Articolo metodologico

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

DOI:

10.3791/51741

⸱

20 luglio 2014

 ,  , 
1Center for Thoracic Disease and Transplantation, Heart and Lung Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Vi è la necessità di migliorare discernibile informazioni sui driver molecolari dell'esofago di Barrett. Immunofluorescenza è una tecnica utile per comprendere gli effetti di segnalazione cellulare sulla morfologia cellulare. Presentiamo un protocollo semplice ed efficace per l'uso di immunofluorescenza per valutare il trattamento terapeutico nelle cellule esofago di Barrett.

Abstract

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Adenocarcinoma esofageo (EAC) ha un tasso di sopravvivenza inferiore al 17% e l'incidenza di EAC è aumentato drammaticamente negli ultimi due decenni. Uno dei fattori di rischio primari di EAC è esofago di Barrett (BE), un cambiamento metaplastica del normale dell'esofago squamoso in risposta al bruciore di stomaco cronica. Nonostante il collegamento consolidata tra EAC e BE, interrogatori degli eventi molecolari, in particolare le vie di segnalazione alterate che coinvolgono la progressione della BE a EAC, sono poco conosciute. Molto di questo è dovuto alla mancanza di idonei modelli in vitro disponibili per studiare queste malattie. Recentemente, BE linee cellulari immortalizzate sono diventati disponibili in commercio che consente per gli studi in vitro di BE. Qui, presentiamo un metodo per immunofluorescenza di linee cellulari immortalizzate BE, permettendo alla caratterizzazione in vitro di segnalamento e struttura cellulare dopo esposizione a composti terapeutici. L'applicazione di queste tecniche sarà help sviluppare comprensione dei meccanismi coinvolti in BE per EAC progressione e fornire potenziali vie per il trattamento e la prevenzione di EAC.

Introduzione

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Esofago di Barrett (BE) è un cambiamento metaplastica nel normale epitelio squamoso dell'esofago e a seguito di esposizione cronica al contenuto gastrico derivanti da malattia da reflusso gastroesofageo (GERD) 1. BE è pensato per essere un meccanismo protettivo in risposta a GERD, tuttavia, la presenza di BE conferisce un aumentato rischio di adenocarcinoma esofageo (EAC), una malattia che comporta una significativa scarsa sopravvivenza 1. Le stime attuali indicano che fino al 5,6% della popolazione americana hanno essere, tuttavia, come BE è spesso asintomatica, si ritiene che la maggioranza dei BE rimane non diagnosticata 2. Poiché i tassi di incidenza sia di GERD e EAC hanno visto una crescita continua 3, è diventato importante per comprendere i meccanismi molecolari coinvolti nella progressione di BE a EAC, tanto più che queste informazioni potrebbero potenzialmente fornire approcci terapeutici verso la prevenzione della progressione di BE EAC.

Paziente diretti hanno portato alla attuale paradigma di BE-EAC patogenesi 1. L'infiammazione cronica, lesioni e danno genotossico derivante dall'esposizione prolungata a contenuto gastrico esercitare una pressione selettiva sulla lesione BE promozione progressione neoplastica di EAC. Un certo numero di alterazioni genetiche sono state identificate durante BE alla progressione EAC. Tuttavia, nonostante questo c'è una netta mancanza di comprensione circa le esatte variazioni di segnalazione cellulare e gli effetti conseguenti su struttura e funzione delle cellule.

