Articolo metodologico

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

DOI:

10.3791/51763

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12 agosto 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Abstract

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Gli attuali modelli di astrocitoma sono limitati nella loro capacità di definire i ruoli delle mutazioni oncogeniche in specifici tipi di cellule cerebrali durante la patogenesi della malattia e la loro utilità per lo sviluppo preclinico di farmaci. Al fine di progettare un sistema modello migliore per queste applicazioni, sono stati raccolti e coltivati in coltura astrociti corticali fenotipicamente wild-type e cellule staminali neurali (NSC) provenienti da topi condizionali geneticamente modificati (GEM) che ospitano varie combinazioni di alleli oncogenici floxati. La ricombinazione genetica è stata indotta in vitro utilizzando la ricombinazione adenovirale Cre-mediata, con conseguente espressione di oncogeni mutati e delezione di geni oncosoppressori. Le conseguenze fenotipiche di queste mutazioni sono state definite misurando la proliferazione, la trasformazione e la risposta ai farmaci in vitro. Per definire il ruolo delle mutazioni oncogeniche e del tipo di cellula sulla tumorigenesi in vivo, sono stati sviluppati modelli ortotopici di allotrapianto, in cui le cellule trasformate vengono iniettate stereotassicamente nel cervello di cucciolate immuno-competenti. A differenza della maggior parte degli xenotrapianti di linee cellulari di glioblastoma umano, l'iniezione di astrociti corticali trasformati derivati da GEM nel cervello di compagni di cucciolata immunocompetenti ha prodotto astrocitomi, incluso il sottotipo più aggressivo, il glioblastoma, che ricapitolava i segni distintivi istopatologici degli astrocitomi umani, inclusa l'invasione diffusa del parenchima cerebrale normale. L'imaging a bioluminescenza di allotrapianti ortotopici da astrociti trasformati ingegnerizzati per esprimere la luciferasi è stato utilizzato per monitorare la crescita tumorale in vivo nel tempo. Pertanto, i modelli di astrocitoma che utilizzano astrociti e NSC raccolti da GEM con alleli oncogenici condizionali forniscono un sistema integrato per studiare la genetica e la biologia cellulare della patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo e possono essere utili nello sviluppo preclinico di farmaci per queste malattie devastanti.

Introduzione

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Astrocitomi sono il tumore cerebrale primario più comune e glioblastoma (GBM), un astrocitoma di grado IV, è il sottotipo più comune e aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 12-15 mesi 1,2. Invasione di astrocitomi diffusi, in particolare GBM, preclude la resezione chirurgica completa, limita l'efficacia delle terapie adiuvanti, e porta inevitabilmente alla post-trattamento recidiva 3. I pazienti inizialmente presenti sia con de novo (primario) GBM o con astrocitoma di grado inferiore che progredisce inevitabilmente (secondaria) GBM 4. GBM è genomicamente eterogeneo e caratterizzato da mutazioni si escludono a vicenda e co-si verificano in geni che governano tre principali vie di segnalazione: G 1 / S (Rb) checkpoint del ciclo cellulare, il recettore tirosin chinasi (RTK), e TP53 Percorsi di 5-7. GBM è composto da quattro sottotipi genomiche con profili di espressione distinti che assomigliano a diversi tipi di cellule del cervello, suggerendo che GBM sottotipo è influenfluenzati dalla sua cella di origine 6,8,9. Modelli di astrocitoma migliori sono tenuti a definire il ruolo di specifiche combinazioni di mutazioni in particolari tipi di cellule durante astrocitoma patogenesi. Sfruttando questi modelli per lo sviluppo di farmaci più efficaci preclinico in ultima analisi, contribuire a migliorare i risultati dei pazienti. Modelli di astrocitoma correnti comprendono stabilite linee cellulari umane, paziente derivante xenotrapianti (PDX), normali astrociti umani geneticamente modificati e cellule staminali neurali (NSC), e topi geneticamente ingegnerizzati (GEM) 10-14. Abbiamo sviluppato una alternativa, GEM non germinali (NGEM) modello 15 che utilizza cellule cerebrali primari - astrociti corticali e NSC - raccolti da GEM ospitare diverse combinazioni di alleli floxed oncogeni. L'obiettivo era quello di generare modelli di astrocitoma con cellule geneticamente definite che potrebbero essere caratterizzati fenotipicamente sia in vitro che in vivo e potenzialmente utilizzabili per lo sviluppo di farmaci in preclinico itopi mmune-competenti.

Linee cellulari umane Fondata sono il modello più comunemente usato di astrocitoma patogenesi e la risposta ai farmaci in vitro e in vivo. Essi sono tecnicamente semplice, ampiamente disponibile, e hanno definito cinetica e cancerogenicità su ortotopico xenotrapianto in topi immunodeficienti 10,11,16-18 . I loro svantaggi includono l'incapacità di generare linee cellulari stabilizzate da astrocitomi di basso grado, limitando studio solo per astrocitoma di alta qualità; mancanza di una cella definita di origine; la presenza di anomalie genomiche complesse, spesso con profili genomici che si differenziano notevolmente dal campione del paziente originale; e suscettibilità fenotipica e genotipica deriva durante la cultura di serie nel siero 11,17,19-22. Le conseguenze fenotipiche delle singole mutazioni oncogene in linee cellulari GBM umani stabiliti possono essere mascherati dalla moltitudine di anomalie che sono effettivamente presenti, che spesso preclude elucidation delle conseguenze dirette genotipo-fenotipo.

