Articolo metodologico

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

DOI:

10.3791/51732

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20 agosto 2014

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1Department of Chemical and Material Engineering, University of Alberta, 2Department of Civil and Environmental Engineering, University of Alberta, 3Department of Mechanical Engineering, Texas A&M University, 4Department of Mechanical Engineering, University of Alberta

In questo articolo

Sommario

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Vengono discussi i protocolli per lo studio della formazione di biofilm in un dispositivo microfluidico che imita i mezzi porosi. Il dispositivo microfluidico è costituito da una serie di micro-pilastri e viene studiata la formazione di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens in questo dispositivo.

Abstract

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Diverse specie batteriche possiedono la capacità di attaccare alle superfici e colonizzare in forma di film sottili chiamati biofilm. I biofilm che crescono in mezzi porosi sono rilevanti per diversi processi industriali e ambientali come il trattamento delle acque reflue e di CO 2 sequestro. Abbiamo usato Pseudomonas fluorescens, un batterio aerobico Gram-negativi, per indagare la formazione di biofilm in un dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi. Il dispositivo di microfluidica è costituito da una serie di micro-posti, che sono stati fabbricati utilizzando soft-litografia. In seguito, la formazione di biofilm in questi dispositivi a flusso è stato studiato e ci dimostrano la formazione di biofilm filamentosi note come stelle filanti nel nostro dispositivo. Qui vengono fornite insieme ai protocolli di coltura batterica I protocolli dettagliati per la fabbricazione e l'assemblaggio del dispositivo di microfluidica. Le procedure dettagliate per la sperimentazione con il dispositivo di microfluidica sono anche presentati insieme con il rappresentanterisultati.

Introduzione

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Recentemente, abbiamo dimostrato la dinamica di formazione di biofilm batterici in un dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi 1. Biofilm batterici sono essenzialmente colonie di batteri di superficie aggregati che sono racchiusi da sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 2-4. Questi film sottili di batteri possono formare in quasi ogni nicchia immaginabile che vanno da superfici lisce all'habitat molto più complesso di mezzi porosi. Valiei et al. 1 usato un dispositivo microfluidico con una matrice di micro-pilastro per simulare una struttura di supporto porosa e studiato la formazione di biofilm in questo dispositivo in funzione della portata del fluido. Essi hanno scoperto che in un certo regime di flusso, biofilm filamentosi noti come stelle filanti hanno cominciato ad emergere tra i diversi pilastri. Streamers possono essere legati ad una o entrambe le estremità per superfici solide, ma il resto della struttura è sospesa in un liquido. Formazione Streamer inizia in genere dopo un primo strato di biofilm ha formato e il suo formatoione può dettare l'evoluzione a lungo termine di biofilm in tali habitat complessi. Recentemente, alcuni ricercatori hanno studiato le dinamiche di formazione streamer. Yazdi et al. 5 ha mostrato che le fiamme possono formare nei flussi vorticosi provenienti da una bolla oscillante. In un altro esperimento, Rusconi et al. 6 studiato l'effetto di curvatura del canale e della geometria del canale sulla formazione di stelle filanti. Essi hanno scoperto che le fiamme possono formare nelle sezioni curve di microcanali, e streamer morfologia è correlata alla motilità. Recenti ricerche hanno dimostrato che le fiamme possono avere ampie ripercussioni in vari scenari naturali e artificiali in quanto possono fungere da precursori della formazione di strutture maturi in interfacce porosi, portare a una rapida e catastrofica proliferazione di biofilm in sistemi biomedici, e anche causare notevoli flow interazioni struttura, ecc 1,7-9.

Filanti Biofilm spesso formano ihabitat n complesse come mezzi porosi. Crescita biofilm intesa in ambiente mezzi porosi è rilevante per diversi processi ambientali e industriali come il trattamento biologico delle acque reflue 10, mantenendo ben-bore integrità in situazioni come la cattura di CO 2 11 e collegare dei pori nel terreno 12. Osservando la formazione di biofilm in tali habitat complessi spesso può essere difficile a causa della opacità dei mezzi porosi. In tali situazioni, le piattaforme multimediali porosi microfluidica base possono rivelarsi estremamente vantaggiosa in quanto consentono in tempo reale e monitoraggio in situ. Un altro vantaggio della microfluidica è la possibilità di costruire più bioreattori su un'unica piattaforma bio-microfluidica e contemporaneamente consentire il monitoraggio e / o integrazione di sensori on-line. La flessibilità per implementare più esperimenti di laboratorio in un unico dispositivo e la capacità di raccogliere importanti dati pertinenti per l'analisi statistica accurata è un adv importanteantage di sistemi microfluidici 13,14.

