Articolo metodologico

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

DOI:

10.3791/51737

⸱

15 settembre 2014

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I neuroni dopaminergici (DA) nella substantia nigra pars compacta (noti anche come neuroni A9 DA) sono il tipo di cellula specifico che viene perso nella malattia di Parkinson (PD). C'è un grande interesse nel derivare neuroni A9 DA da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per la terapia rigenerativa di sostituzione cellulare per il PD. Durante lo sviluppo neurale, i neuroni A9 DA originano dai precursori della placca del pavimento (FP) situati sulla linea mediana ventrale del sistema nervoso centrale. Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la differenziazione graduale delle hPSC in neuroni DA A9, che imita lo sviluppo embrionale dei neuroni DA. Nel nostro protocollo, descriviamo prima l'efficiente generazione di cellule precursori di FP da hPSC utilizzando un metodo a piccola molecola, e poi convertiamo le cellule FP in neuroni DA A9, che potrebbero essere mantenuti in vitro per diversi mesi. Questo protocollo efficiente, ripetibile e controllabile funziona bene nelle cellule staminali embrionali umane (hESC) e nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) di persone normali e pazienti con PD, in cui si potrebbero derivare neuroni DA A9 per eseguire la modellazione della malattia in vitro e lo screening farmacologico e la terapia di trapianto di cellule in vivo per il PD.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopaminergica (DA), i neuroni possono essere trovati in diverse regioni del cervello, tra cui il mesencefalo, l'ipotalamo, retina, e bulbi olfattivi. I neuroni A9 DA nella pars compacta della substantia nigra (SNPC) comportamento di controllo e il movimento proiettando alla striato nel proencefalo e formare il sistema motorio extrapiramidale. La degenerazione dei neuroni A9 DA conduce alla malattia di Parkinson (PD), che è la seconda malattia neurodegenerativa umana più comune e attualmente incurabile. Terapia di sostituzione cellulare è una delle strategie più promettenti per il trattamento della malattia di Parkinson 1, quindi, c'è stato un grande interesse derivante neuroni A9 DA da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e il recenti cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs).

Molta ricerca ha cercato di ricavare neuroni A9 DA da hPSCs utilizzando vari metodi. Le prime relazioni di tutti i neuroni DA generati attraverso una neuralefase progenitore rosetta. In co-coltura con MS5 2 o PA6 3-5 cellule stromali con o senza fattori di crescita esterna per 2-4 settimane, L. Studer e colleghi e di altri tre gruppi indotte con successo hESC per produrre rosette neurali. Hanno poi arricchito queste rosette di dissezione meccanica o digestione enzimatica per un'ulteriore differenziazione. In altri rapporti, i ricercatori hanno generato rosette neurali attraverso il corpo embrioide (EB) galleggianti cultura differenziazione 6-9. In seguito, i ricercatori hanno stabilito un monostrato basato metodo differenziazione 10,11, dove si placcati hESC e hiPSCs sulla matrice extracellulare, aggiunti diversi fattori di crescita nella cultura di indurre la differenziazione di hPSCs di neuroni DA, che imita il vivo DA sviluppo embrionale dei neuroni in . Anche se tutti questi studi ottenuti tirosina idrossilasi (TH) cellule esprimente con alcune caratteristiche di neuroni DA, l'intero processo di differenziazione è il tempo e il lavoro consumo,generalmente inefficiente, e, soprattutto, l'identità A9 di questi neuroni non sono state dimostrate nella maggior parte degli studi, eccetto quella con Lmx1a espressione ectopica 12. Recentemente, un piatto nuovo piano (FP) basata su protocollo è stato sviluppato 13-16, in cui i precursori FP con DA potenziale del neurone sono stati generati dall'attivazione del riccio Sonic e canoniche vie di segnalazione Wnt durante la fase iniziale della differenziazione, e quindi queste cellule FP sono stati ulteriormente specificati per neuroni DA. Anche se questo protocollo è più efficiente, ci sono ancora alcuni problemi; per esempio, l'intero processo di differenziazione richiede molto tempo (almeno 35 giorni) ed è dipendente cella alimentatore 15, o è dipendente EB 16 o l'identità A9 non è stato dimostrato 14.