PDX sono generati attraverso il passaggio sottocutanea di cellule di astrocitoma-isolati di pazienti in topi immunodeficienti o attraverso la loro cultura come sferoidi non aderenti a definito, terreno privo di siero prima dell'iniezione ortotopico nel cervello di topi immunodeficienti 12,23. PDX mantenere più accuratamente il paesaggio genomico di astrocitoma umano, ma simile a linee cellulari umane stabilite, l'effetto fenotipico di singole mutazioni oncogene può essere mascherato a causa della loro complessità genomica 19,24. Per definire le conseguenze fenotipiche di specifiche mutazioni oncogene, in particolare in risposta alle nuove terapie, i pannelli di linee cellulari umane stabiliti o PDX sono spesso utilizzati per stabilire correlazioni genotipo-fenotipo, mostrare generalizzabilità, e ridurre al minimo la probabilità di effetti specifiche della linea di cellule. Mentre PDX ricapitolare con precisione le caratteristiche istopatologiche di astrocitoma umano, incLuding invasione, xenotrapianti ortotopici di linee cellulari umane stabiliti in genere non 21,23,25. Inoltre, normali astrociti umani e NSC sono stati geneticamente ingegnerizzato con mutazioni oncogene definite per modellare astrocitoma tumorigenesi in vitro e in vivo 13,14,26. Queste cellule non hanno la complessità genomica delle linee cellulari umane consolidate e PDX e ricapitolano accuratamente istopatologia astrocitoma umano, ma richiedono xenotrapianto nei roditori immunodeficienti in vivo. Poiché tutti i modelli cellulari umani richiedono host roditori immunodeficienti per evitare immuno-mediata rifiuto xenotrapianto, questi modelli non riescono a ricapitolare le interazioni tumore-stroma nativi di un sistema singeniche e mancano di un sistema immunitario intatto, limitando indagine preclinica di stroma-mirata e immuno-modulazione terapie 10,11.

GEM permesso di esame delle conseguenze fenotipiche di combinazioni predeterminate di muta oncogenozioni in vivo durante la tumorigenesi in situ. Considerando che la GEM non-condizionale hanno mutazioni all'interno di tutti i tessuti durante lo sviluppo, GEM condizionale hanno floxed alleli oncogeni che consentono il targeting di mutazioni limitando ricombinazione Cre-mediata di specifici tipi cellulari attraverso l'uso di specifici del tipo di cellule promotori 10,11,15,18. Condizionale astrocitoma GEM sono stati utilizzati per chiarire i ruoli funzionali di mutazioni in oncogeni tipi cellulari distinti all'interno di un cervello intatto 11. L'utilità di preclinico in situ gliomagenesis usando GEM condizionale è limitato da una serie di fattori, tra cui 1) la mancanza di una correlazione in vitro, 2) la difficoltà nel generare grandi coorti di topi con genotipi complessi, 3) tempi di latenza delle nello sviluppo del tumore in situ , 4) e stocastico progressione tumorale. Perché in situ tumorigenesi manca un modello corrispondente in vitro, test anti-droga in vitro non può essere eseguita wesima modelli GEM condizionali convenzionali. A differenza di altri tipi di tumore, modelli GEM condizionali di astrocitoma sono raramente indotti da singole mutazioni oncogeniche 11. Pertanto, i regimi di allevamento complessi sono necessari per generare GEM condizionale con più mutazioni oncogene. Inoltre, astrocitoma iniziazione si verifica con penetranza variabile, dopo un lungo periodo di latenza in questi modelli, mentre la progressione di astrocitomi di alto grado si verifica in genere in modo non uniforme, stocastico modo e dà infine origine a tumori con complessi paesaggi genomiche e cinetica di crescita rapida 27, 28. La penetranza variabile e la natura stocastica della progressione maligna nei modelli GEM condizionale richiede che i singoli topi proiettati da radiografie per rilevare la presenza e la posizione di astrocitomi di alto grado prima del loro arruolamento negli studi preclinici di droga. Nel loro insieme, queste limitazioni ostacolano la generazione e la sperimentazione di grandi coorti di GEM condizionale necessario per prtest eClinical droga.

Il sistema GEM RCAS-TVA, che utilizza retrovirali aviaria (RCA) vettori per infettare GEM ingegnerizzato per esprimere il recettore virale (TVA) su specifici tipi di cellule neurali, è stato ampiamente utilizzato per modellare astrocitoma tumorigenesi 11. In contrasto con GEM condizionale, questo sistema modello permette l'introduzione di mutazioni multiple oncogeni in tipi specifici di cellule, senza la necessità di sistemi di allevamento complessi. Tuttavia, è limitato da penetranza variabile, il requisito per dividere attivamente le cellule per ottenere l'integrazione virale, e l'inserimento casuale di transgeni nel genoma dell'ospite 29.