Nel contesto della discussione di cui sopra, le dinamiche di formazione streamer comprensione in un ambiente mezzi porosi sarebbe utile per diverse applicazioni. In questo studio, sviluppiamo il protocollo per indagare la formazione streamer in un dispositivo che imita mezzi porosi. Realizzazione della piattaforma microfluidica, sono descritti i passi necessari per la cultura e la sperimentazione di cellule. Nei nostri esperimenti, il ceppo batterico tipo selvaggio di Pseudomonas fluorescens è stato impiegato. P. fluorescens, che si trova naturalmente nel suolo, svolge un ruolo chiave nel mantenimento ecologia del suolo 15. Il ceppo batterico impiegato era stato geneticamente per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) costitutivamente.

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Protocollo

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Eseguire i protocolli sperimentali qui nell'ordine descritto di seguito. Protocolli di microfabbricazione per la creazione della piattaforma microfluidica sono discussi nel Passo 1 Passo 2 descrive il protocollo di coltura batterica (Figura 2), e punto 3 riguarda il montaggio del setup sperimentale (Figura 3). Infine, la fase sperimentale attuale è descritta al punto 4.

1 Chip Fabrication Procedura

NOTA: La corretta procedure di sicurezza devono essere seguite per i processi descritti di seguito. Consultare il responsabile della sicurezza istituzionale per i dettagli.

  1. Progettare la maschera con un software appropriato (ad esempio, L-Edit). La progettazione canale è composto da un micro-canale di larghezza di 625 micron. La regione centrale del canale contiene una serie di micro-messaggi di 50 micron di diametro, distanziati di 25 micron a parte (vedi Supplemental Files).
  2. Stampa questo disegno su vetro (5 "x 5" vetro soda lime), Che ha uno spessore di 0.09 "ed è rivestito da circa 70 nm spesso strato di cromo (Cr), utilizzando mascheratura per preparare una maschera fotografico. Autore Utilizzo AZ400K per 1 min. Poi, etch strato Cr utilizzando Cr mordenzante per circa 1 min Usare acetone per togliere il resistere e pulirlo con soluzione piranha freddo. (H 2 SO 4 e H 2 O 2 in un rapporto di 3: 1).
  3. Fotolitografia
    1. Pulire un wafer da 4 "silicio standard chimicamente con una soluzione piranha per 20 min.
    2. Sciacquare la cialda con acqua deionizzata e asciugare.
    3. Riscaldare il wafer su una piastra calda (200 ° C per 15 min).
    4. Rivestire il wafer di silicio con photoresist. Qui, il fotoresist AZ4620 positivo è stato spin-rivestito su un wafer di silicio a 2.000 rpm per 25 secondi per ottenere uno strato di spessore di 12,5 micron.
    5. Rimuovere tutto il solvente dalla cottura morbida della fetta su una piastra calda per galleggiamento della fetta per 90 secondi in flusso di azoto a 100 ° C. Poi, tenerlo in vuoto a tegli stessa temperatura per 60 sec.
    6. Posizionare la cialda in una scatola scura per 24 ore per disidratazione.
    7. Esporre il wafer alla luce UV per trasferire il pattern progettato per il fotoresist.
    8. Immergere il wafer in soluzione di sviluppo di fotoresist (AZ400K) per 240 sec. Poi, risciacquare il wafer con alcool isopropilico e asciugare mettendo in corrente di azoto.
  4. ICP-DRIE (plasma accoppiato induttivamente - Deep Reactive Ion Etching) Processo
    1. Applicare DRIE incisione. Scegliere la profondità etch appropriata in base alla profondità finale richiesta per il dispositivo (50 micron in questa indagine). Photoresist agisce come uno strato di mascheratura durante questo processo.
    2. Rimuovere il photoresist rimanente con acetone e pulire la cialda.
  5. PDMS (polidimetilsilossano) Casting
    1. Utilizzare trichloromethylsilane (TCMS) per silanizzanti stampo maestro di silicio. Versare 2 o 3 gocce di trichloromethylsilane in un flaconcino e metterlo in un essiccatore accanto alstampo maestro silicio. Consenti 2-3 ore per il processo silanizzante per completare.
    2. In un contenitore separato, mescolare la base di silicone Sylgard 184 con induritore dal rapporto in peso di 10: 1 per preparare PDMS. Degassarla PDMS sottoponendolo a vuoto condizioni (circa 2 ore).
    3. Mettete lo stampo maestro di silicio in un supporto. Poi, versare il PDMS sullo stampo maestro di silicio per formare il timbro PDMS. Assicurarsi che le bolle non si formano nei PDMS durante questo processo.
    4. Curare le PDMS per 2 ore a 80 ° C.
    5. Staccare il timbro PDMS dallo stampo master. Quindi, tagliare le PDMS bollo in microchip separati. Infine, utilizzare un nucleo di taglio per perforare fori per l'ingresso (s) e di uscita (s).
  6. Incollaggio di PDMS al vetro
    1. Esporre il vetrino e PDMS bollo di plasma di ossigeno per 30 sec. Legame PDMS bollo per la polizza di copertura.
    2. Per ottenere una corretta tenuta tra il timbro PDMS e il vetrino, temprare il dispositivo mettendolo in forno a 70 ° C per 10 min.

