Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Sommario

Fluorofori singoli possono essere localizzati con precisione nanometrica utilizzando FIONA. Ecco un riassunto della tecnica FIONA è segnalato, e come condurre esperimenti Fiona è descritto.

Abstract

Fluorescenza per immagini con una precisione di un nanometro (FIONA) è una tecnica semplice ma utile per la localizzazione di singoli fluorofori con precisione nanometrica nel piano xy. Ecco un riassunto della tecnica FIONA è segnalato ed esempi di ricerche che sono state eseguite utilizzando FIONA vengono brevemente descritti. In primo luogo, come impostare le attrezzature necessarie per gli esperimenti FIONA, vale a dire, per un totale interno microscopia a fluorescenza di riflessione (TIRFM), con dettagli sulle allineare le ottiche, è descritto. Poi come realizzare un esperimento semplice FIONA sulla localizzazione immobilizzato Cy3-DNA singole molecole utilizzando protocolli appropriati, seguita dall'uso di FIONA per misurare la dimensione del passo 36 nm di un singolo miosina troncato motore Va marcato con un punto quantico, è illustrato. Infine, è segnalato recente sforzo di estendere l'applicazione di FIONA a campioni di spessore. Si dimostra che, utilizzando un obiettivo immersione in acqua e punti quantici imbevuto nel profondo sol-gel e cornee degli occhi di coniglio (>200 micron), la localizzazione di precisione di 2-3 nm può essere raggiunto.

Introduzione

Intorno al 1882, Ernst Abbe rilevato che la risoluzione di un microscopio a luce visibile è ~ λ / 2NA, o ~ 200 nm (dove λ è la lunghezza d'onda e NA è l'apertura numerica) ^1,2. Pertanto, qualsiasi oggetto più piccolo di questa dimensione potrebbe apparire come una macchia di diffrazione limitata in un microscopio ottico. Tuttavia, è possibile determinare il centro della macchia, che è, la posizione dell'oggetto, con una precisione molto maggiore ^3. Fluorescenza per immagini con una precisione di un nanometro (FIONA) è una tecnica semplice ma utile per la localizzazione di singoli fluorofori con precisione nanometrica nel piano xy ^4. L....

Protocollo

Etica Dichiarazione: Il tessuto corneale da conigli sono stati raccolti in conformità con la University of Illinois Istituzionale Animal Care e utilizzo linee guida.

Setup 1 TIRFM

NOTA: Indossare occhiali laser di sicurezza per tutto il tempo.

1. Assicurarsi che tutti i componenti ottici necessari elencati nella lista dei materiali sono disponibili e pronti per l'allineamento. Se necessario, utilizzare sostituti con funzioni equivalenti di altre società. Assicurarsi che specchi e le lenti dovrebbero avere anti-riflettente (AR) rivestimenti corrispondenti al laser in uso.
2. Impostare le altezze ....

Risultati

Una tipica configurazione TIRFM obiettivo-tipo è mostrato in Figura 3. Prima, campione di Cy3-DNA-superficie immobilizzato è stato ripreso. Una immagine tipica è mostrato in Figura 4a. L'immagine è stata scattata con il tempo di esposizione 0,5 secondi, con EM guadagno = 50 e la sensibilità del CCD = 12.13 per la fotocamera. Il-spread-funzione del punto (PSF) di una singola molecola Cy3-DNA è mostrata nella Figura 4b (dal punto indicato dalla freccia nella figur.......

Discussione

Fiona è una tecnica per localizzare la posizione di un emettitore fluorescente (fluoroforo organico o quantum dot) con una precisione nanometrica e risoluzione temporale fino a 1 msec ^{a 4 8.} Quando abbastanza fotoni vengono raccolti, questa tecnica consente di determinare la posizione di un emettitore fluorescente molto più preciso rispetto al limite di diffrazione (~ 200 nm) e quindi questa tecnica apre un modo per osservare ciò non è stato visto con microscopia ottica convenzionale / tradizionale ^{4 - 8.......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nastro biadesivo	3M		~75 µ m
spessa telecamera EMCCD	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Pulitore ad ultrasuoni	Branson	2510
Set di filtri a fluorescenza	Chroma	49016
Tampone di polimerizzazione dell'actina	Citoscheletro	BSA02
Biotina G-actina	Citoscheletro	AB07
G-actina	Citoscheletro	AKL95
Tampone generale di actina	Citoscheletro	BSA01
Otturatore laser (con driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Soluzioni di informazioni
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Vetrino coprioggetti	Fisherbrand	22X30-1,5	0,16-0,19 mm
di spessore Vetrino per microscopio	Sigillo d'oro Microvetrini	30103X1	0,93-1,05 mm di spessore
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-001
Piatto con fondo in vetro	In vitro Scientifico	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligo Tecnologie		integrate del DNA	5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Perle fluorescenti	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidina	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Kit di coniugazione degli anticorpi Qdot705	Invitrogen	Q22061MP
MATLAB	MathWorks
Tavolo ottico	Newport Corp		RS4000 Series
60X Obiettivo	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Obiettivo	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Obiettivo	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Microscopio invertito	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab
Anti-FLAG anticorpo	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotina	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatina Fosfochinasi dal muscolo di coniglio
CP	Sigma Aldrich	P1937	Fosfocreatina di(tris) sale
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Ditiotreitolo
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N′ acido -tetraacetico
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Acido protocatechico
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-diossigenasi
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Ortosilicato tetrametilico
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcromatono-2-carbossilico
specchi dielettrici a banda larga da 1" di diametro con supporti	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantità: 2
½ ” diametro pali	Thorlabs	TR4	Quantità ≥ 6
espansore di fascio 10X	Thorlabs	BE10M-A
2" diametro f = obiettivo 300 mm con attacco	Thorlabs	LA1256-A, lente TIR LMR2
Bersaglio di allineamento fluorescente	Thorlabs
Occhiali di sicurezza laser	Thorlabs	ND LG3Thorlabs
		FW1AND
Profilatore ottico del fascio	Thorlabs	BP209-VIS
Diaframma a iride montato su palo	Thorlabs	ID25	Quantità: 2
Interferometro a taglio	Thorlabs	SI100
XYZ, ½ ” viaggi	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW

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