Qui, sulla base delle conoscenze di sviluppo embrionale in vivo DA neurone e risultati pubblicati di altri ricercatori, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per l'effgenerazione icient di DA neuroni da entrambi hESC e hiPSCs. In primo luogo abbiamo generato cellule FP precursori dalla attivazione del segnale Wnt canonica con piccola molecola CHIR99021 e sonic hedgehog segnalazione con piccole molecole SAG e purmorphamine. Queste cellule esprimono FP Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestina. Abbiamo poi specificato queste cellule FP a neuroni DA con fattori di crescita, tra cui BDNF, GDNF, ecc. I neuroni DA generati sono di tipo cellulare A9 come sono positivi per GIRK2 mentre negativo per calbindin 17. Questo protocollo è cella alimentatore o EB indipendente, altamente efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo, si può ricavare neuroni DA in meno di 4 settimane dalla hESC o hiPSCs di persone normali per lo studio trapianto di cellule, o da hiPSCs di pazienti PD per la modellazione in vitro di PD o testare potenziali agenti terapeutici per il PD.

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Protocollo

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1 Preparazione della Cultura media

  1. Preparare topo fibroblasti embrionali (MEF) medium combinando il seguente: 445 ml di DMEM, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 14 giorni.
  2. Preparare siero contenente HPSC terreno di coltura combinando il seguente: 385 ml DMEM / F12, 100 ml di siero sostituzione knockout (KSR), 5 ml di 100x non essenziali aminoacidi soluzione madre, 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione madre, 5 ml di 100x -mercaptoethanol soluzione stock, e 10 ng / ml bFGF. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
  3. Preparare mTeSR1 terreno privo di siero combinando il seguente: 400 ml mTeSR1 medio basale, 100 ml 5x supplemento, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Mantenere il substrato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
  4. Preparare IV soluzione madre 10x collagenasi: pesare 0,5 g potere collagenasi IV, esciogliere con 50 ml di DMEM / F12 e filtro sterilizzare. Preparare delle aliquote e li scorta a -20 ° C per mesi.
  5. Preparare la soluzione di gelatina allo 0,1%: pesare 0,5 g di gelatina (da pelle bovina, di tipo B), il potere e scioglierlo con acqua deionizzata. Mantenere soluzione sterilizzata in autoclave a temperatura ambiente per settimane.
  6. Preparare KSR medio differenziazione combinando il seguente: 410 ml di DMEM, 75 ml KSR, 5 ml di soluzione 100X non essenziali aminoacidi magazzino, 5 ml 100x penicillina / soluzione madre ampicillina, 5 ml di soluzione madre 100X -mercaptoethanol. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
    NOTA: KSR varia da lotto a lotto, che possono influenzare l'efficienza di differenziazione. E 'quindi meglio provare diversi lotti di KSR per trovare quello migliore per la differenziazione.
  7. Preparare N2 medio differenziazione combinando il seguente: 98 ml di DMEM, 1 ml 100x supplemento N2 e 1 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4° C per non più di 10 giorni.
  8. Preparare B27 medio differenziazione combinando il seguente: 480 ml di mezzo Neurobasal, 10 ml 50x B27 supplemento, 5 ml di 100x Glutamax soluzione madre, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.

2. Cultura di hESC e hiPSCs su cellule di alimentatore MEF

Le hESC H9 sono stati ottenuti da WiCell Research Institute e hiPSCs sono stati stabiliti in laboratorio Reijo Pera attraverso retrovirus-mediata trasduzione di Yamanaka fattori Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC 18.

  1. Almeno un giorno prima del passaggio delle cellule, preparare alcuni piatti gelatina aggiungendo 1 ml di 0,1% di gelatina a 1 pozzetto di piastre da 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C per almeno 30 min.
  2. Dopo l'incubazione, aspirare gelatina dalle piastre e sementi irradiazione inattivato cellule MEF sulle piastre alla densità di 1,6 x 10 5 cellule/ Pozzetto in mezzo MEF utilizzando un emocitometro per contare le cellule.
    NOTA: In alternativa preparare alimentatori MEF fin da 3 giorni prima del passaggio delle cellule.
  3. Cellule Passage Un giorno, dopo la placcatura alimentatori MEF: media aspirato da hPSCs, aggiungere 1 mg / ml di collagenasi IV a celle a 1 ml / pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora.
  4. Durante questa incubazione, lavare alimentatori MEF una volta con PBS, e quindi aggiungere calda (37 ° C) siero contenente HPSC terreno di coltura a 1,5 ml / pozzetto.
  5. Dopo 1 ora, toccare la piastra di coltura un paio di volte in modo che la maggior parte delle colonie indifferenziate si staccherà dalle piastre, mentre le colonie differenziate rimangono attaccati. Raccogliere accuratamente le colonie galleggianti, e trasferirli in provetta 15 ml.
  6. Lavare delicatamente la piastra una volta con acqua calda (37 ° C) DMEM / F12 e trasferire DMEM / F12 nello stesso tubo da 15 ml.
  7. Centrifugare le provette a 179 xg per 3 min.
  8. Aspirare il terreno dai tubi, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungi guerram HPSC terreno di coltura, le cellule pipettare su e giù più volte per romperli in piccoli gruppi e mescolare bene.
  9. Trasferire le cellule su nuovi alimentatori MEF a 1: 3-1: 6 rapporto.
  10. Cambiare la media ogni giorno e il passaggio delle cellule ogni 5-6 giorni.

