Riportiamo una procedura per isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'isolamento di RNA di alta qualità da tessuti ricchi di ribonucleasi come il pancreas di topo rappresenta una sfida. Poiché una funzione primaria del pancreas è quella di aiutare la digestione, il pancreas di topo può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi. Riportiamo modifiche dei protocolli standard dei reagenti di lisi fenolo/guanidina tiocianato per isolare l'RNA dal pancreas di topo. Il tiocianato di guanidina è un potente denaturante proteico e interrompe efficacemente l'attività della ribonucleasi nella maggior parte delle condizioni. Tuttavia, sono necessarie modifiche critiche ai protocolli standard per isolare con successo l'RNA da tessuti ricchi di ribonucleasi. Le fasi chiave includono un elevato rapporto reagente di lisi/tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima della separazione di fase e l'inclusione di un inibitore della ribonucleasi nella soluzione di RNA. Utilizzando queste e altre modifiche, isoliamo abitualmente l'RNA con un numero di integrità dell'RNA (RIN) maggiore di 7. L'RNA isolato è di qualità adeguata per l'analisi di routine dell'espressione genica. L'adattamento di questo protocollo per isolare l'RNA da tessuti ricchi di ribonucleasi oltre al pancreas dovrebbe essere facilmente realizzabile.
Introduzione
È necessario isolamento di RNA con grande integrità per esperimenti di routine di biologia molecolare come Northern blotting 9, qRT-PCR 1 o gene expression profiling 5. La maggior parte dei metodi contemporanei di isolamento dell'RNA si basano sulle modificazioni dei protocolli tiocianato di guanidina 2, 3. Guanidina tiocianato è un forte proteina denaturante e verrà efficacemente interrompere l'attività di ribonucleasi in molte condizioni. Il metodo popolare di Chomczynski e Sacchi 3 combinato fenolo alla soluzione di guanidina tiocianato lisi, riducendo il tempo di isolamento per circa 4 ore. Molti reag....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione
Le seguenti pratiche aderiscono ai criteri impostati da cura degli animali ed uso commissione dell'Istituzione (IACUC).
- Si raccomanda di isolare non più di 6 pancreas di topo in un dato giorno. Hanno tutti gli strumenti chirurgici puliti e sterilizzati in autoclave, un set per ogni animale.
- Etichettare tutti i tubi microcentrifuga. Quattro 2 ml provette per animali.
- Mettere 8 ml di reagente di lisi in 50 ml provette da centrifuga su ghiaccio. Nota: Mentre il kit di purificazione viene fornito con un guanidina tiocianato reagente fenolo che è adatto per l'isolamento pancreas, reagente ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La resa RNA totale da 1 ml di omogenato lisi è 20-40 mg. OD 260/280 rapporti sono in genere circa il 2,0 e il RIN sono costantemente maggiore di 7.0. Se il RIN è ≤ 6, l'isolamento dovrà essere ripetuta. Occasionalmente, un RIN che è superiore a 8,0 si ottiene.
I due metodi più comunemente usati di eutanasia topi prima della rimozione del pancreas sono CO 2 asfissia o inalazione di isoflurano. Entrambe le tecniche sono seguiti da dislocazione cervicale. Poiché è possibile che il te.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Isolare RNA da tessuti che sono ribonucleasi ricco rappresenta una grande sfida per esperimenti di biologia molecolare. I vari reagenti e kit sono disponibili in commercio che si basano principalmente sul metodo fenolo guanidina tiocianato di estrazione di RNA. Guanidina tiocianato denatura proteine e quindi riduce l'attività di ribonucleasi. Tuttavia, l'ampiezza delle ribonucleasi nel pancreas richiede ulteriori modifiche ai protocolli standard di isolamento dell'RNA. Un protocollo è riportato qui che si .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paolo Grippo e Satyanarayana Rachagani per i loro utili commenti, suggerimenti e condivisione delle loro protocolli. Questo lavoro è stato sostenuto da U01CA111294 sovvenzione e un premio di sviluppo dell'idea del programma di ricerca intramurale Ohio State University.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Potenza Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | omogeneizzatore |
| 5424R | Eppendorf | Microcentifugo refrigerato | |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596018 | Reagente Lisi |
| Student Vannas forbici a molla | Fisher | 91500-09 | Utilizzare per tagliare il pancreas dai tessuti attaccati |
| Forbici chirurgiche, 6 pollici | Fisher | 08-951-20 | Utilizzare per tagliare la fessura del topo |
| Pinze smussate | Fisher | 1381239 | Utilizzare per trattenere il pancreas durante la dissezione |
| di isoflurano USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Uscita |
| rnasi anestetica (40 U/µ l) | Invitrogen | 10777-019 | Inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | Inattivatore Rnase generale |
| Acqua di grado HPLC | Fisher | W5-4 | Per il lavaggio delle lame dell'omogeneizzatore |
| Acqua di grado di biologia molecolare | Hyclone | SH30538.03 | Eluizione dell'RNA |
| miRNeasy Mini kit | purificazione | ||
| del 217004 QiagenProvette per microcentrifuga da 2 ml, certificate Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| Provette da centrifuga da 15 ml | Falcon | 352099 | |
| 70% etanolo | Fisher | ||
| 100% etanolo | Fisher | ||
| 200 &; l puntali per pipette | Rainin | Per la pulizia delle lame dell'omogeneizzatore | |
| Cloroformio | Fisher | BP1145-1 | |
| Spettrofotometro | Nanodrop | Thermo | ND-1000 |
| Bioanalizzatore | Agilent | Analizzatore di elettroforesi capillare per misurare l'integrità dell'RNA | |
| Reagente di stabilizzazione dell'RNA | Ambion | ||
| RNeasy colonne di rotazione | Colonne Qiagen | Spin come parte del miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | La loro età variava da 4 a 12 mesi. |
| Topi | Jackson Lab | ceppo 129 | La loro età variava da 4 a 12 mesi. |
Riferimenti
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
