Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

Sommario

Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Abstract

Il timo è un organo vitale per lo sviluppo dei linfociti T. Di cellule stromali del timo, le cellule epiteliali timiche (TEC) sono particolarmente cruciali in più stadi di sviluppo delle cellule T: l'impegno delle cellule T, selezione positiva e selezione negativa. Tuttavia, la funzione del TEC nel timo rimane completamente compresa. Nell'articolo, mettiamo a disposizione un metodo per isolare sottoinsiemi TEC da topo fresco timo utilizzando una combinazione di perturbazione meccanica e digestione enzimatica. Il metodo permette di cellule stromali timiche e timociti per essere efficacemente rilasciato dalla cellula-cellula e connessioni cellula-matrice e per formare una cella singola sospensione. Usando le cellule isolate, citometria a flusso multiparametrica può essere applicato alla identificazione e caratterizzazione di TEC e cellule dendritiche. Perché TEC sono una rara popolazione di cellule nel timo, anche noi descriviamo un modo efficace per arricchire e purificare TEC mediante deplezione timociti, il tipo cellulare più abbondante nel timo. Folloala l'arricchimento, cell sorting tempo può essere ridotto in modo che la perdita di vitalità cellulare può essere minimizzato durante la purificazione della TEC. Cellule purificate sono adatti per varie analisi a valle come Real Time-PCR, Western blot e profilo di espressione genica. Il protocollo promuoverà la ricerca della funzione TCE e così come lo sviluppo di ricostituzione in vitro di cellule T.

Introduzione

All'inizio lo sviluppo delle cellule T, midollo osseo di cellule staminali ematopoietiche derivate da progenitori multipotenti sono reclutati alla corteccia del timo, sottoposto impegno a T lignaggio e diventare precursori delle cellule T ^1. Nella corteccia, precursori delle cellule T CD4 e CD8 doppio negativi (DN) timociti espandersi e differenziarsi in immaturo CD4 e CD8 doppio positivi (DP) timociti, formando una grande piscina di progenitori ai ricettori cellulari altamente variabile T ^1. Solo una select sottoinsieme MHC-ristretto di cellule DP diventerà singolo positivi (SP) timociti CD4 o CD8, migrare verso il midollo del timo, e differenziarsi in cellule funzionalmente competenti T maturi, un evento che si riferisce alla selezione come positivo ^{2 6.} Al contrario, cloni di timociti auto-reattivi sottoposti a selezione negativa e vengono rimossi tramite apoptosi, convertito in cellule T regolatorie per l'auto-tolleranza, o deviato verso linfociti intraepiteliali per scopi che non sono ancora chiare ^3,7-10.

Nel timo, cellule stromali del timo formano un microambiente unico che fornisce segnali per questi diversi destini di sviluppo delle cellule T ^5,11,12. Cellule stromali del timo sono composti da cellule epiteliali timiche (TEC) - tra cui TEC corticali (CTEC) e TEC midollari (mTECs), cellule dendritiche, macrofagi, fibroblasti, cellule endoteliali, periciti derivati ​​dalla cresta neurale e di altre cellule mesenchimali ^13-15. Tra questi, TEC sono cruciali nelle varie fasi di sviluppo delle cellule T ^1,2,16,17. Tuttavia, la mancanza di un modo affidabile per isolare TEC ha impedito una comprensione globale delle loro funzioni ^16. In particolare, CTEC, che formano una rete tridimensionale progenitori nella corteccia circostante, sono essenziali per la selezione positiva ^13,18,19, per ragioni che non sono ancora chiare. Studi precedenti fornito indizi utili a capire l'eterogeneità e il ruolo di TEC, per lo più basandosi su strumenti morfologici e istologici ¹³ . Recentemente i ruoli unici di sottoinsiemi TEC sono state affrontate con approcci genetici in modelli murini ^12,20. Un modo affidabile e riproducibile per isolare TEC è fondamentale per raggiungere la caratterizzazione imparziale di sottoinsiemi TEC, valutazione quantitativa e qualitativa delle funzioni TEC, e chiarimento dei meccanismi come CTEC supportano la selezione positiva.