Immortalata in linee cellulari in vitro sono strumenti utili per studiare gli effetti di segnalazione cellulare, in particolare nei studio degli effetti di composti terapeutici mirati. La recente disponibilità commerciale di linee cellulari immortalizzate BE consente per tali studi. Anche se le analisi high-throughput, come i test di vitalità ampiamente utilizzati, possono essere utili nel valutare gli effetti delle terapie mirate su proliferazione cellulare e survival 4-6, questi test non sono utili per interrogare gli effetti di segnalazione cellulare su morfologia cellulare. Immunofluorescenza (IF) è una tecnica utile per studiare gli effetti delle terapie mirate sulle caratteristiche morfologiche, la crescita e la sopravvivenza delle cellule e le proteine ​​che sono coinvolte. Il nostro laboratorio ha adattato questi metodi verso linee cellulari immortalizzate BE, utilizzando IF per valutare gli effetti di un farmaco clinicamente disponibile su linee cellulari BE, nella speranza di delineare un possibile trattamento chemopreventative e biomarker per il trattamento farmacologico 7. Allo stesso modo, l'applicazione di queste tecniche in EAC, BE e linee cellulari esofagee immortalizzate ha delineato i risultati critici in merito BE di EAC progressione 8-10. Troviamo se l'analisi di cellule trattate con terapie mirate ha valore, consentendo per la caratterizzazione dei cambiamenti nella struttura cellulare e la localizzazione delle proteine. Qui vi presentiamo i nostri metodi di IF di essere cellule immortalizzate per characterize trattamento farmacologico.

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Protocollo

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1. Manutenzione Cell Line

  1. Umana immortalizzate BE displastiche di alto grado (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplastica (CP-A) linee cellulari mediante trasfezione stabile della telomerasi umana trascrittasi inversa (TERT) proteina 11.
  2. Mantenere BE linee cellulari in mezzi di cheratinociti, completata con estratto di ipofisi bovina (BPE), fattore di crescita epidermico (EGF), siero bovino fetale 5% (FBS), aminoacidi non essenziali (NEAA), penicillina-streptomicina-neomicina (PSN), e norma condizioni di coltura tissutale (37 ° C, 5% di CO 2, il 98% di umidità).

2. BE cellulare placcatura

  1. Preparazione di 12-pozzetti / lamelle. Mettere 18 millimetri vetrini in una piastra di Petri di vetro e autoclave. Trasferimento autoclavato 18 millimetri vetrini coprioggetto in un piatto di coltura tissutale a 12 pozzetti utilizzando una pipetta sterile di vetro collegata ad un tubo a vuoto. Lavare il vetrino con PBS sterile e dei media.
  2. Trypsinize e contare le cellule essere immortalati. Contare le celle dell'USIng un contatore automatico di cellule o un emocitometro. Diluire le cellule in coltura ad una concentrazione di 20.000-40.000 cellule / ml.
  3. Mettere 1 ml di cellule in ciascun pozzetto contenente un vetrino per un conteggio di cellule totale di 20.000-40.000 cellule / pozzetto.
  4. Utilizzare un puntale sterile per spingere delicatamente il vetrino sul fondo del pozzo per assicurare che le cellule attribuiscono al vetrino.

Trattamento farmacologico delle cellule BE 3.

  1. Diluire farmaco selezionato in (37 ° C), i media caldi di concentrazione desiderata e mescolare bene invertendo il tubo più volte o utilizzando un vortex. Concentrazioni di farmaco determinato in modo empirico. Iniziare il trattamento 24 ore a seguito del seeding iniziale delle cellule essere quello di permettere alle cellule attaccamento al vetrino
  2. Per confronto e controllo, trattare un vetrino aggiuntivo di cellule sia con 0,1% di veicolo (dimetilsolfossido [DMSO] o l'agente usati per solubilizzare composto) diluito in coltura. Targhetta di identificazione con una penna laboratorio per identificare il farmaco e vehicle campioni trattati. Posizionare cellule in un incubatore di coltura cellulare impostato a 37 ° C, 5% CO 2, 98% di umidità e incubare per punti di tempo desiderati.