GEM (NGEM) Modelli non germinali, che utilizzano le cellule raccolte da GEM, stanno diventando sempre più importanti perché superare molte delle limitazioni degli altri sistemi modello 15. Il ruolo di avvio tipo di cellula e mutazioni co-occorrenti in astrocitoma patogenesi sono difficili da scoraggiareminiera utilizzando stabilito linee cellulari umane GBM o PDX perché derivano da tumori allo stadio terminale che hanno accumulato ampi mutazioni genetiche in tipi cellulari non definiti nel corso della progressione maligna. Al contrario, tutti i tipi di astrocitoma possono essere modellati utilizzando NGEM inducendo definite mutazioni genetiche all'interno di specifici tipi di cellule cerebrali purificate 11,30. Così, l'influenza di mutazioni genetiche specifiche e tipo cellulare su fenotipi cellulari e molecolari può essere determinata in vitro e in vivo. Simile a linee di cellule GBM umani stabiliti, in vitro test iniziale in droga utilizzando NGEM può essere utilizzato per dare priorità farmaci per la sperimentazione in vivo che utilizzano le stesse cellule. Tumorigenesi in vivo può essere determinato da allotrapianto di cellule NGEM ortotopicamente nel cervello dei fratellini singeniche immuno-competente 30. Questi modelli trapianto allogenico ortotopici permettono quindi nei test in vivo non solo convenzionali citotossici unnd terapie mirate, ma immuno-modulante e terapie stroma mirate pure. Infine, il ruolo del microambiente sulla iniziazione tumorale e la progressione può essere determinata confrontando i risultati tra NGEM e modelli GEM convenzionali utilizzando le stesse mutazioni negli stessi tipi cellulari.

Noi e altri abbiamo sviluppato astrocitoma NGEM utilizzando cellule primarie - astrociti, NSC, o cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) - raccolte da GEM 30-34. La logica alla base dello sviluppo di un astrocitoma NGEM era quello di creare un modello per determinare le conseguenze fenotipiche delle mutazioni in oncogeni specifici tipi cellulari che potrebbero essere utilizzati per la sperimentazione preclinica dei farmaci in vitro e in vivo in animali immuno-competenti. Abbiamo raccolto astrociti fenotipicamente WT corticali e NSC da non esprimono Cre, GEM subordinata mantenuto su un 94% C57 / BL6 sfondo> con floxed RB percorso - Rb1 loxP / loxP, o TgGZT121 - e floxed RTK / RAS / PI3K pathway - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - geni in varie combinazioni 35-39. Siamo indotti ricombinazione genetica in vitro utilizzando vettori adenovirali codificanti Cre ricombinasi. Perché raccolti astrociti corticali contengono una miscela di tipi di cellule, abbiamo utilizzato vettori Ad5GFAPCre o transgeni oncogeni dominanti, come TgGZT 121 guidato dal promotore GFAP umana, per arricchire di GFAP + astrociti corticali in queste culture. Abbiamo definito le conseguenze fenotipiche della G 1 / S (Rb), MAPK, e mutazioni di PI3K pathway in astrociti corticali e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K pathway attivato G1 / S-difettosi astrociti molecolarmente imitato GBM umano proneurale e, a seguito di iniezione ortotopico, tumori formate in una posizione pre-definita con cinetica di crescita uniformi, brevi latenze, e la istopatologiciAL caratteristiche di GBM umano 30. Monitoraggio longitudinale della crescita tumorale in vivo aiuta droga test preclinici attraverso la normalizzazione delle coorti di trattamento e analisi quantitativa della crescita tumorale in risposta al trattamento 40. Abbiamo determinato cinetica di crescita tumorale da parte longitudinale bioluminescenza imaging topi iniettati con luciferasi che esprimono astrociti corticali. Pertanto, astrociti corticali e NSC derivate da GEM condizionale forniscono un sistema modello trattabili per la definizione delle conseguenze funzionali di mutazioni astrocitoma associate e di un sistema di potenziale modello per lo sviluppo di farmaci preclinico.

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Protocollo

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Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla University of North Carolina Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Coltura corticale astrociti da topi neonati

