere rilevato che etichetta positivo anche per EpCAM. Day 12 colture, come il giorno 3 culture, rappresenta un collo di bottiglia nella purificazione degli intermedi, come la percentuale di + / EpCAM + cellule SSEA-1.2 è variabile e di solito cade nel range di solo il 2-4% di tutte le cellule vive. Il numero atteso di intermedi di riprogrammazione presentati nella tabella 1 serve solo come una rozza approssimazione. In buona fede colture di cellule iPS Fondata saranno fortemente positivo per SSEA-1 e EpCAM.

Figura 1 marcatori di superficie cambia durante il percorso di riprogrammazione: down-regolazione del marcatore dell'identità fibroblasti Thy-1.2 è seguito da up-regolazione diSSEA-1. La transizione di un sottoinsieme di-1 SSEA cellule positive verso uno stato pluripotente è indicato da acquisizione di EpCAM intorno al giorno 12. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2 Rappresentazione schematica del modello riprogrammabili topo:. Espressione m2rtTA è sotto il controllo del Rosa26 locus ubiquitariamente attivo In presenza di doxiciclina (DOX) la proteina m2rtTA si lega a una tetraciclina promotore dipendente (tetOP) al collagene 1a1 (COL1A1) locus conseguente espressione della cassetta a quattro fattori. Due cassette bicistronici sono collegati da un sito interno ingresso ribosoma (IRES). Aprire fasi di lettura per ottobre-4 / Klf-4 e Sox-2 / c-Myc sono fu sed da F2A e E2A sequenze auto-cleaving rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 Embrione dissezione: (A) Trasferimento uterino corno in un piatto di 10 centimetri riempito con 10 ml di PBS e (B) tagliato a pezzi contenenti un embrione. (C) Utilizzando una pinza liberare gli embrioni provenienti da tessuto embrionale in più e togliere la testa, gli arti, la coda e gli organi interni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Patch Figura 4. cambiamenti morfologici durante la riprogrammazione. Colony-come si manifestano nelle culture dal giorno 6 in poi. IPSCs bona fide sono caratterizzate da una morfologia a forma di cupola. (A) Giorno 0 / MEF, (B) 3 ° giorno, (C) Giorno 6, (D) Giorno 9, (E) Giorno 12, (F) Ips coltura cellulare. Scala bar:. 200 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 Configurazione di base FACS. (A) escludere residui con Side Scatter contro Forward Scatter Area macchia. (B)Escludi aggregati da non detriti da gating sulla popolazione di singola cellula con Forward Scatter Area contro Forward Scatter alta macchia. (C) Escludere le cellule morte dalla popolazione di cellule singolo di gating su PI eventi bassi con canale PI rispetto Forward Scatter Area Blot. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6 gating. (A, B) Utilizzo delle cellule di controllo non marcati istituiti cancelli per Thy-1.2 + / SSEA-1-cellule, Thy-1.2- / SSEA-1-cellule e Thy-1.2- / SSEA-1 + cellule. (C) Utilizzare le cellule di controllo senza etichetta per impostare porte per le cellule positive e negative EpCAM EpCAM. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2- cellule possono essere separatiin un EpCAM positivo e in negativo una popolazione EpCAM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7 Thy-1.2-1 contro SSEA FACS macchie nelle varie fasi del processo di riprogrammazione. (A) Giorno 0 / MEF, (B) 3 ° giorno, (C) Giorno 6, (D) Giorno 9, (E) Day 12, coltura cellulare (F) IPS.

Tabella 1 suggerite densità di semina, numero pallone e risultato previsto per P1 MEF di un embrione eterozigote per OKSM e m2rtTA. Cliccare here per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Giorno	Numero di palloni T75 seminato il giorno 0	Numero totale di cellule Ssea1 + dopo FACS	Numero totale di Ssea1 + / EpCAM + celle dopo FACS
3	8	2 milioni
6	4	2 milioni
9	4	2 milioni
12	10	10 milioni	2 milioni

Discussion

Al fine di riprogrammare con successo MEF in cellule iPS e per purificare intermedi riprogrammazione ad alta quantità è essenziale essere consapevoli dei fattori che hanno un impatto sull'efficienza complessiva. In particolare, il lotto di FBS utilizzato per integrare i media iPS possono avere un effetto negativo. In esperienze positive generali sono stati realizzati con staminali embrionali (ES) cellule FBS qualificati ma analisi per lotti di sieri da una varietà di fornitori potrebbe identificare un'alternativa più economica.

Un altro fattore che incide sull'efficienza riprogrammazione è il genotipo del MEF ^15,20. Sebbene MEF derivate da topi eterozigoti (het) sia per il OKSM e il locus m2rtTA non riprogrammare, homozygousity a uno o entrambi i risultati loci in efficienza di riprogrammazione superiori. Infatti, MEF derivati ​​dalla progenie di OKSM e m2rtTA croci mostrano un aumento di efficienza riprogrammazione nel seguente ordine (OKSM / m2rtTA): het / het tabella 1 sono per gli animali het / Het). Nelle rare occasioni in un maschio homo / homo animale è identificato, un harem accoppiamento con più femmine m2rtTA può essere impostato. Tutte prole da questi incroci verrà Het / homo per la OKSM / m2rtTA loci, rispettivamente. Inoltre, si raccomanda la rapida genotipizzazione di cucciolate come cucciolate più grandi si ottengono quando si usano i topi più giovani per l'allevamento (6-15 settimane di età).