4. Immunofluorescenza

  1. Fissazione
    1. Seguendo tempo di incubazione desiderata del trattamento farmacologico, aspirare il supporto e lavare i coprioggetti rapidamente con 1x tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C).
    2. Aspirare il PBS e aggiungere 1 ml di PBS contenente 4% PFA [4% PFA / PBS] in ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    3. Aspirare il 4% PFA / PBS e lavare il coprioggetto 3x, 5 minuti ciascuno con PBS a temperatura ambiente. Il negozio di lamelle per una settimana in PBS/0.1% PFA a 4 ° C se lo si desidera.
  2. Permeabilizzazione / Blocco
    Permeabilize cellule PFA fisse per consentire l'anticorpo per accedere ai bersagli intracellulari. Per extracellulare superficie proteine, eseguire tutti i passaggi successivi, senza saponina aggiunto alla soluzione BSA 1x PBS/0.5%.
    1. Ridurre sfondo incubando con 50 mM NH 4 Cl diluito in PBS per 10 minuti a RT e lavare con PBS RT volta per 5 min.
    2. Incubare essere cellule per 30 minuti a 100-300 ml di PBS contenente 0,1% e saponina allo 0,5% albumina di siero bovino (BSA). Diluire saponina da filtro sterilizzato 10% stock, preparato in acqua e conservati a 4 ° C.
    NOTA: Questo impedisce il legame non specifico degli anticorpi verso proteine ​​cellulari bloccando coprioggetti causa dell'aggiunta di 0,5% BSA. In alternativa, sostituire la BSA con siero di capra diluito al 5% per contribuire a ridurre il legame non specifico degli anticorpi.
  3. Preparazione della Camera umano
    1. Preparare un piatto saggio biologico piazza stratificando il fondo della camera con asciugamani di carta bagnati e mettere uno strato di Parafilm sulla parte superiore.
    2. Delicatamente trasferire i coprioggetti, celle rivolte verso l'alto, sul Parafilm con pinze e un ago da siringa.
    3. Segnare il Parafilm con una penna di laboratorio per identificare i vetrini.
  4. Incubazione Anticorpo Primario
    1. Diluire l'anticorpo primario in PBS contenente BSA sia 0,5% e 0,1% saponina.
    2. Tamponare delicatamente la soluzione di saturazione usando un tessuto di laboratorio e aggiungere 100 ml di soluzione di anticorpo primario. Incubare l'anticorpo primario sulle cellule BE notte a 4 ° C.
  5. Incubazione secondario
    1. Lavare i vetrini 3x con PBS/0.5% BSA/0.1% saponina per 5 minuti ciascuno a RT.
    2. Diluire anticorpo secondario coniugato con un tag fluorescente in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina che l'anticorpo secondario riconosce le specie in cui l'anticorpo primario è stato sollevato.
    3. Aggiungere 100 ml di anticorpo diluito ad ogni vetrino. Incubare l'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente.
  6. Lavaggio e Montaggio di Coprivetrini
    1. Lavare il coprioggetti 3x, 5 min ciascuno in PBS/0.5% BSA/0.1% saponina. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100-300 ml di PBS alle lamelle.
      NOTA: Per il doppio controcolorazione del corpo, ripetere i passaggi 4,4-4,5 con l'anticorpo primario e secondario ulteriori desiderato in base alle informazioni descritte nella discussione.
    2. Utilizzando pinze, delicatamente sollevare il vetrino e macchia al largo della PBS utilizzando un tessuto di laboratorio o un tovagliolo di carta.
    3. Aggiungere 15 ml di un supporto di montaggio anti-sbiadimento adatto contenente 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per il vetrino e invertire il vetrino, celle in basso, su un vetrino da microscopio in vetro.
    4. Porre i vetrini in una cartella di diapositive e incubare al riparo dalla luce diretta durante la notte a temperatura ambiente per permettere al mezzo anti-sbiadimento difficile impostare curare, secondo le istruzioni del produttore. Una volta che il mezzo anti-dissolvenza è impostato, i vetrini possono essere conservati a 4 ° C o -20 ° C o fino visualizzazione microscopica.

5. Visualizzazione microscopica di Coprivetrini

Cellule colorate possono essere esposte sia tramite microscopia confocale o un IF in grado microscop verticalee. Sebbene microscopia confocale offre immagini ad alta risoluzione a profondità discrete, un microscopico verticale è in grado di produrre immagini utili più veloce. Per brevità, un metodo di imaging macchiato BE cellule con un microscopio normale è presentato. In generale, all'immagine isotiocianato di fluoresceina (FITC) o fluorofori simili (cioè proteina fluorescente verde), Texas Red e DAPI, richiede un microscopio con filtri in grado di discriminare questi fluorofori. Controllare il microscopio prima di iniziare il protocollo per determinare fluorofori compatibili.