A causa della rarità della TEC in timo e le interazioni strette formano nell'organo intatto, l'isolamento di TEC è stato impegnativo. Il protocollo qui descritto è basato sulle scoperte precedenti, attualmente reagenti disponibili, le tecniche e la conoscenza della struttura del timo e della composizione stromale. Quasi due decenni fa, sono stati segnalati diverse procedure di disaggregare i tessuti timo ^21-27, in cui i diversi enzimi sono stati usati durante la digestione, tra cui tripsina, Collagenase e dispasi. Grigio et al. comparano questi enzimi nella loro precedure ^28, e ha registrato un miglioramento method una digestione più fasi di cocktail di enzimi ²⁹ che si sono resi ampiamente utilizzato ^20,30. Tuttavia, questo metodo richiede un lungo tempo di preparazione e mineralizzazione complessi e risultati in variabile finale numero di cellule e proporzioni di TEC anche nella stessa coorte murino ^29,30. Diversi anni fa, Liberase grado di ricerca enzima, contenenti altamente purificato Collagenase e proteasi neutra cominciò ad essere utilizzato nel tessuto del timo dissociazione ^30. Qui, descriviamo un protocollo basato digestione Liberase, con procedure di separazione meccanica ottimizzate, che produce un elevato numero di TEC vitali dai tessuti del mouse timo. .

Per arricchire cellule stromali dissociate, studi precedenti hanno utilizzato sia gradienti di densità o di separazione tallone magnetica ^21,29. Tuttavia, entrambi i metodi causano grave perdita di alcune popolazioni di cellule stromali del timo, in particolare la popolazione di CTEC ^29. Eliminazione citotossici e tecniche di panning ^{31,32 sono stati ampiamente utilizzati per esaurimento o separazione dei linfociti nel campo immunologica 12,31. Dopo il confronto di queste tecniche, abbiamo stabilito il protocollo panning attuale per l'arricchimento della TEC. La condizione delicata durante la procedura di arricchimento porta a meno morte cellulare e imparziale e maggiore recupero TEC.}

La sospensione di cellule isolate timo descritto nella Sezione 3 può essere applicato direttamente alle analisi citofluorimetrica per l'identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi TEC e cellule dendritiche. Sezione 4 descrive un modo semplice e utile per identificare sottoinsiemi TEC utilizzando il flusso multiparametrica citometro. Per gli esperimenti che cercano di ottenere CTEC purificate o mTECs, TEC arricchimento e cell sorting procedure può essere trovato nella sezione 5 e 6.

Protocollo

In questo studio, adulto - sono stati utilizzati (6 8 settimane) femmina C57Bl / 6 topi. I topi sono stati acquistati dal National Cancer Institute e mantenuti in particolari condizioni di libero patogeni. L'Università del Minnesota Istituzionale Cura e uso Comitato degli animali (IACUC) ha approvato tutti sperimentazione animale.

1 Preparazione degli strumenti e tamponi

1. Preparare la soluzione enzimatica (media RPMI1640 con il 0,05% [w / v] di Liberase TH e 100 U / ml di DNasi I), tampone ricchi di albumina (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -free] con 0,5% di siero bovino albumina e 2 mM acido Etilendiammina tetraacetico [EDTA]), tampone di FACS (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -free] siero fetale bovino 1% contenente [FBS] e il 0,02% NaN _3), FACS ordinamento tampone (PBS 1X [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -free] contenente il 2% FBS), e media RP10 (media RPMI-1640 fornito con 10% FBS).
2. Preparare 10 piatti panning. Preparare la soluzione di rivestimento 40 ml (0,01 mg / ml Gavena contro Rat-IgG in 0.1 M _NaHCO3 Buffer), e aggiungere 4 ml di soluzione di rivestimento in ciascuna 100 x 15 mm piastra, turbolenza e incubare a 4 ° CO / N. Eliminare la soluzione di anticorpi e lavare la piastra con 5 ml di PBS 1x per 2 volte, agitare vigorosamente tra risciacqui. Conservare le piastre preparate a 4 ° C.