3 Preparazione di cellule di Differenziazione

  1. Almeno un giorno prima della preparazione delle cellule, preparare alcuni piatti Matrigel (tipicamente 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Diluire il Matrigel con il freddo (4 ° C) DMEM / F12 a 01:40 e aggiungere 1 ml di Matrigel per pozzetto di 6 pozzetti. Incubare le piastre Matrigel a 4 ° C durante la notte. NOTA: Si può sigillare le piastre Matrigel con Parafilm e scorta a 4 ° C per tutto il tempo una settimana.
  2. Utilizzare cellule (vedi punto 2) 4 giorni dopo il passaggio. Rimuovere tutte le colonie differenziate dalle piastre. Aspirare il terreno dalla piastra di coltura, aggiungere 1 ml accutase per pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
  3. Durante l'incubazione, preparare alcuni gelAtin piatti con l'aggiunta di 1 ml di gelatina a 1 pozzetto di 6 pozzetti. Posizionare questi piatti e le Matrigel piastre preparate il giorno prima in incubatrice.
  4. Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, le cellule pipetta su e giù più volte per farli in cellule singole.
  5. Raccogliere singole cellule in provette da 15 ml e centrifugare a 258 xg per 3 min.
  6. Risospendere le cellule con un'adeguata quantità di siero contenente HPSC mezzo di coltura, e aggiungere Thiazovivin alla concentrazione finale di 2 micron.
  7. Trasferire le cellule su piastre di gelatina rivestite in rapporto 1: 1, e incubare le cellule a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere alimentatori MEF.
  8. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, aggiungere siero appropriato contenente HPSC medio e contare le cellule con un emocitometro.
  9. Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min.
  10. Durante centrifuga, aggiungere Thiazovivin appropriarsi mTeSR1 mezzo per effettuare una concentrazione di 2 mM.
  11. Dopo centrifuga, unaspirano medio e aggiungere mezzo appropriato mTeSR1 con Thiazovivin modo che ci sono 1,8 x 10 5 cellule / ml medie.
  12. Estrarre le piastre Matrigel dal termostato, aspirare il Matrigel e aggiungere 2 ml di cellule miste su 1 bene dei 6 pozzetti.
    NOTA: La densità delle cellule dovrebbe essere 3,6 x 10 4 cellule / cm 2 di superficie.
  13. Riportare le piastre torna l'incubatrice, e lasciare che le cellule attaccano per 24 ore.
  14. 24 ore dopo la placcatura le cellule, aspirare vecchio medio e aggiungere 2 ml nuovo mezzo mTeSR1 per pozzetto e lasciare le cellule crescono per un altro 24 ore prima di iniziare la differenziazione.