Inoltre, l'uso del MEF a basso passaggio per la riprogrammazione è sottolineato ^23. Se MEF sono stati ottenuti e ampliati in un normossiche coltura tissutale incubatore si consiglia vivamente di utilizzare solo queste cellule fino a passaggio 2 Tuttavia, se lo sperimentatore ha accesso a un incubatore basso tenore di ossigeno (5% di ossigeno) per la derivazione e l'espansione del MEF, numeri più in alto 3 sarà comunque produrre buoni risultati ²³ di passaggio.

Nel caso in cui lo sperimentatore incontra problemi connessi con la riprogrammazione, come indicato, le più probabili spiegazioni sono numeri elevati di passaggio al momento della aggiunta DOX, errata genotipo dei topi o l'uso di FB che non è favorevole per la generazione di cellule iPS. Tuttavia, in rari casi abbiamo osservato che il MEF non erano in grado di riprogrammare anche in condizioni ideali. In questi casi una spontanea de novo delezione entro open reading frame del m2rtTA è stata identificata come la ragione di fondo.

Questa metodologia è stata adattata con successo per estrarre SSEA-1 + intermedi tramite isolamento delle cellule magnetiche (MACS). Vi è un chiaro vantaggio nel tempo usando MACS, tuttavia, purezza le popolazioni + SSEA-1 di cellule è ridotta al 80-90%, piuttosto che più del 95%, che a seconda del tipo di esperimento le cellule sono destinati potrebbe comportare un problema. Pertanto, l'opzione è quella di utilizzare MACS per arricchire per SSEA-1 + cellule seguiti da FACS per aumentare la purezza e / o frazione in SSEA-1 + / EpCAM + e SSEA-1 + / cellule Epcam-.

"> Mentre le cellule iPS prodotte dal protocollo descritto e modello di topo hanno dimostrato di essere pluripotenti ed efficacemente contribuire a tutti i tessuti degli animali chimerici ^15,20, una ridotta capacità di produrre embrioni esclusivamente composte di queste cellule iPS tramite complementazione tetraploide è stato dimostrato ^24. modelli di metilazione aberranti del gene cluster DLK-DIØ3 sono stati identificati come la causa di fondo ^24. Tuttavia, aggiunta di acido ascorbico alla concentrazione di 50 mg / ml ai media durante la riprogrammazione produrrà cellule di complementazione tetraploide iPS competenti ^24. Si prega di notare che un modello alternativo del mouse riprogrammabile progettato per esprimere i fattori di riprogrammazione in una stechiometria diversa può produrre tetraploide cellule iPS competenti anche in assenza di trattamento con acido ascorbico ^25. Tuttavia, nelle nostre cellule mani da questa riprogrammare deformazione alla frequenza notevolmente inferiore rispetto alla modalità mouse qui usatol.

La metodologia descritta in questo manoscritto permette la separazione di intermedi riprogrammazione dalla massa refrattaria della popolazione e deve essere visto come strumento prezioso per analizzare e comprendere il processo di riprogrammazione, rimuovendo le precedenti limitazioni di dover utilizzare una popolazione non frazionato per la profilazione (ad esempio, rumore del segnale alto da cellule refrattarie). La combinazione di anticorpi qui descritta permette l'isolamento di intermedi da cellule di topo ad alta purezza, tuttavia è possibile che ulteriori marcatori di superficie delle cellule verranno scoperti in futuro, che permetterà di ottenere intermedi in ancora più elevato di purezza. Si prega di notare che SSEA-1 espressione non è un segno distintivo di cellule staminali umane pluripotenti indotte e come tale questo protocollo non può essere utilizzato su riprogrammazione delle cellule di origine umana. In conclusione, gli intermedi di riprogrammazione volta isolati con il metodo descritto può essere utilizzato per analisi molecolari compresi espressione profiling, immunoprecipitazione della cromatina, methylome analisi, e proteine ​​saggi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-topo CD90.2 (Thy1.2) Blu Pacifico	eBioscience	48-0902-82
Anti-umano/topo SSEA-1 Biotina	eBioscience	13-8813
Streptavidina PE-Cy 7	eBioscience	25-4317-82
Anti-Topo CD326(Epcam) Fitc	eBioscience	48-5791-82
Piruvato di sodio	Tecnologie per la vita	11360-070
Aminoacidi non essenziali MEM (NEAA)	Tecnologie per la vita	11140-050
Siero Bovino Fetale qualificato con Cellule Staminali Embrionali (FBS)	Tecnologie per la vita
tripsina-EDTA (0,25%)	Tecnologie per la vita	25200-056
Tecnologie GlutaMAX	Life	35050-070
β-mercaptoetanolo	Tecnologie per la vita	21985-023
DMSO (dimetilsolfossido)	Sigma-Aldrich	D8418
Penicillina/streptomicina	Tecnologie per la vita	15140
Soluzione di ioduro di propidio (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Gelatina dalla pelle di suino	Sigma-Aldrich	G1890
Doxiciclina iclilato	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R
Fattore inibitorio della leucemia (LIF)	Milliporo	ESG1107
DMEM Alto glucosio	Tecnologie per la vita	11960-044
DPBS (soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco)	Tecnologie per la vita	14190-144
KnockOut DMEM	Tecnologie per la vita	10829-018
MEF irradiati	Tecnologie per la vita	S1520-100
75 cm2 Palloni per coltura tissutale	Corning/BD Bioscienze
provette da centrifuga da 15 ml	Corning/BD Bioscienze
provette da centrifuga da 50 ml	Corning/BD Bioscienze
Lame chirurgiche monouso	Clifford Hallam	SM0501
Fiale criogeniche	Corning/BD Bioscienze
70 & micro; m Filtro cellulare	BD Bioscienze	352340
Taq DNA polimerasi	Tecnologie per la vita	10342-020