2 Raccolta di Timo Tissue

1. Euthanize del mouse in una camera di CO _2. Mettere l'animale sulla schiena su una stuoia di dissezione, appuntare i piedi sul tappetino e bagnare la pelliccia a spruzzo con il 70% di etanolo.
2. Eseguire un'incisione mediana attraverso la pelle, partendo da sopra l'apertura uretrale dritto fino alla mascella inferiore con le forbici ed estendere l'incisione verso il basso per le ginocchia su entrambi i lati. L'incisione sembra un testa in giù "Y". Tirare la pelle flaccida indietro sui lati, e il pin al tappeto dissezione.
3. Forare la membrana dalla xifoide, tagliare le costole su entrambi i lati fino a circa la clavicola, quindi sollevare le costole conpinza e il pin al tappeto dissezione. Il timo è appena sotto le costole, e si presenta come due lobi bianchi sottili sovrapposti cuore (Figura 1). Tessuto connettivo che circonda Scollegare il timo, tirare delicatamente e rimuovere la coppia di lobi del timo con pinze dentellate curve. Lobi Luogo timo in una piastra da 6 pozzetti contenenti 5 ml di RPMI-1640.

3 Preparazione di cellule stromali timica

1. Tagliare qualsiasi tessuto adiposo e connettivo circostante e trasferire i lobi del timo ad un nuovo pozzo della piastra 6 pozzetti contenenti 5 ml di fresco preparano soluzione enzimatica. Fare piccole incisioni nei lobi del timo con le forbici sottili, e incubare la piastra a 37 ° C per 20 min.
2. Pipettare delicatamente digerire il tessuto del timo su e giù 2 - 3 volte con 5 ml pipetta per la dissociazione dei tessuti. Raccogliere il surnatante in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di tampone ricchi di albumina freddo per neutralizzare gli enzimi. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio. Aggiungere 2.5soluzione enzimatica ml al tessuto rimanente e incubare la piastra a 37 ° C per 15 min.
3. Eseguire agitazione meccanica con una siringa da 3 ml e ago da 18 G per rompere gli aggregati. Pool surnatante nel tubo di raccolta. Aggiungere 2,5 ml della soluzione enzimatica al tessuto rimanente e incubare la piastra a 37 ° C per 15 min.
4. Ripetere agitazione meccanica con una siringa da 3 ml e un ago da 25 G, e incubare la piastra supplementare di 5 - 10 min.
5. Dopo aver completato la digestione, piscina il surnatante nel tubo di raccolta. Centrifugare la provetta di prelievo a 400 xg, a 4 ° C per 8 minuti per raccogliere le cellule. Aspirare il liquido e sospendere le cellule pellet in 10 ml di tampone ricchi di albumina e filtrare il campione attraverso maglie di mm 100. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi eseguire il flusso cytometic analisi (sezione 4) o TEC arricchimento (sezione 5).

4 Identificazione delle TEC da Citometria a flusso

1. Preparare le cellule ad una concentrazione finale di 4 x 10 ⁶ cellule per 100 microlitri di buffer di FACS per la colorazione in una piastra di prova ben a fondo rotondo da 96 e tenere la piastra su ghiaccio. Aggiungere 20 microlitri soluzione di blocco Fc (anti-CD16 / CD32 anticorpo a 10 mg / ml in tampone per FACS) alle cellule e incubare le cellule per 10 minuti in ghiaccio. Gira la piastra a 400 xg, a 4 ° C per 3 min. Eliminare il liquido dai pozzi muovendo la faccia piastra giù in un lavandino.
2. Sospendere le cellule pellet in 100 ml di cocktail di anticorpi (anti-CD45, -EpCAM, classe -MHC II, e -Ly51 anticorpi, e la UEA-1 lectina marcato con fluorocromi diversi a produttori raccomandati o testato concentrazioni ottimali di ciascun anticorpo in tampone FACS ), e incubare le cellule in ghiaccio per 20 minuti al buio. Per compensazione, macchiare 1 x 10 ⁶ cellule con ogni singolo fluorocromo.
3. Aggiungere 100 ml di tampone FACS a ciascun bene e far girare la piastra a 400 xg, a 4 ° C per 3 min. Ripetere una fase di lavaggiotempo, e poi risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer FACS. Trasferire le cellule di un fondo rotondo tubo FACS 12 x 15 mm riempita con 300 ml FACS buffer. Acquisire campioni sul citofluorimetro e analizzare i dati utilizzando il software di analisi FACS. Strategia di gating TEC è mostrato nella Figura 2.

