Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Sommario

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Abstract

Le cellule staminali si dividono asimmetricamente per generare due cellule progenie con disparità di potenziale destino: una cellula staminale auto-rigenerante e una cellula di differenziazione. Data la loro rilevanza per lo sviluppo e la malattia, la comprensione dei meccanismi che governano la divisione delle cellule staminali asimmetrica è stata una zona robusta di studio. Perché sono geneticamente trattabili e sottoposti a cicli successivi di divisione cellulare circa una volta ogni ora, le cellule staminali del sistema nervoso centrale Drosophila, o neuroblasti, sono modelli indispensabili per lo studio di divisione delle cellule staminali. Circa 100 cellule staminali neurali sono situati vicino alla superficie di ciascuno dei due lobi cerebrali larvali, rendendo questo sistema modello particolarmente utile per studi di microscopia imaging dal vivo. In questo lavoro, passiamo in rassegna diversi approcci ampiamente utilizzati per visualizzare le divisioni di cellule staminali, e ci rivolgiamo i relativi vantaggi e gli svantaggi di queste tecniche che impiegano dissociano contro i tessuti cerebrali intatti. Abbiamo anche il nostro particolare simplifprotocollo IED utilizzato per espiantare cervelli interi da larve terzo instar per l'imaging cellulare dal vivo e applicazioni di analisi fisse.

Introduzione

Le cellule staminali mantenere un equilibrio di differenziazione e di auto-rinnovamento per generare diversità cellulare durante lo sviluppo iniziale e sostituire le cellule danneggiate nei tessuti adulti. Regolamentazione di tale omeostasi impedisce sia la perdita e eccessiva espansione della popolazione di cellule staminali, che può provocare la degenerazione dei tessuti deleterio o tumorigenesi.

Neuroblasti (NBS) sono le cellule staminali neurali ampiamente studiati del sistema Drosophila nervoso centrale (Figura 1A), che prima forma durante le fasi embrionali ^{1, 2.} NBs sottoposti a ripetuti cicli d....

Protocollo

1. Preparazione dei materiali necessari per espianto Brains al terzo stadio larvali

1. Preparare gli strumenti necessari per microdissezione.
   1. Forge due strumenti di dissezione (un bisturi e un gancio) in primo luogo mettendo un unico perno dissezione in ciascun supporto del perno. Assicurare le spine saldamente a mano o con pinze (Figura 1C).
   2. Utilizzare un paio di vecchie pinze per piegare un pin dissezione ad un angolo di circa 120 °. Eseguire questa sotto un microscopio da dissezione per garantire che la metà superiore del perno sia piatto quando il supporto del perno è tenuto in mano. Questo strumento sarà utilizzato com....

Risultati

Immagini dal vivo ha chiarito una serie di meccanismi che regolano NB ACD. Prima di acquisizione delle immagini, è necessario determinare le condizioni ottimali di imaging. È necessario bilanciare la velocità di acquisizione cornice con la durata di cellule vive. Per l'analisi cellulare fine, per esempio, l'aumento temporale e può essere richiesto risoluzione ottica. Quando visualizzare un singolo ciclo cellulare NB (Figura 4A), la velocità con cui le immagini vengono catturate può essere aument.......

Discussione

Imaging cellulare dal vivo è un approccio prezioso utilizzato per studiare i meccanismi che regolano ACD delle cellule staminali, la differenziazione delle linee cellulari, e la morfogenesi dei tessuti complessi. Sebbene gruppi di ricercatori hanno storicamente impiegato una varietà di tecniche per visualizzare NB ACD, questi approcci possono generalmente essere raggruppate in due categorie che differiscono principalmente per quanto riguarda se il tessuto cerebrale è lasciata intatta o dissociata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per coltura tissutale Lumox 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	Una piastra per coltura riutilizzabile con una base in pellicola permeabile ai gas e otticamente trasparente.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotico-Antimicotico (100x)	Invitrogen	15240-062	Un integratore contenente penicillina (10.000 U/ml), streptomicina (10.000 μ g/ml) e amfotericina B (25 μ g/ml) che viene aggiunto al terreno S2 di Schneider per prevenire la contaminazione batterica e fungina.
Vetrini coprioggetti, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Olio alocarbonico 700	Sigma-Aldrich	H8898	Un olio inerte ad alta viscosità, limpido e incolore.
Coppia di portaperni nichelati, lunghi 17 cm	Fine Science Tools	26018-17
Coppia di pinze Dumont #5 Fine	Science Tools	11252-20
Ago/sonda da dissezione con manico in plastica	Fisher Scientific	08-965-A
Filtro per siringa, 0,22 μ m dimensione dei pori	Fisher Scientific	09-719A
Siringa, 5 ml	BD Biosciences	309646
Pipetta di trasferimento in plastica	Fisher Scientific	S30467-1
Paraformaldeide, 32%	di microscopia elettronica EM Scienze	15714	ATTENZIONE: La formaldeide è tossica e deve essere maneggiata in una cappa aspirante. Seguire le linee guida MSDS per una manipolazione sicura.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)	Invitrogen	D1306	Un colorante che marca il DNA ed è eccitato dalla luce UV.