  1. Imaging su un IF microscopio standard
    1. Rimuovere memorizzati diapositive / vetrini da -20 ° C o 4 ° C e permettere loro di riscaldare a temperatura ambiente. Accendere il microscopio e lampada a vapori di mercurio.
    2. Posizionare vetrino da microscopio con coprioggetto rivolto verso l'obiettivo sul palco microscopio. Per l'utilizzo di un obiettivo immersione in olio, aggiungere una goccia di olio di immersione sul vetrino.
    3. Selezionare il filtro DAPI e aprire l'otturatore.
    4. Mettere a fuoco l'obiettivo, mentre guardando attraverso gli oculari fino a quando appare l'immagine. Poiché tutte le cellule si colorano con DAPI, i nuclei devono essere facilmente osservabile.
    5. Raccogliere le immagini utilizzando rispettivo software di elaborazione delle immagini.

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Risultati

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Un esempio dei risultati ottenuti dall'applicazione delle procedure descritte è illustrato nelle figure 1A-D. Coprioggetto con CP-D e BE cellule CP-C sono stati trattati per 24 ore con 1 mM dell'inibitore Src famiglia, SKI-606, o di un veicolo (DMSO) e colorati con le modalità di cui sopra per il adherens Junction e Wnt segnalazione proteine, β -catenina. Visualizzazione di β-catenina è stata ottenuta mediante l'etichettatura con IgG anti-coniglio accoppiato ad un fluorocromo verde, mentre l'etichettatu...

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Discussione

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Abbiamo delineato un metodo per l'applicazione di IF di cellule essere verso chiarire gli effetti fisiologici di terapie mirate su queste cellule. Mentre abbiamo descritto l'uso di queste procedure verso cellule BE, abbiamo trovato che questi metodi sono applicabili ad una varietà di tipi cellulari 13,17,18 anche. Inoltre, queste procedure possono essere modificati in vari modi per ottimizzare la colorazione per target specifici.

Troviamo un parametro che ha un effetto dir...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal St, Fondazione Joseph (AJF, Lji) e American Lung Association, RG-224607-N (Lji).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CP-A (Linea cellulare metaplastica)ATCCCRL-4027
CP-B (Linea cellulare displastica di alta qualità)ATCCCRL-4028
CP-C (Linea cellulare displastica di alta qualità)ATCCCRL-4029
CP-D (Linea cellulare displastica di alta qualità)ATCCCRL-4030
Cheratinocita-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042
0,25% tripsina-EDTA (1x), rosso fenolo Life Technologies25200056
Siero fetale bovino, qualificato, HILife Technologies10438026
Miscela di antibiotici PSNLife Technologies15640
PBS - Soluzione salina tamponata con fosfatoLife Technologies10010049
Reagente antidissolvenza Pro-long Gold con DAPI Life TechnologiesP36931
Vetrino coprioggetti circolare in vetro 18 mmFisher Scientific15-183-86
β-catenina Anticorpo primario (Coniglio)Segnalazione cellulare9562S
Alexa Fluor 488 (Capra Anti-Coniglio)Life TechnologiesA11008
Piatto PS trattato TC da 10 cm, sterileUSA ScientificCC7682-3394
Piastra PS trattata con TC a 12 pozzetti, sterileUSA Scientific5666-5180
DMSOSigma-Aldrich276855
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148
Cloruro di ammonioSigma-AldrichA9434
SaponinaSigma-Aldrich47036
Albumina sierica bovina - Frazione VSigma-Aldrich85040C
SKI-606 (Bosutinib)Selleck ChemicalsS1014
Piatto quadrato per biodosaggio Thermo Scientific240835
Parafilm VWR82024-546
Pipette Pasteur monouso, vetro di selceVWR14672-380
Nexcelom Mini contatore di celleNexcelom
NexcelomCHT4-SD100-014
Microscopio Zeiss ApotomeZeiss
Camere di conteggio per cellometro Nexcelom

Riferimenti

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