Articolo metodologico

Misure comportamentali e locomotore Utilizzo di un campo aperto Sistema di Monitoraggio Attività per le Malattie muscolo scheletrico

DOI:

10.3791/51785

⸱

29 settembre 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genetic Medicine Research, Children's National Medical Center, 2Department of Integrative Systems Biology, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

In questo articolo

Sommario

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Aprire i livelli di attività di campo sono utilizzati per valutare i livelli di attività locomotive e comportamentali. Questo protocollo fornisce un ben progettato, protocollo standardizzato da utilizzare in studi preclinici per le malattie neuromuscolari.

Abstract

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Il sistema di monitoraggio delle attività in campo aperto valuta completo motorio e comportamentale livelli di attività dei topi. Si tratta di uno strumento utile per la valutazione di impairment locomotiva in modelli animali di malattie neuromuscolari e l'efficacia di farmaci terapeutici che possono migliorare la funzione locomozione e / o muscolari. La misurazione dell'attività campo aperto fornisce una misura diversa dalla forza muscolare, che è comunemente valutata mediante misurazioni della forza di presa. Si può anche mostrare come i farmaci possono influenzare altri sistemi del corpo, così quando viene utilizzato con misure di outcome supplementari. Inoltre, misure come la distanza totale percorsa rispecchiano il test del cammino 6 minuti, una misura di esito sperimentazione clinica. Tuttavia, l'attività di monitoraggio in campo aperto è anche associata a sfide significative: in campo aperto misure di attività variano in base al ceppo degli animali, l'età, il sesso, e il ritmo circadiano. Inoltre, la temperatura ambiente, umidità, illuminazione, rumore, e persino odori possono influenzare i risultati di valutazione. Nel complesso, questo manuscript offre una SOP un'attività campo aperto ben collaudato e standardizzato per studi preclinici in modelli animali di malattie neuromuscolari. Forniamo una discussione di importanti considerazioni, i risultati tipici, analisi dei dati, e dettaglio i punti di forza e di debolezza delle prove in campo aperto. Inoltre, mettiamo a disposizione le raccomandazioni per la progettazione ottimale di studio quando si utilizza l'attività in campo aperto in uno studio preclinico.

Introduzione

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I modelli animali sono stati utili per la conoscenza dei meccanismi della malattia, ma la loro utilità nel predire l'efficacia del trattamento negli studi clinici sono state spesso contestate 1-3. Numerosi "promettenti" studi preclinici sono pubblicati ogni anno; tuttavia, ben pochi degli interventi proposti mostrano risultati positivi quando si trasferì a sperimentazione clinica. Queste discrepanze sono spesso attribuiti a bias di pubblicazione, le conclusioni eccessivamente ottimistiche, e mal concepite e realizzate in studi pre-clinici che portano a risultati riproducibili 1-3.

Con gli attuali progressi nello sviluppo di farmaci per le malattie neuromuscolari, vi è una crescente necessità di studi preclinici ben progettate. In particolare, vi è la necessità di metodologie rigorose che possono essere eseguite in maniera standardizzata e accecato, con convalidati, riproducibili, e le misure di outcome traducibili. Come membro del muscolo congenita Consorzio Malattia, conil desiderio di condurre più rigorosi studi preclinici, condividiamo qui la nostra Procedura Operativa Standard (SOP) per Open campo di attività. Questa POS è stato precedentemente convalidato 4 e pubblicato come parte di SOP di TREAT-NMD per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) modelli animali 5. Abbiamo utilizzato questa metodologia di fenotipo e testare l'efficacia terapeutica di numerosi farmaci in una varietà di modelli animali di malattie neuromuscolari, tra cui-2J dy / J (Dy2J) topi LAMA2, il modello animale per la distrofia muscolare congenita (CMD) 6,7 . A sua volta, questo articolo è tratto dal nostro precedentemente pubblicati TREAT-NMD SOP 5.