  1. Preparazione
    1. Crumple 2-3 tessuti compito delicato e posizionare sul fondo di un pallone contenente etanolo al 70%. Posizionare forbici dissezione, pinze curve e 2 coppie di rette micro pinze in questo fiasco. I tessuti sono utilizzati per evitare di piegare le micro pinze.
    2. Aggiungere 1 ml di HBSS ad un piatto di coltura di tessuto di 60 mm. Preparare un piatto separato per ogni animale e mantenere piatti sul ghiaccio.
    3. Anestetizzare gli animali per i regolamenti istituzionali.
    4. Caldo 7 ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina (completo DMEM) per ciascun animale in un bagno d'acqua a 37 °. NOTA: Per i 5 topi, i punti 1.1.1-1.1.4 prenderà ~ 15 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice topo neonatale (giorno 1-3) per institutiregolamenti onal.
    2. Rimuovere le forbici dissezione da etanolo, permettere loro di sgocciolare, e fare un taglio sagittale della pelle sopra il cranio dal midollo spinale al naso.
    3. Fare un taglio nel cranio, lungo la sutura sagittale, partendo dal midollo spinale e si estende oltre i bulbi olfattivi. Fare attenzione a tenere le punte delle forbici vicino alla superficie interna del cranio per ridurre al minimo i danni ai tessuti cerebrali.
    4. Utilizzando pinze curve, buccia delicatamente ogni emisfero del cranio lateralmente lontano dal cervello.
    5. Utilizzando dritto micro pinze, pizzicare delicatamente via la porzione dorsale di ogni emisfero corticale e metterlo nel piatto di coltura tissutale contenente HBSS. Fare attenzione ad evitare il cervelletto e il bulbo olfattivo. Non prendere qualsiasi tessuto al di sotto del corpo calloso.
    6. Utilizzando un microscopio da dissezione e 2 paia di micro pinze, rimuovere delicatamente le meningi da ciascun emisfero corticale. Ritorna il piatto coltura di tessuti in ghiaccio fino al inizio homogenizatio tessuton.
    7. Ripetere i passaggi da 1.2.1 tramite 1.2.6 per ogni animale. NOTA: Per i 5 topi, i punti 1.2.1-1.2.7 prenderà ~ 30 min.
  3. Tissue Omogeneizzazione
    1. Utilizzando una lama di rasoio pulito, finemente a dadini gli emisferi corticali e spostare la piastra ad una cappa coltura tissutale.
    2. Trasferire il tessuto tagliato a dadini in un tubo da 15 ml sterile. Lavare la piastra con 1 ml di ghiaccio freddo HBSS e trasferire nella provetta contenente tessuti.
    3. Attendere fino a quando il tessuto si deposita sul fondo della provetta, quindi rimuovere con cautela l'eccesso HBSS con una pipetta.
    4. Aggiungere 2 ml di temperatura ambiente tripsina / EDTA. Deporre circa 10x con una pipetta 1 ml di dissociare ulteriormente le cellule.
    5. Incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 15 - 20 min. Mescolare accuratamente capovolgendo ogni 5 min.
    6. Aggiungere 3 ml di DMEM completo per inibire la tripsina. Deporre circa 10x con una pipetta 1 ml per mescolare la soluzione.
    7. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    8. Rimuovereil surnatante con una pipetta 1 ml. Non aspirare il terreno perché il pellet potrebbe essere allentato.
    9. Risospendere il pellet in 4 ml di 37 ° C completare DMEM. Trasferire la sospensione cellulare a 75 cm vite superiore pallone di coltura tissutale. NOTA: Per i 5 topi, i punti 1.3.1-1.3.9 prenderà ~ 50 min.
    10. Circa 16 ore dopo la raccolta astrociti, lavare il pallone con 4 ml di 37 ° C HBSS, poi aggiungere 4 ml di 37 ° C completare DMEM. Mantenere gli astrociti corticali a 37 ° C in 5% di CO 2. NOTA: La fase di lavaggio è importante per la rimozione delle cellule non aderenti e detriti dalla cultura piatto.
    11. Quando la cultura è ~ 95% confluenti, agitare una notte a 37 ° C in 5% di CO 2, rimuovere i supporti contenenti le cellule staccate, quindi lavare il pallone con 4 ml di 37 ° C HBSS. Aggiungere 4 ml di 37 ° C completare DMEM e mantenere le cellule a 37 ° C in 5% CO 2. NOTA: Questo passaggio è importante per arricchire le culture di astrociti corticali, come contaminanti microglia ecellule progenitrici degli oligodendrociti si staccano con questa procedura e vengono rimossi dalla cultura 41.
    12. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.11 per ogni animale.
  4. Induzione di ricombinazione genetica
    1. 24 ore dopo aver completato il punto 1.3.11, sostituire il supporto con 2 ml di 37 ° C completare DMEM. Aggiungere 1 ml di 37 ° C SCM contenenti 1 ml di> 10 10 pfu / ml di Ad5CMVCre o Ad5GFAPCre. Incubare per 6 ore a 32 ° C in 5% di CO 2 .CAUTION: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 durante la manipolazione adenovirus ricombinante.
    2. Rimuovere i supporti contenenti virus e aggiungere 37 ° C DMEM completo senza virus agli astrociti corticali. ATTENZIONE: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 durante la manipolazione adenovirus ricombinanti e scartare il supporto contenente il virus per i regolamenti istituzionali. NOTA: Per 5 colture di astrociti, i punti 1.4.1 - 1.4.3 prenderà ~ 15 min escludendo l'incubazione 6 ore.
    3. Espandere colture di astrociti corticali per avitro e in vivo caratterizzazione. NOTA: Determinare la presenza di mutazioni in seguito Cre-ricombinazione mediante PCR con primer specifici per il gene ricombinato o da immunoblots sia per la proteina mutata specifico o delle sue conseguenze segnalazione. Il tempo necessario per la stabilizzazione fenotipica di colture di astrociti corticali dopo Cre-ricombinazione sarà dipendente da mutazioni utilizzati e deve essere determinata empiricamente (Figura 2).