2 batterica Cultura

NOTA: i protocolli di corretta biosicurezza deve essere seguita per i passaggi 2-4. Consultare il responsabile della sicurezza istituzionale per i dettagli.

  1. Preparare piastre LB Agar
    1. Aggiungere 20 g di Luria-Bertani (LB) agar (Miller) polveri e 500 ml di acqua ultrapura per un pallone da 1 L. Mescolare per sciogliere la polvere.
    2. Sterilizzare in autoclave a 15 psi, 121 ° C per 15 min.
    3. Lasciare raffreddare il pallone fino a 50-55 ° C su una panchina o in un bagno d'acqua nella cappa di biosicurezza.
    4. Aggiungere l'antibiotico tetraciclina per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Mescolare bene agitando.
    5. Versare il composto in lastre. Riempire ogni piatto fino a 1/2 - 2/3 pieno.
    6. Aria Fiamma bolle brevemente per farli scoppiare se fanno. Bolle d'aria solidificati sono difficili da diffondere la cultura batterica sopra.
    7. Lasciare le piastre a raffreddare a temperatura ambiente per una notte.
    8. Quando sono freschi,mettere lastre di nuovo nella loro manica, sigillare il sacchetto, etichetta (antibiotico e data), e conservare a 4 ° C.
      NOTA: Coprire lo stock di piastre con carta stagnola, come la luce disattiva molti antibiotici.
  2. LB Broth Preparazione
    1. Aggiungere 20 g Luria-Bertani (LB) brodo (Miller) polveri e 1 L di acqua ultrapura in un pallone. Mescolare per sciogliere la polvere.
    2. Sterilizzare in autoclave a 15 psi, 121 ° C per 15 min.
    3. Lasciare pallone raffreddare a 50-55 ° C su una panchina o in un bagno d'acqua nella cappa di biosicurezza.
    4. Aggiungere l'antibiotico tetraciclina per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Mescolare bene agitando.
    5. Lasciar raffreddare, posizionare la bottiglia etichettata a 4 ° C.
      NOTA: Coprire la bottiglia con carta stagnola, come la luce disattiva molti antibiotici.
  3. Coltura dei batteri su una piastra di LB Agar (Questo protocollo utilizza Pseudomonas fluorescens)
    1. Prendete il magazzino batterica dal congelatore (-80 °, C) e posizionarlo sul ghiaccio.
    2. Posizionare l'° C magazzino batterica -80 e un piatto di agar LB all'interno di una cappa di biosicurezza.
    3. Streak il ceppo batterico su una piastra di agar LB a zig-zag. Coprire la piastra di agar e incubare a 30 ° C durante la notte. Infine, riporre il piatto in frigorifero a 4 ° C.
  4. Preparare la soluzione batterica (S1)
    1. Versare 50 ml di brodo LB supporto a un pallone autoclavato. Eseguire questa operazione all'interno di una cappa di biosicurezza.
    2. Trasferire una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB al pallone. Questa operazione deve essere eseguita all'interno di una cappa di biosicurezza.
    3. Mettere il pallone in un incubatore shaker a 30 ° C e 150 rpm per un tempo adeguato (4 ore).
  5. Preparare la soluzione batterica Diluire (S2)
    1. Versare 5 ml di LB supporti brodo in un tubo di plastica sterilizzata.
    2. Diluire S1 mescolando con mezzi brodo LB. Quindi, agitare la soluzione. Diluire la soluzione raggiungere l'ottica desiderataAl densità (OD misurata a 600 nm = 0,1).
      NOTA: esperimenti Biofilm tipicamente impiegano valori di OD in questa zona.