Il sistema di monitoraggio delle attività in campo aperto valuta completo locomotore e livelli di attività comportamentali dei topi, che possono essere correlati con funzione di locomotiva. Il test è anche ampiamente utilizzato per valutare l'ansia come e comportamenti esplorativi 8-10. In particolare, il campo aperto è uno strumento utile per assessing compromissione locomotiva in modelli animali di malattie neuromuscolari 11,12 e l'efficacia di farmaci terapeutici che possono migliorare la locomozione e / o il motore funzioni 6,7,13,14. La valutazione di attività in campo aperto fornisce una misura diversa da quella forza muscolare, che è comunemente misurata con forza di presa, e mostra come i farmaci possono influenzare altri sistemi del corpo (cioè il sistema nervoso centrale) e 5. Inoltre, la misura dell'attività campo aperto, la distanza totale percorsa, rispecchia il test del cammino di 6 minuti, una misura di outcome studio clinico, che si concentra sulle prestazioni esercizio submassimale e qualità della vita 15,16. Nel complesso questo rende l'attività di campo aperto testare un atto benefico risultato secondario o ausiliario da utilizzare negli studi preclinici. Tuttavia, il sistema di monitoraggio delle attività in campo aperto ha anche notevoli sfide ad esso associati. Il test è comportamentale e può essere molto variabile, in quanto è influenzato da una moltitudine di esternofattori. Ad esempio, questo comportamento può essere influenzato da auto esplorativa (cioè cognizione), l'ansia, la malattia, il ritmo circadiano, fattori ambientali, background genetico, oltre alla potenza del motore 10. Di conseguenza è indispensabile per condurre questa misura in un modo standardizzato con un ambiente controllato. Il protocollo presentato qui descrive il nostro aperto SOP attività sul campo in dettaglio. Esso fornisce procedure passo-passo e ulteriore discussione di importanti considerazioni di controllare le condizioni ambientali e contribuire a ridurre la variabilità, risultati tipici, analisi dei dati e punti di forza del di valutazione e di debolezza in modo più dettagliato.

Protocollo

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NOTA: Aperto sistema di monitoraggio dell'attività campo utilizza un campo aperto camera di plexiglas con emettitori fotocellula e recettori equidistanti lungo il perimetro della camera (Figura 1). Questi emettitori fotocellule ed i recettori creano una griglia xy di raggi infrarossi invisibili. Quando un animale viene posto nella camera, si muove su, causando interruzioni di fascio. I sensori verticali sono presenti per valutare i livelli di attività verticali (cioè il comportamento di allevamento) e anche. L'analizzatore registra le informazioni pausa trave e rapidamente analizza. Il software calcola quindi più misure all'attività nel periodo di tempo predefinito. Tali misure comprendono: attività orizzontale (unità), di attività verticali (unità), la distanza totale percorsa (cm), tempo di movimento (sec), e tempo di riposo (sec) 5.

NOTA: In generale, la camera di prova deve essere a temperatura e umidità controllate, con illuminazione uniforme. Camere di prova devono essere equamente discontribuito per la stanza e non deve essere posto in luce diretta, angoli bui, o zone d'ombra. Tutti acclimatazione e di prova dello strumento devono essere eseguite alla stessa ora ogni giorno (ad esempio, al mattino) e dagli stessi individui. Questi individui dovrebbero essere accecati al gruppo di trattamento degli animali, e il genotipo quando possibile.

Il protocollo seguito è stato effettuato sotto la guida e l'approvazione dei Bambini Nazionale Medical Center IACUC.

1 Strumento acclimatazione

  1. Mettere i topi in sala prove nelle loro gabbie a casa per circa 10 minuti per ambientarsi. Lasciate la stanza durante il periodo di acclimatazione.
  2. Ritorna alla sala prove e accendere le camere di attività. Anche se i dati non vengono raccolti in questo momento, questo imitare ulteriormente l'ambiente di test.
  3. Rimuovere delicatamente ogni mouse dalla loro gabbia casa e subito metterli nelle camere di prova. Se l'attivitàcamera contiene un divisore centrale che divide la camera in quadranti (Figura 1), collocare un topo in ciascun quadrante vuoto.
  4. Una volta che tutti gli animali sono stati caricati nelle camere di prova, mettere il coperchio sulla parte superiore di ciascuna camera di saggio. Lasciate la stanza in questo periodo di acclimatazione.
  5. Dopo 60 minuti, tornare alla stanza. Togliere il coperchio da ciascuna camera di prova e tornare delicatamente ogni mouse alla sua rispettiva gabbia a casa.
  6. Pulire ciascuna camera con salviette disinfettanti e di carta. Assicurarsi che nessun sporco particelle vengono lasciati nella camera.
    NOTA: Se più sessioni vengono eseguiti ogni giorno, pulire accuratamente ogni camera di prova tra ogni sessione.
  7. Ripetere i passaggi 1-6 per 4 giorni consecutivi.
    NOTA: Eseguire acclimatazione una settimana prima della raccolta dei dati iniziali. Se gli animali vengono testati più volte nel corso di uno studio, solo effettuare acclimatazione prima del primo turno di prove per evitare assuefazione. Inoltre, assegnare in modo casuale gli animali ad una nuovabox ogni sessione. Traccia le assegnazioni box per tutta la durata dello studio.