2. Coltura neurali Cellule Staminali da topi neonatale

  1. Preparazione
    1. Prima di iniziare la dissezione, preparare 4 ml di soluzione di digestione al cervello con l'aggiunta di 3,1 mg di papaina e 1,3 mg di cisteina 4 ml di mezzo di dissociazione - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5.8 mM MgCl 2, 0,25 mM CaCl 2 , 1 HEPES mM (da 1 M HEPES pH 7,4 magazzino) glucosio 20 mM, 0,001% di rosso fenolo, e NaOH 0,125 mm. Aggiunta di papainae cisteina al mezzo dissociazione diventa la soluzione di colore giallo.
    2. Incubare a 37 ° C bagnomaria per 15 min. Mescolare periodicamente per inversione.
    3. Aggiungere 0,1 M NaOH goccia a goccia fino a soluzione di digestione torna alla luce di colore rosso.
    4. In una cappa di coltura di tessuti, filtro sterile la soluzione di digestione utilizzando un filtro siringa (0,22 micron dimensione dei pori). Conservare la soluzione di digestione su ghiaccio.
    5. Preparare 50 ml di Stem Cell Media (SCM) mescolando 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC supplemento, 0,5 ml di penicillina-streptomicina, 50 ml 0,2% eparina, 10 ml 100 mg / ml di EGF, e 10 ml 100 mcg / ml bFGF. SCM è stabile per 1 settimana se conservato a 4 ° C.
    6. Preparare completa HBSS (cHBSS) mescolando 50 ml di HBSS 10x, 1,25 ml di 1 M HEPES (pH 7.4), 15 ml di 1 M D-glucosio, 5 ml 100 mM CaCl 2, 5 ml 100 MgSO mm 4, e 2 ml di 1 M NaHCO3. Portare il volume totale di 500 ml con DDH 2 O.
    7. Filtro sterilizzare cHBSS witha 0,2 micron pori del filtro dimensioni e conservare a 4 ° C.
    8. Crumple 2-3 tessuti compito delicato e posizionare sul fondo di un pallone contenente etanolo al 70%. Posizionare forbici dissezione, pinze curve, e 2 paia di rette micro pinze in questo fiasco. I tessuti sono utilizzati per evitare di piegare le micro pinze. NOTA: Per i 5 topi, i punti 2.1.1-2.1.8 prenderà ~ 45 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice neonatale (giorno 1-3) topi per i regolamenti istituzionali.
    2. Rimuovere le forbici dissezione dal etanolo al 70%, consentono loro di sgocciolare, e fare un taglio sagittale della pelle sopra il cranio dal midollo spinale al naso.
    3. Fare un taglio nel cranio, lungo la sutura sagittale, partendo dal midollo spinale e si estende oltre i bulbi olfattivi. Fare attenzione a tenere le punte delle forbici vicino alla superficie interna del cranio per ridurre al minimo i danni ai tessuti cerebrali.
    4. Utilizzando pinze curve, buccia delicatamente ogni emisfero del cranio lateralmente dallacervello.
    5. Rimuovere delicatamente l'intero cervello e mettere in ghiaccio cHBSS freddo.
    6. Utilizzando un microscopio dissezione, rimuovere con attenzione meningi dal cervello con strumenti di dissezione sottili.
    7. Posizionare il cervello sulla sua superficie inferiore e rimuovere cervelletto / romboencefalo e bulbo olfattivo / corteccia frontale con verticale (coronale) taglia con un bisturi taglia 11.
    8. Ruotare il cervello residuo di 90 ° per posizionarlo sulla porzione caudale, generando così una vista coronale del cervello. Individuare i ventricoli laterali.
    9. Tagliare una sezione cubica contenente la zona subventricolare (SVZ).
    10. Trasferimento SVZ contenenti tessuti per un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri con ghiaccio fresco cHBSS freddo e il tessuto trito con taglia 11 bisturi.
    11. Trasferire il tessuto tritato in una provetta sterile da 15 ml. Posizionare il tubo in ghiaccio.
    12. Lavare la capsula di Petri con 1-2 ml di ghiaccio cHBSS freddo. Trasferire la soluzione di lavaggio al tubo contenente tessuti.
    13. Ripetere i punti 2.2.1-2.2.12 con la neonata supplementarel topi se necessario. Trasferire tutte le provette da 15 ml di una cappa coltura tissutale per il resto del protocollo. NOTA: Per i 5 topi, i punti 2.2.1 - 2.2.13 prenderà ~ 45 min.
  3. Tissue Omogeneizzazione
    1. Posizionare la soluzione di digestione (preparata al punto 2.1.1) in un bagno d'acqua a 37 ° per 5 min. Inoltre, caldo 2 ml di SCM per il cervello in un bagno di 37 ° C Acque.
    2. Rimuovere con attenzione il surnatante del tessuto tritato con una pipetta 1 ml. Non aspirare.
    3. Aggiungere la soluzione di digestione 2 ml di 37 ° C per 15 ml provetta e miscelare accuratamente per inversione.
    4. Incubare a 37 ° C bagnomaria per 15 min. Mescolare capovolgendo ogni 5 min.
    5. Aggiungere altri 2 ml di soluzione di digestione 37 ° C in ogni provetta e ripetere il punto 2.3.4.
    6. Lasciare le cellule di depositarsi sul fondo della provetta per gravità, quindi rimuovere il supernatante dal tessuto digerito con una pipetta 1 ml.
    7. Aggiungere 2 ml di 10 mM E-64 diluito in cHBSS e mescolare accuratamente per inversione.
    8. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
    9. Lasciare le cellule di depositarsi sul fondo della provetta per gravità, quindi rimuovere il supernatante dal tessuto digerito.
    10. Aggiungere 1 ml di 37 ° C cHBSS e omogeneizzare con una pipetta punta 1 ml (~ 20 colpi). Evitare di iniettare bolle d'aria durante l'omogeneizzazione dei tessuti.
    11. Passare il tessuto omogenato attraverso un filtro 40 micron cella dimensione dei pori, poi sciacquare il filtro con 5 ml di 37 ° C cHBSS.
    12. Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto a 125 xg per 5 min.
    13. Togliere il 95% di surnatante con una pipetta 1 ml senza disturbare il pellet di cellule. Pellet cellulare con cautela risospendere in 200 ml 37 ° C SCM con una punta di pipetta 200 microlitri.
    14. Aggiungere 1,8 ml 37 ° C SCM e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra ben 6 sterile. NOTA: Per i 5 topi, i punti 2.3.1-2.3.14 prenderà ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Culture
    1. Rifornire il mezzo dopo 3 giorni con l'aggiunta di altri 2 ml 37 °C SCM.
    2. Dopo 7 giorni, trasferire i neurosfere ad una provetta da 15 ml e lasciare che le neurosfere si depositano per gravità per> 5 min.
    3. Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 ml di 37 ° C SCM.
    4. Trasferire le neurosfere di un nuovo pozzo di una piastra ben 6.
    5. Aggiungere 2 ml di 37 ° C SCM ogni 3-4 giorni, e cambiare completamente media ogni 7 giorni.
    6. Se neurosfere sono> 100 micron di diametro, dissociare accuratamente con soluzione di dissociazione di cellule staminali e replate la NSC alla densità cella desiderata.
  5. Induzione di ricombinazione genetica
    1. Aggiungere 1 ml di 37 ° C SCM contenenti 1 ml di> 10 10 pfu / ml di Ad5CMVCre o Ad5GFAPCre al 2 ml di SCM attualmente sulle cellule. ATTENZIONE: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 nel maneggiare adenovirus ricombinante.
    2. Incubare per 6 ore a 32 ° C in 5% di CO 2.
    3. Trasferimento SCM con neurosfere in una provetta da 15 ml e lasciare che le sfere si depositano per gravità per 5 min.
    4. Rimuovere il surnatante prima con una pipetta 1 ml, poi con una pipetta 200 microlitri. ATTENZIONE: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 durante la manipolazione adenovirus ricombinanti e scartare il supporto contenente il virus per i regolamenti istituzionali.
    5. Aggiungere 2 ml di 37 ° C SCM, senza virus al NSC, poi trasferire in un piatto ben 6. NOTA: Per 5 culture NSC, i punti 2.5.1-2.5.5 prenderà ~ 15 min escludendo l'incubazione 6 ore.
    6. Il giorno successivo, ripetere i punti 2.5.1-2.5.5, seguita da neurosfere passaging quando necessario. Le sfere possono essere ampliati per 2-3 passaggi prima caratterizzazione in vitro e iniezione ortotopico nel cervello di topo in vivo. NOTA: Determinare la presenza di mutazioni in seguito Cre-ricombinazione mediante PCR con primer specifici per il gene ricombinato o da immunoblots sia per la proteina mutata specifico o delle sue conseguenze segnalazione. Il tempo necessario per la stabilizzazione fenotipica delle culture NSC dopo Cre-ricombinazione sarà dipendentesulle mutazioni utilizzati e deve essere determinato empiricamente (figure 2 e 3).