3 Preparare il setup sperimentale

  1. Utilizzando le pinzette collegano tubi di plastica flessibili (0.20 "ID) nella presa (s) e di uscita (s) del microchip. Gli ingressi e le uscite sono state precedentemente perforati nella porzione PDMS del microchip (fase 1.5.5). In questa indagine , il microchip è costituito da due ingressi ed una uscita.
  2. Riempire la siringa (s) con la soluzione batterica (soluzione S2) e rimuovere tutte le bolle nella siringa (s).
  3. Collegare punta della siringa (s) (30 G 0.5 "ago smussato) in tubo di ingresso (s). Quindi, collegare il tubo di uscita (s) per i rifiuti del contenitore.

4 Esecuzione dell'esperimento

  1. Collegare la siringa (s) per la punta della siringa (s).
  2. Luogo e siringa fix (s) sulla pompa a siringa. Poi mettere il microchip sotto un microscopio ottico con lenti dell'obiettivo di Desired ingrandimento (ad esempio, 40X). Coprire il microchip con un dispositivo di camera di cellule vive per mantenere un ambiente a temperatura costante per la crescita batterica (30 ° C per P. fluorescens).
  3. Impostare la pompa al livello di portata desiderata (per esempio 10 ml / ora) ed avviare il pompaggio del fluido.
  4. Una volta che i batteri vengono introdotti nella camera, è anche avviata la formazione di biofilm. Formazione di biofilm e maturazione si verificano in genere in un periodo di diverse ore o addirittura giorni. Osservare e prendere le immagini della crescita di biofilm attraverso il microscopio.

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Risultati

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Utilizzando il protocollo microfabbricazione sopra menzionato, un dispositivo microfluidico basato PDMS è stato costruito. Figura 1 mostra il microscopio elettronico a scansione (SEM) immagini del PDMS dispositivo. Figura 1a mostra la sezione di ingresso del dispositivo. Un ingresso a forcella è stato creato per equalizzare la testa di pressione attraverso il dispositivo. Ulteriori immagini SEM ha anche mostrato che le pareti pilastro sono quasi verticale (Figura 1b). L...

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Discussione

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Abbiamo dimostrato un semplice dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi per lo studio dello sviluppo del biofilm in ambienti complessi. Ci sono diversi passaggi critici che determinano l'esito degli esperimenti. Essi comprendono la geometria del dispositivo. Mentre la geometria del palo può variare, adeguato poro-spazio per bandierine per formare è necessario. Inoltre, Valiei et al. 1 hanno dimostrato che la formazione streamer si verifica solo in un determinato campo di portata. A por...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare il professor Howard Ceri del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università di Calgary per aver fornito ceppi batterici. A. Kumar riconosce il supporto del NSERC. T. Thundat riconosce il sostegno finanziario del programma Canada Excellence Research Chair (CERC). Gli autori desiderano anche ringraziare la signora Zahra Nikakhtari per l'aiuto con la videografia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio fluorescenteNikon
LB agarFisherBP1425-500sospendere 40 g in 1 L di acqua purificata
LB BrodoFisherBP1427-500sospendere 20 g in 1 L di acqua purificata
Cappa di biosicurezzaMicrozone corporation
Piastra PetriFisher875712sterile 100 mm x 15 mm in polistirene Petri
Agitatore per incubatoreNew Brunswick ScientificExcella E24 Agitatore per incubatore serie
50 ml Tubo da centrifuga sterilizzatoCorning430828Polipropilene Base priva di RNasi/DNasi
TetraciclinaMP Biomedicals103012 50 μ g/ml
SYLGARD 184 siliconeDow Corning Corporation68037-59-2Elastomero Base e agente indurente
Fotoresist positivo (AZ4620)
Tubo di plasticaCole-Parmer

Riferimenti

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  1. Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
  2. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  3. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
  4. Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
  5. Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).
  6. Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
  7. Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
  8. Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
  9. Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
  10. Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
  11. Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
  12. Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
  13. Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
  14. Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
  15. Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
  16. Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
  17. Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
  18. Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).

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