2 Raccolta dati

  1. Mettere i topi in sala prove nelle loro gabbie di casa per 10-30 minuti per ambientarsi. Lasciate la stanza durante questo tempo.
  2. A seguito del 10-30 min, tornare alla sala prove. Accendere le camere di attività e di aprire il software allegato sul computer collegato alle camere. Se la camera contiene un divisore quadrante, inserire la partizione in questo momento.
    NOTA: Se la camera di prova contiene un divisore quadrante, due animali possono essere collocati nella camera di prova durante la raccolta dei dati. Un animale può essere collocato nel quadrante frontale sinistro e uno nel quadrante posteriore destro (Figura 1).
    NOTA: non collocare gli animali in tutti e quattro i quadranti durante la raccolta dei dati o nella stessa riga o colonna. Posizionamento degli animali in questi orientamenti si interferisce con la griglia xy di raggi infrarossi e il movimento degli animali saràimpreciso misurata.
  3. Configurare il software per computer per eseguire un controllo prebeam. Questa configurazione consentirà di eseguire un controllo pre-beam seguendo il setup sperimentale e prima dell'inserimento degli animali nelle camere di prova (vedi sotto).
    NOTA: Quando si esegue il controllo prebeam, il software valuta la funzione dei raggi infrarossi xy. Ad esempio, può determinare se gli emettitori fotocellule e recettori sono bloccati e in grado di rilevare in modo appropriato il movimento all'interno della camera.
  4. Impostare i parametri di raccolta dei dati primari nel software computer per raccogliere sei 10 min blocchi di dati (ad esempio raccogliere dati per un totale di 60 minuti), e quindi immettere i numeri appropriati data, nome del file, e ID Mouse.
  5. Una volta che tutti i parametri sono impostati, eseguire il controllo prebeam. Se una camera non passa il prebeam controllo è più probabile a causa della scarsa allineamento del divisore centro del quadrante o camera di prova. Se questo accade, riallineare il divi centro del quadranteder e camera di prova fino a quando i sensori non sono più bloccati e il sistema stabilisce che la camera di prova è pronta. Se questo non risolve il problema, fare riferimento al manuale dello strumento.
  6. Quando tutte le camere di prova sono pronti, rimuovere delicatamente il mouse dalla sua gabbia casa e subito lui o lei collocare nella camera di prova. Notare l'ID del mouse e accertarsi che corrisponda a quello inserito nel computer.
  7. Una volta che tutti gli animali siano adeguatamente caricati nelle camere di prova, mettere il coperchio sulla parte superiore di ciascuna camera. Quindi selezionare il comando appropriato nel software per computer per iniziare la raccolta dei dati. A questo punto, il software analizzatore e il computer si avvierà livelli di attività di registrazione secondo i parametri di raccolta dei dati.
  8. Lasciare la camera di prova per il resto del periodo di prova.
  9. Al termine del periodo di prova (ovvero 60 minuti più tardi), ritorno immediato alla sala prove. Salvare i dati, e poi tornare ogni animale per il loro rispettogabbia a casa ive.
  10. Pulire tutte le unità con un disinfettante e tovaglioli di carta.
    NOTA: Se più sessioni vengono eseguiti ogni giorno, pulire accuratamente ogni camera di prova tra ogni sessione.
  11. Esportare i dati in un foglio di calcolo e quindi uscire dal programma software.
  12. Controllare i dati per assicurarsi che sono stati registrati. Se i dati non sono stati registrati, o gli animali dormivano tutta la totalità del periodo di raccolta dei dati, eseguire un giorno in più di raccolta dei dati.
    NOTA: Un animale è considerato "dormiente", se non si muove per tutta la durata del test di 60 min.
  13. Ripetere i passaggi 2,1-2,12 per 4 giorni consecutivi.
    NOTA: Se gli animali vengono esaminati a vari intervalli di tempo per tutta la durata di uno studio, non eseguire misure di attività in campo aperto più di una volta al mese per evitare assuefazione. Inoltre, assegnare in modo casuale gli animali ad una nuova scatola di ogni sessione. Traccia le assegnazioni box per tutta la durata dello studio.