3 Iniezione ortotopico di cellule ricombinato nel cervello di topi destinatario Iimmunocompetent

  1. Preparazione del 5% metil cellulosa
    1. Sciogliere 5 g di 15 cPs metilcellulosa in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml in 100 ml bottiglia tappo a vite. Aggiungere la polvere lentamente sotto agitazione a 4 ° C per evitare grumi. Si può richiedere fino a 24 ore di agitazione a 4 ° C per tutta la metilcellulosa per entrare in soluzione.
    2. Pesare il pallone e registrare il peso.
    3. Autoclave la soluzione di metilcellulosa 5%. Una volta autoclave, la metilcellulosa diventerà un gel semisolido.
    4. Pesare il pallone e calcolare il peso perso durante la sterilizzazione in autoclave.
    5. Aggiungere asetticamente 1 ml di acqua sterile per ogni grammo di peso perso.
    6. Mettere in ghiaccio e aggiungere 50 ml di ghiaccio freddo 2x DMEM.
    7. Mescolare durante la notte con un agitatore magnetico a 4 ° C. Utilizzare una tecnica sterile per dividere la soluzione di metilcellulosa 5% in 20 ml aliquote. Conservare aliquote a 4 ° C per un massimo di sei mesi o fino alla 2x DMEM scadenza. NOTA: Preparazione della soluzione di metilcellulosa 5% a passi 3.1.1-3.1.7 richiederà ~ 2,5 giorni.
  2. Preparazione della corticale astrociti per iniezione
    1. Astrociti corticali Harvest quando ~ 90% confluenti.
    2. Per raccogliere, aspirare DMEM completo e lavare i piatti con un uguale volume di 37 ° C HBSS.
    3. Aggiungere abbastanza tripsina per coprire il piatto. Inclinare delicatamente e toccare la piastra fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
    4. Inattivare la tripsina con un uguale volume di 37 ° C completare DMEM.
    5. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e lavare la piastra con lo stesso volume di 37 ° C DMEM completo usato in 3.2.4.
    6. Media Transfer lavaggio alla provetta contenente cellule. Centrifugare a 200 xg per 3 min.
    7. Aspirare scellule upernatant e risospendere in 1 ml di 37 ° C completano DMEM.
    8. Conta la sospensione cellulare con un emocitometro o un altro contatore cella appropriata per determinare il numero di cellule / ml.
    9. Trasferire il numero desiderato di cellule in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200 xg per 3 min.
    10. Risospendere le cellule in 800 microlitri di 37 ° C completano DMEM. Determinare il volume del pellet di cellule (volume totale della sospensione cellulare - 800 microlitri). NOTA: E 'essenziale per ottenere una concentrazione di cellule preciso per l'iniezione. Pertanto, il volume del pellet cellulare deve essere determinata in questa fase per calcolare il volume del 5% metilcellulosa aggiungere nel passaggio 3.2.12.
    11. Trasferire le cellule ad una sterile da 1,5 ml provetta e centrifugare a 200 xg per 3 min.
    12. Aspirare il surnatante dal pellet e risospendere le astrociti corticali nel volume appropriato di ghiaccio-freddo 5% metil cellulosa (desideravano volume totale - volume diil pellet cellulare) per ottenere il numero desiderato di cellule / ml.
    13. Posizionare le cellule in ghiaccio fino iniezione.
    14. Posizionare una siringa di vetro da 250 ml in un dispenser Antigen Ripetendo poi posto un ottuso G 18 ago sulla siringa.
    15. Ritirare lo stantuffo lentamente con l'ago nella sospensione astrociti corticale; ci sarà una bolla d'aria sopra le celle che devono essere rimosse, poiché le bolle d'aria si comprime e diminuire il volume effettivamente iniettata nel cervello.
    16. Tenere la punta dell'ago appena sopra la sospensione astrociti corticali e spingere il pistone in fretta. La bolla d'aria si muove più veloce della sospensione cellulare e principalmente sarà espulso.
    17. Ripetere il punto 3.2.16 fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimossi dal ago.
    18. Riempire la siringa a circa ~ 200 microlitri, quindi tenere l'ago e tirare lo stantuffo fino all'arresto. Piccole bolle d'aria possono essere rimosse tenendo l'ago punta e rapidamente spingendo lo stantuffo in circa 50 microlitri poi lentamente ritirando a piena capacità.
    19. Tenere la punta in posizione verticale e ripetere il punto 3.2.18 4-5x.
    20. Gettare l'ago 18 gauge e inserire un ago 27 G sulla siringa.
    21. Premere il pulsante sul dispenser dell'antigene finché il liquido viene espulso dal ago. NOTA: Per 1 linea cellulare astrociti, i punti 3.2.1-3.2.21 prenderà ~ 60 min.
  3. Preparazione del NSC per iniezione
    1. Quando neurosfere sono> 100 micron di diametro, trasferimento in provette da 15 ml e lasciare che le neurosfere si depositano per gravità per> 5 min.
