Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Summary

Riportiamo una procedura per isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi.

Abstract

L'isolamento di RNA di alta qualità da tessuti ricchi di ribonucleasi come il pancreas di topo rappresenta una sfida. Poiché una funzione primaria del pancreas è quella di aiutare la digestione, il pancreas di topo può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi. Riportiamo modifiche dei protocolli standard dei reagenti di lisi fenolo/guanidina tiocianato per isolare l'RNA dal pancreas di topo. Il tiocianato di guanidina è un potente denaturante proteico e interrompe efficacemente l'attività della ribonucleasi nella maggior parte delle condizioni. Tuttavia, sono necessarie modifiche critiche ai protocolli standard per isolare con successo l'RNA da tessuti ricchi di ribonucleasi. Le fasi chiave includono un elevato rapporto reagente di lisi/tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima della separazione di fase e l'inclusione di un inibitore della ribonucleasi nella soluzione di RNA. Utilizzando queste e altre modifiche, isoliamo abitualmente l'RNA con un numero di integrità dell'RNA (RIN) maggiore di 7. L'RNA isolato è di qualità adeguata per l'analisi di routine dell'espressione genica. L'adattamento di questo protocollo per isolare l'RNA da tessuti ricchi di ribonucleasi oltre al pancreas dovrebbe essere facilmente realizzabile.

Introduction

È necessario isolamento di RNA con grande integrità per esperimenti di routine di biologia molecolare come Northern blotting ^9, qRT-PCR ¹ o gene expression profiling ^5. La maggior parte dei metodi contemporanei di isolamento dell'RNA si basano sulle modificazioni dei protocolli tiocianato di guanidina ^{2, 3.} Guanidina tiocianato è un forte proteina denaturante e verrà efficacemente interrompere l'attività di ribonucleasi in molte condizioni. Il metodo popolare di Chomczynski e Sacchi ³ combinato fenolo alla soluzione di guanidina tiocianato lisi, riducendo il tempo di isolamento per circa 4 ore. Molti reag....

Protocol

1. Preparazione

Le seguenti pratiche aderiscono ai criteri impostati da cura degli animali ed uso commissione dell'Istituzione (IACUC).

1. Si raccomanda di isolare non più di 6 pancreas di topo in un dato giorno. Hanno tutti gli strumenti chirurgici puliti e sterilizzati in autoclave, un set per ogni animale.
2. Etichettare tutti i tubi microcentrifuga. Quattro 2 ml provette per animali.
3. Mettere 8 ml di reagente di lisi in 50 ml provette da centrifuga su ghiaccio. Nota: Mentre il kit di purificazione viene fornito con un guanidina tiocianato reagente fenolo che è adatto per l'isolamento pancreas, reagente ....

Results

La resa RNA totale da 1 ml di omogenato lisi è 20-40 mg. OD 260/280 rapporti sono in genere circa il 2,0 e il RIN sono costantemente maggiore di 7.0. Se il RIN è ≤ 6, l'isolamento dovrà essere ripetuta. Occasionalmente, un RIN che è superiore a 8,0 si ottiene.

I due metodi più comunemente usati di eutanasia topi prima della rimozione del pancreas sono CO ₂ asfissia o inalazione di isoflurano. Entrambe le tecniche sono seguiti da dislocazione cervicale. Poiché è possibile che il te.......

Discussion

Isolare RNA da tessuti che sono ribonucleasi ricco rappresenta una grande sfida per esperimenti di biologia molecolare. I vari reagenti e kit sono disponibili in commercio che si basano principalmente sul metodo fenolo guanidina tiocianato di estrazione di RNA. Guanidina tiocianato denatura proteine ​​e quindi riduce l'attività di ribonucleasi. Tuttavia, l'ampiezza delle ribonucleasi nel pancreas richiede ulteriori modifiche ai protocolli standard di isolamento dell'RNA. Un protocollo è riportato qui che si .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potenza Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	omogeneizzatore
5424R	Eppendorf		Microcentifugo refrigerato
Reagente Trizol	Invitrogen	15596018	Reagente Lisi
Student Vannas forbici a molla	Fisher	91500-09	Utilizzare per tagliare il pancreas dai tessuti attaccati
Forbici chirurgiche, 6 pollici	Fisher	08-951-20	Utilizzare per tagliare la fessura del topo
Pinze smussate	Fisher	1381239	Utilizzare per trattenere il pancreas durante la dissezione
di isoflurano USP	Abbott Labs	4/8/5210	Uscita
rnasi anestetica (40 U/µ l)	Invitrogen	10777-019	Inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	Inattivatore Rnase generale
Acqua di grado HPLC	Fisher	W5-4	Per il lavaggio delle lame dell'omogeneizzatore
Acqua di grado di biologia molecolare	Hyclone	SH30538.03	Eluizione dell'RNA
miRNeasy Mini kit	purificazione
del 217004 QiagenProvette per microcentrifuga da 2 ml, certificate Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
Provette da centrifuga da 15 ml	Falcon	352099
70% etanolo	Fisher
100% etanolo	Fisher
200 &; l puntali per pipette	Rainin	Per la pulizia delle lame dell'omogeneizzatore
Cloroformio	Fisher	BP1145-1
Spettrofotometro	Nanodrop	Thermo	ND-1000
Bioanalizzatore	Agilent		Analizzatore di elettroforesi capillare per misurare l'integrità dell'RNA
Reagente di stabilizzazione dell'RNA		Ambion
RNeasy  colonne di rotazione	Colonne Qiagen		Spin  come parte del miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	La loro età variava da 4 a 12 mesi.
Topi	Jackson Lab	ceppo 129	La loro età variava da 4 a 12 mesi.