Analisi dei dati 3.

  1. Calcolare l'attività media orizzontale (unità), attività verticali (unità), la distanza totale percorsa (cm), tempo di movimento (sec), e il tempo di riposo (sec) per mouse e di gruppo. Il software calcola e riporta l'attività totale orizzontale (unità), l'attività verticale (unità), la distanza totale percorsa (cm), tempo di movimento (sec), e il tempo di riposo (sec) durante il periodo di raccolta dei dati (ad esempio 60 min) per ogni mouse. Calcolare la media per ciascuno dei summenzionati parametri dei 4 giorni di raccolta dati.
  2. Prima di eseguire eventuali analisi statistiche, valutare la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro-Wilk, e verificare la presenza di valori anomali utilizzando il test di Grubb. Rimuovere eventuali valori anomali significativi (p <0.05).
  3. Per i dati normalmente distribuiti, confrontare le medie tra gruppi utilizzando un t-test campione indipendente o un modo un ANOVA e test post-hoc con p-valori corretti per confronti multipli dipendonozione del numero totale di gruppi di trattamento.
  4. Per i dati non normalmente distribuiti, confrontare i valori medi tra i gruppi utilizzando sia il test di Wilcoxon, o un test di prova e della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis con conseguente p-valori corretti per confronti multipli a seconda del numero totale di gruppi di trattamento.

Risultati

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Quando si analizzano i dati relativi all'attività campo aperto, ci concentriamo su alcuni selezionati misurazioni che forniscono una valutazione del livello di attività che riflettono generalmente la funzione locomotiva. Questi parametri includono: attività orizzontale, l'attività verticale, tempo di movimento, tempo di riposo, e la distanza totale percorsa. In generale, gli animali con la funzione muscolare ridotta saranno meno attivi e hanno l'attività ambulatoriale minore. Questo è generalmente associata a ridotta attività orizzontale, l'attività verticale, distanza percorsa e il tempo totale di movimento, e ha aumentato il tempo di riposo 5,6,12,17. Al contrario, gli animali con la funzione muscolare intatta o quelli trattati con terapie che riducono la progressione del deterioramento della patologia muscolo è più probabile per visualizzare maggiori livelli di attività 6,7,14,17.

Per mostrare un esempio dei risultati tipici ottenuti con questo protocollo in modelli animali di malattie neuromuscolari, abbiamo fornito i dati da uno studio longitudinale we già condotta nel Dy2J distrofia muscolare congenita (CMD) modello animale 6. In breve, il modello Dy2J contiene una forma troncata del gene LAMA2 che si traduce in una paralisi degli arti posteriori, demielinizzazione, e le modifiche muscolo scheletrico distrofici. L'impatto di questa patologia muscolo su livelli di attività si osserva in questi topi. Ad esempio, i topi Dy2J nello studio tendevano a mostrare bassi livelli di attività orizzontali, e meno distanza percorsa, rispetto alla loro età e BL / 6 controlli wild-type per sesso per tutta la durata dello studio (Figura 2); tuttavia, queste differenze non sono sempre significativi. La mancanza di significato è più probabile a causa della piccola dimensione del campione, e l'alta variabilità intra-gruppo nei dati BL6. Variazione è tipica dei dati dell'attività campo aperto; tuttavia, questi dati in particolare la mancanza di potenza sufficiente per determinare se questi gruppi sono statisticamente diversi tra loro. Tipicamente un n = 10-12 dovrebbero essere utilizzati per rilevare statistically differenze significative 5,17. Ad esempio, quando si utilizza un campione più ampio, come è stato fatto nello studio SJL (vedere la seconda barra BL6 nelle figure 3B, 3D e 3E) possono essere osservate differenze significative tra i gruppi. Gli animali Dy2J anche mostrato una completa perdita di livelli di attività verticali, che rispecchiava la loro paralisi degli arti posteriori, e, a sua volta, l'incapacità di posteriore (Figura 2B) 6. Infine, è importante notare le differenze di sesso nei livelli di attività. Ad esempio, le femmine tendono ad essere più attivi rispetto ai maschi, mostrando elevati livelli di attività orizzontali, l'attività verticale, e la distanza totale percorsa (Figura 2); tuttavia queste differenze non erano statisticamente significative.