    2. Rimuovere il surnatante e dissociare le neurosfere con un reagente di dissociazione dolce, come la soluzione di dissociazione di cellule staminali o accutase secondo le istruzioni del costruttore o con il 0,05% tripsina-EDTA come descritto 42.
    3. Inibire i reagenti di dissociazione secondo le istruzioni del produttore, senza esporre il NSC al siero. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
    4. Aspirare il surnatante, poi risospendere le cellule in 1 ml di 37 ° C cHBSS per generare una sospensione di cellule singole.
    5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un altro contatore cella appropriata per determinare il numero di cellule / ml.
    6. Trasferire il numero desiderato di NSC per un nuovo tubo da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
    7. Risospendere le cellule in 800 ml di 37 ° C HBSS. Determinare il volume del pellet di cellule (volume totale della sospensione cellulare - 800 microlitri). NOTA: E 'essenziale per ottenere una concentrazione di cellule preciso per l'iniezione. Pertanto, il volume del pellet cellulare deve essere determinata in questa fase per calcolare il volume del 5% metilcellulosa aggiungere nel passaggio 3.3.9.
    8. Trasferire le cellule ad una provetta sterile da 1,5 ml e centrifugare a 100 xg per 5 min.
    9. Aspirare il surnatante e finire di preparare le cellule per l'iniezione ortotopico come in 3.2.12-3.2.21. NOTA: Per 1 linea cellulare NSC, i passaggi 3.3.1-3.3.9 si terrà ~ 60 min.
  4. Preparazione del mouse per iniezione
    1. Anestetizzare il destinatario degli animali tramite una iniezione IP di 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoethanol) o 100 mg / kg di ketamina oltre 10 mg / kg xilazina, secondo le linee guida istituzionali IACUC. NOTA: Utilizzato nel presente documento sono topi a 3-6 mesi di età, come ospiti trapianto allogenico. I topi in età diverse può essere utilizzato per studiare l'impatto microambientali dell'età evolutiva del cervello su tumorigenesi.
    2. Shave il cuoio capelluto sopra il sito di incisione con tagliaunghie o forbici.
    3. Sterilizzare il sito chirurgico con 3 alternati tamponi di etanolo al 70% e betadine.
    4. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per prevenire eventuali danni dovuti a perdita del riflesso corneale.
    5. Valutare profondità dell'anestesia con il ritiro pedale (pizzico tep) reflex. NOTA: Per i 5 topi, i punti 3.4.1-3.4.5 prenderà ~ 15 min.
  5. Impianto ortotopico
    1. Fissare l'animale nel telaio stereotassico.
    2. Makposta un'incisione sopra la sutura sagittale lungo circa 0,5 cm tra le orecchie e gli occhi.
    3. Individuare l'intersezione delle suture coronali e sagittali (bregma), così come l'intersezione delle suture lambdoid e sagittali (Lambda). Assicurarsi che Bregma e Lambda sono sullo stesso piano orizzontale.
    4. Attaccare la siringa contenente la sospensione cellulare e ripetendo dispenser antigene al telaio stereotassico sulla testa. Portare la punta dell'ago 27 G a contatto con Bregma. Questa è l'origine che verrà utilizzato per la manipolazione di tre coordinate tridimensionali.
    5. Sollevare l'ago leggermente la superficie del cranio e muovere di 2 mm lateralmente e di 1 mm rostrale da Bregma.
    6. Abbassare con cautela l'ago attraverso il cranio alla sua destinazione 4 millimetri ventrale da Bregma. NOTA: Abbiamo utilizzato queste coordinate stereotassica per indirizzare i gangli della base. Diversi coordinate stereotassica possono essere utilizzati per studiare l'impatto microambientali di diversoregioni cerebrali su tumorigenesi.
    7. Iniettare 5 ml di sospensione cellulare attivando l'erogatore antigene ripetuta una volta. Lasciare l'ago in posizione per 2 minuti per consentire la pressione intracranica equilibrare.
    8. Estrarre l'ago lentamente in un periodo di 30 sec. Usare un batuffolo di cotone per applicare la pressione di qualsiasi sanguinamento che possono verificarsi.
    9. Approssimare i bordi della ferita e chiudere l'incisione con adesivo tissutale. Somministrare 20 ml di lidocaina per via sottocutanea al sito di incisione. NOTA: Per i 5 topi, i punti 3.5.1-3.5.9 prenderà ~ 50 min. L'UNC IACUC approvato l'uso post-operatorio di soli anestesia locale. Si raccomanda un consulto IACUC istituzionale locale in materia di requisiti per l'uso analgesico postoperatorio dopo questa procedura.
  6. Cura post-chirurgica
    1. Mettere gli animali in un ambiente pulito, gabbia calda per recuperare. Gli animali non devono essere collocati direttamente nella biancheria da letto, come l'aspirazione accidentale può verificarsi.
    2. Osservare ilanimali per la ripresa di un comportamento normale, come governare, mangiare, e la defecazione. NOTA: Ripresa di un comportamento normale può prendere ~ 60 min.