Differenziazione cellulare

  1. Inizia differenziazione 48 ore dopo replating le cellule su piastre Matrigel.
  2. Aspirare il terreno di coltura dalla piastra, lavare le cellule una volta con PBS, e aggiungere 2 ml della seguente mezzo di differenziazione per pozzetto: medio differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542 e 100 nM LDN-193189. Segna questo giorno come D0 di differenziazione.
  3. Modificare media ogni giorno da D0 a D20.
    NOTA: Si può preparare mezzo per uso non più di 2 giorni alla volta.
  4. Utilizzare il seguente mezzo per D1 e D2: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b.
  5. Utilizzare il seguente mezzo per D3 e D4: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021.
  6. Utilizzare il seguente mezzo per D5 e D6: 75% KSR terreno di differenziamento più il 25% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021.
  7. Utilizzare il seguente mezzo per D7 e D8: 50% KSR terreno di differenziamento più il 50% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.
  8. Utilizzare il seguente mezzo per D9 e D10: 25% KSR terreno di differenziamento più il 75% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.
  9. Utilizzare il seguente mezzo per D11 e D12: media B27 differenziazione integrato con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP.
  10. Utilizzare il seguente mezzo per il resto della differenziazione: B27 medio differenziazione supplementato con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP.
  11. A circa D16 di differenziazione, preparare alcuni piatti / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluire Poly-L-ornitina soluzione madre con il freddo (4 ° C) PBS a 15 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
  12. Aspirare la soluzione di poli-L-ornitina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare le piastre.
  13. Diluire laminina magazzino solution con il freddo (4 ° C) PBS a 1 mcg / ml, aggiungere 1 ml di un pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
  14. Aspirare la soluzione laminina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare i piatti.
  15. Diluire la soluzione fibronectina magazzino con il freddo (4 ° C) PBS per 2 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
  16. Chiudere le piastre con parafilm e metterli a 4 ° C per la durata di due settimane.
  17. Dopo 20 giorni di differenziamento, le cellule replate alle piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Aspirare il terreno di differenziazione, aggiungere 1 ml di acqua calda (37 ° C) Accutase a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
  18. Durante l'incubazione, posizionare le piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina nell'incubatrice.
  19. Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, delicatamente le cellule pipetta su e giù diverse volte pertrasformarli in cellule singole.
  20. Raccogliere le singole cellule in 15 ml tubi conici, e aggiungere la giusta quantità di mezzo Neurobasal per il conteggio delle cellule, che variano a seconda espansione (dopo 11 giorni di differenziamento, le cellule possono espandersi 15-20 volte). Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  21. Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con terreno di differenziamento B27 in modo che la concentrazione cellulare è di 1 x 10 6 cellule / ml medie.
  22. Aspirare fibronectina dalle piastre, lavare due volte con PBS e aggiungere 2 ml di cellule di 1 pozzo di 6 pozzetti.
    NOTA: La densità delle cellule per replating dovrebbe essere 2 x 10 5 cellule / cm 2 di superficie.
  23. Modificare media 24 ore più tardi per rimuovere tutte le cellule morte senza legami.
  24. Modificare media ogni giorno fino a quando i punti di tempo desiderati per un dato esperimento.

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Risultati

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Una panoramica del protocollo differenziazione è mostrato in Figura 1. L'efficienza del protocollo differenziazione presentato qui invoca lo stato delle celle di partenza. Pertanto, è fondamentale fare in modo che, prima rimuove tutte le colonie differenziate prima di dissociare hPSCs in celle singole per la differenziazione, e la seconda, una esaurisce la maggior parte, se non tutte, le cellule di alimentazione MEF incubando le cellule su piastre di gelatina rivestite per 30 minuti, e il terzo, uno dei...

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Discussione

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Le cellule staminali pluripotenti umane (inclusi sia hESC e hiPSCs) possono essere differenziate in vitro per generare la maggior parte, se non tutti, i tipi di cellule del nostro corpo tra cui neuroni DA, che è stata dimostrata in studi precedenti 19. Qui, sulla base delle conoscenze da dopaminergici embrionale neurone sviluppo 20 e protocolli pubblicati da altri laboratori 14,15, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la generazione di neuroni DA provenienti da hESC ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Renee Reijo Pera per l'aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo e durante la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è supportato dal laboratorio condiviso del California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (CL-00518).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
penicillina/ampicillinaLife Technologies15140-122
DMEM/F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
Aminoacido non essenzialeLife Tecnologie11140-050
b-mercaptoetanoloMilliporeES-007-E
bFGFR& D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Collagenasi IVLife Technologies17104-019
GelatinaSigma-AldrichG9391
N2 integratoreLife Technologies17502-048
B27 supplementoLife Technologies17504-044
NeurobasalLife Technologies21103-049
GlutamaxLife Technologies35050-061
PBSLife Technologies10010-023
Fattore di crescita ridotto matrigelBD Biosciences354230
AccutaseMP Biomedicals1000449
ThiazovivinSanta Cruz Biotechnologysc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorphamineSanta Cruz Biotechnologysc-202785
FGF8bR & D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2s
BDNFR& D Systems248-BD-025
GDNFR& D Systems212-GD-010
TGF-beta3R& D Systems243-B3-002
Acido ascorbicoSigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Topo, anticorpo NESTIN umanoSanta Cruz Biotechnologysc-239271/1.000 diluizione
Coniglio anti umano OTX2 anticorpoMilliporeAB95661/2.000 dilutione
Capra anti umano FOXA2 anticorpoR& D SystemsAF24001/200 diluizione
coniglio anti umano LMX1a anticorpoMilliporeAB105331/1.000 diluizione
Coniglio anti umano TH anticorpoPel FreezP401011/500 diluizione
Pollo anti umano TH anticorpoMilliporeAB97021/500 diluizione
Topo anti umano TUJ1 anticorpoCovanceMMS-435P1/,2000 diluizione
Coniglio anti umano GIRK2 anticorpoAbcamab307381/300 diluizione
Coniglio anti umano Calbindina anticorpoAbcamab250851/400 diluizione
CentrifugaEppendorf5804

Riferimenti

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