Abbiamo anche fornito dati provenienti da diversi studi precedenti condotti in altri modelli animali di malattie neuromuscolari, nonché di evidenziare diversi fattori aggiuntivi che influenzano attolivelli ivity (Figura 3). Ad esempio, i livelli di attività variano a seconda del background genetico 10. BL10 wild type topi mostrano una maggiore attività orizzontale, l'attività verticale, e la distanza totale percorsa rispetto a età e genere abbinato BL6 topi wild type (Figura 3). Questa è un'osservazione importante notare, come l'utilizzo dei ceppi di controllo non corretti in uno studio in grado di rendere i dati inutilizzabili. In secondo luogo, i livelli di attività variano a seconda del modello di malattia e fenotipo (Figura 3). Ad esempio, il mouse SJL, il modello animale di distrofia muscolare dei cingoli degli arti-2B (LGMD-2B), mostra il più basso livello di attività orizzontali e la distanza totale percorsa, seguita dal mouse Dy2J e il topo mdx, il modello animale di Duchenne distrofia muscolare (Figure 3A, 3C). Tuttavia, i topi Dy2J, a causa della loro paralisi degli arti posteriori, mostrano il più basso livello di attività verticale (Figura 3B). E 'anche importante notare che il livello elevato diattività nel fenotipo mdx è probabilmente attribuibile alla maggiore livello di attività del fondo ceppo BL10. Infine, questo dato sottolinea l'importanza di animali Età / malattia patologia al momento della prova. Ad esempio, a 30 settimane di età, senza differenze possono essere rilevate nei livelli di attività tra topi mdx e la loro età e sesso abbinati BL10 controlli wild type (Figura 3). Tuttavia, a 6 settimane di età, intorno al picco fase necrotica nel modello di topo mdx, topi mdx mostrano una significativa diminuzione dell'attività verticale, orizzontale e l'attività. Una diminuzione si osserva anche nella distanza totale percorsa, ma questa differenza non è significativa (Figura 3) 4.

Schema dell'apparecchio per elettroforesi; Separazione del DNA; serbatoi di gel verticali; attrezzatura di laboratorio.
Figura 1. Aprire apparati di attività di campo. Two campo aperto apparati con centro quadradivisori nt, e top. Se il centro rimovibile divisori quadrante sono presenti, gli animali devono essere posizionati solo nella parte anteriore sinistra (1, 3) e posteriore camere destre (2, 4) di ogni casella durante i test per ottenere le letture valide.

Grafico dell'attività del mouse che confronta il movimento orizzontale e verticale in maschi e femmine; attività per settimane.
Figura 2. dati di attività in campo aperto. Dati tipici di attività in campo aperto per Dy2J (linea grigia, n = 3) e il ceppo di controllo BL6 per età e per sesso (linea nera, n = 3) topi a 14, 19, 23, 25, 30 settimane di età (A - F) a) Attività orizzontale (unità arbitrarie) maschi, B) attività orizzontale (unità arbitrarie) femmine, C) di attività verticale (unità arbitrarie) maschi, D) di attività verticale (unità arbitrarie) femmine. E) Totale trave distanzaled (cm) maschi, E) distanza totale percorsa (cm) femmine. I dati sono stati raccolti oltre 4 giorni consecutivi e media per mouse e di gruppo. Gli stessi topi sono stati testati in ogni punto di tempo. I dati rappresentano media ± SEM. I dati precedentemente pubblicato 6. Dy2J e BL6 topi sono stati confrontati con un campione di T-test indipendente ad ogni time-point. Un p-value <0.05 è stato considerato significativo. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