5. Arricchimento della TEC da Panoramica

1. Centrifugare le cellule del timo (preparati nella Sezione 3) a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. Aspirare il liquido e sospendere le cellule pellet nel tampone FACS ordinamento ad una concentrazione di 2 x 10 ⁸ cellule per ml in una provetta conica da 15 ml o 50 ml. Aggiungere anticorpo anti-CD90.2 (clone H12-30) (o anti-CD45) ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml di sospensione cellulare e incubare le cellule delicatamente su un agitatore rotante a 4 ° C per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare con un 5 - 10 volte il volume di RP10 medie e centrifugare la provetta a 400 xg, a 4 ° C per 5 min.
2. Aspirare il liquido e risospendere le cellule in pelletMezzo RP10 ad una concentrazione di 1 x 10 ⁷ per ml. Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare per ogni piastra rivestita panning (preparata al punto 1.3), turbolenza e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Agitare vigorosamente; trasferire il surnatante in una provetta conica. Sciacquare la piastra due volte utilizzando medie RP10 e piscina surnatanti nel tubo di raccolta.
3. Centrifugare la provetta di raccolta a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. Aspirare il liquido e risospendere le cellule pellet in 5 ml di mezzo RP10. Aggiungere la sospensione cellulare di una nuova piastra panning, agitare ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule lavare il piatto e piscina in un tubo conico. Una volta TEC sono arricchiti, centrifugare le cellule a 400 xg, a 4 ° C per 5 minuti e sospendere le cellule in 5 ml FACS buffer di smistamento.

6. Purificazione di TEC di classificare cellulare

1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare sospensione cellulare ad una concentrazione di 4 x 10 ⁷ cellule in tampone FACS ordinamento. Aggiungi anticorpi desCribed nella Sezione 4.4 nella soluzione di cellule e incubare le cellule delicatamente su un agitatore rotante a 4 ° C per 30 min. Dopo la colorazione, lavare e sospendere le cellule ad una concentrazione di 10 x 10 ⁶ cellule per ml di tampone FACS ordinamento.
2. Ordina sottoinsiemi TEC attraverso un ugello 100 micron utilizzando la fluorescenza attivato l'ordinamento delle cellule. Cella ordine sono raccolti in 30% (v / v) di FBS in RPMI-1640). Una volta che l'ordinamento delle cellule è fatto, le cellule centrifugare a 400 xg, a 4 ° C per 5 minuti e prepararsi per l'analisi a valle.

Risultati

Usando questo protocollo, un organo del timo è stato rimosso da un topo adulto (sezione 2) e una sospensione di cellule del timo è stata preparata come descritto nella Sezione 3 La sospensione cellulare ottenuta consisteva di timociti, cellule stromali ematopoietiche derivate da cellule stromali e non-ematopoietiche. CD45 è una ematopoietiche pan-marcatore espresso su entrambi i timociti e cellule stromali ematopoietiche come i macrofagi e le cellule dendritiche. Al contrario, TEC non sono di origine emopoietica e non e...

Discussione

Nel protocollo, punti critici sono la preparazione di cellule stromali del timo (sezione 3) e l'arricchimento di TEC (sezione 4). Si raccomanda vivamente che la soluzione enzimatica fresca viene preparata ogni volta e il tessuto viene trattato il più presto possibile. Per thymi studiata, ottimizzando il volume della soluzione enzimatica è richiesta a seconda del numero di thymi. Se eventuali residui di tessuto viene lasciato dopo l'elaborazione, aggiungendo più soluzione enzimatica e l'estensione del tempo d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-topo EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-topo MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-topo Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Citometro a flusso	BD Biosciences	LSRFortessa
Selezionatrice di celle a flusso	BD Biosciences	Provette FACSAria
FACS	BD Biosciences	352052
Software di analisi per citometria a flusso	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varia in base al fluorocromo e YY varia in base alle dimensioni della fiala.