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Risultati

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Abbiamo sviluppato un sistema modello NGEM con astrociti corticali e NSC raccolte da neonatale GEM l'ospitare floxed condizionali alleli oncogeni che possono essere caratterizzati fenotipicamente in vitro e in vivo (Figura 1). Al fine di indagare le conseguenze delle mutazioni oncogeniche specificamente in astrociti corticali in vitro, è fondamentale per arricchire la prima per astrociti. Raccolti astrociti corticali contengono una miscela di microglia, astrociti, oligodendroc...

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Discussione

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I passaggi più critici per assicurare la corretta raccolta e la cultura di astrociti corticali sono 1) di asportare la corteccia senza prendere il tessuto al di sotto del corpo calloso, 2) per togliere le meningi, 3) per dissociare completamente le cellule, e 4) per arricchire di GFAP + astrociti. Anche se abbiamo usato meccanica (scuotimento) e genetico (limitazione di ricombinazione genetica con un vettore Ad5GFAPCre o l'utilizzo di una trasformazione transgene dominante (TgGZT 121) ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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CRM è un ricercatore clinico di Damon Runyon-Genentech. Questo lavoro è stato supportato, in parte, da sovvenzioni al CRM dalla Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), dal Dipartimento della Difesa (W81XWH-09-2-0042) e dal Fondo per la ricerca sul cancro dell'Università della Carolina del Nord (UCRF). Gli autori desiderano ringraziare Daniel Roth per l'assistenza nell'allevamento dei topi. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette e Susannah Krom per l'assistenza alla coltura dei tessuti e all'immunofluorescenza.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM può essere acquistato anche da altri fornitori, tra cui GIBCOSigma e Cellgro
Fetal Bovine Serum, RegularCellgro35-010-CV
Penicillina-StreptomicinaInvitrogen15140122
Forbici da dissezione a punta affilataFisher Scientific08-395
Cartilagine Pinza per pollice, curvaFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Pinze per gioiellieri, fine, 4Miltex17-301
Etanolo (200 proof)Lamette da barba Decon Labs2710
VWR55411-050
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (1x), liquidoInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol RedInvitrogen12605-010Altre soluzioni di tripsina sono adatte anche per l'astrite corticale degli astrociti e la coltura
Piatto di coltura, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
Provette da 15 mlBD Biosciences352096
Provette da 50 mlBD Biosciences352070
Stock di adenovirusTrasferimento genico Vector Core, U. IowaAd5CMVCreNegozio in 5 µ l aliquote a -80 °C. Pericoloso. Utilizzare le precauzioni di sicurezza Bsl2
Solfato di sodio (Na2SO4) Sigma-Aldrich 238597
Solfato di potassio (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Cloruro di calcio (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES saledi potassioSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlucosioSigma-AldrichG8270 
Rosso fenoloSigma-AldrichP3532
Idrossido di sodio (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainaWorthingtonLS003127
L-Cisteina-HClSigma-AldrichC1276
Filtro per siringa (0,22 &; m dimensione dei pori)MilliporeSLGP033NS
Kit per la proliferazione di Neurocult, mouseStemcell Technologies5702Questo kit contiene il NeuroCult NSC Basal Medium e l'integratore NeuroCult NSC necessario per la coltura di NSC
Soluzione di eparina allo 0,2%Stemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Solfato di magnesio (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Fare 10 mM stock in DMSO, negozio a -20 ° C
Piastre a 6 pozzettiFisher Scientific07-200-83
Filtro cellulare (40 &; micro; Corning352340
Soluzione di dissociazione delle cellule staminaliStemcell Technologies5707In alternativa, utilizzare soluzioni enzimatiche delicate come l'Accutase
Methyl cellulosa 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-BPer la produzione di una soluzione di metilcellulosa al 5%
1,7 ml Tappo a scatto Provetta per microcentrifugaCorning3620
Siringa Hamilton, 250 & micro; l LT senza agoFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Dispenser di antigeneHamilton 83700
Aghi monouso da 18 GFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2" ago con punta luerFisher Scientific14-826-48
2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Unguento oftalmicoFisher Scientific
Modello 900 Telaio stereotassicoKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Adesivo tissutale 
Lidocaina ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-SOX2MilliporeAB5603
Polyclonal Rabbit Anti-glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerPer imaging in vivo
D-Luciferina - Substrato bioluminescente al sale K+PerkinElmer122796Per imaging a bioluminescenza in vivo
Kit di imaging EdUInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-igroAddgene18782
NC9689910

Riferimenti

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