Grafici a barre di confronto delle attività per BL10, Mdx, BL6, Dy2J, SJL; Le metriche includono orizzontale, verticale.
Figura 3 Aprire campo dati di attività più ceppi di dati comportamentali tipiche attività da BL10 maschio (6 settimane di età, n = 8; 25-30 settimane di età, n = 10)., Mdx (6 settimane di età, n = 9; 25-30 settimane di età, n = 15), BL6 (gruppo di controllo per i topi Dy2J, n = 3; gruppo di controllo di topi SJL, n = 13), Dy2J (n = 3), e SJL (n = 13) topi a vaficiente età i dati da BL10 e topi mdx a 6 e 25-30 settimane di età. A) attività orizzontale (unità arbitrarie), B) Attività orizzontale (unità arbitrarie) i dati da BL6, Dy2J, e topi SJL a 25-30 settimane di età, C) l'attività verticale (unità arbitrarie) i dati da BL10 e topi mdx a 6 e 25-30 settimane di età, D) l'attività verticale (unità arbitrarie) dati provenienti da topi BL6, Dy2J, e SJL a 25-30 settimane di età , E) Distanza totale percorsa (cm) i dati da BL10 e topi mdx a 6 e 25-30 settimane di età, e F) Distanza totale percorsa (cm) dati provenienti da topi BL6, Dy2J, e SJL a 25-30 settimane di età . Dy2J, modello animale per CMD con laminina α2 gene mutazione sullo sfondo BL6; SJL, modello animale di distrofia muscolare dei cingoli degli arti-2B (LGMD-2B); mdx, modello animale per la DMD sullo sfondo BL10. Non vi è alcun controllo SJL dysferlin-sufficiente. I dati sono media ± SEM. B, C, e D contengono dati precedentemente pubblicapannone 6,17. I dati non sono distribuiti normalmente; Pertanto, i dati sono stati confrontati con un Wilcoxon somme rango di prova. Un p-value di p <0.05 è stato considerato significativo. I seguenti confronti sono stati effettuati per ogni parametro: a) BL10 e topi mdx a 6 settimane di età, p <0.05; b) BL10 e topi mdx a 25-30 settimane di età, non significativo; c) Dy2J e BL6 abbinati topi ceppo di controllo a 25-30 settimane di età, p <0.05; d) SJL e BL6 abbinati ceppo di controllo a 25-30 settimane di età, p <0,001; e) BL10 topi a 25-30 settimane di età e BL6 (gruppo di controllo per Dy2J topi) topi a 25 settimane di età, p <0.01; f) BL10 a 25-30 settimane di età e BL6 (gruppo di controllo per SJL topi) a 25-30 settimane di età, p <0,001.

Discussione

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La misurazione di attività in campo aperto è un test in vivo che può essere utile per valutare la progressione della malattia e l'efficacia dei farmaci in modelli animali di malattie neuromuscolari 6,7,11-14. Come mostrato in figura 2, si fornisce una valutazione dei livelli di attività che rispecchiano funzione locomotiva. Questa è una misura diversa da quella forza muscolare, che lo rende una misura ideale outcome secondario o ausiliario ad esibirsi in uno studio preclinico di droga. Inoltre, è un clinicamente rilevante 15, misura non invasiva, che può essere eseguita più volte per tutta la durata dello studio. Tuttavia, l'attività comportamentale e locomotiva è influenzata anche da altri fattori, come pure (cioè la manipolazione sperimentatore, le condizioni ambientali, e cognizione), la creazione di variazione dei dati di attività in campo aperto. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire un protocollo ben collaudato e standardizzato che riduce la variazione e permette risultati di essere compared su più laboratori, nella speranza di migliorare la traduzione all'interno del nostro campo.

Uno dei principali svantaggi di questa misura è che è altamente variabile e influenzato da numerosi fattori esterni. Tuttavia, abbiamo preso questo in considerazione durante lo sviluppo del protocollo. Abbiamo valutato una serie di protocolli di sperimentazione che vanno in durata da 1-5 giorni di raccolta dei dati. Alla fine, abbiamo stabilito che l'esecuzione di strumento acclimatazione prima della raccolta dei dati per familiarizzare gli animali con l'ambiente camera di prova e performanti 4 giorni di raccolta dei dati ha ridotto significativamente la quantità di variazione dei dati di outcome 5. Questo protocollo è stato originariamente progettato per valutare i livelli comportamentali e locomotiva di attività nel modello di topo mdx; Tuttavia, questo protocollo è stato recentemente validato nel modello animale Dy2J pure 6. Si suggerisce che il protocollo essere standardizzato nel vostro laboratorio per ciascun modello animale prima di usarlo in uno studio preclinico.

Attività sul campo aperto varia in base al background genetico 17, 18-20 sesso, di 18 anni, e il ritmo circadiano 21. Ciò richiede di animali della stessa età, sesso e background genetico da valutare allo stesso tempo. Durante le fasi di pianificazione, un'attenta riflessione dovrebbe essere messo a decidere a quale età o età aperto campo di attività di livello saranno valutati. Ogni modello animale ha una sua progressione della malattia distinta e fenotipo locomotiva e comportamentale, che variano in gravità e da 6,15 anni (Figura 2 e Figura 3). Pertanto, è importante determinare punti di tempo clinicamente e patologicamente rilevanti per valutare le misure di attività in campo aperto. Il numero totale di animali necessari in ciascun gruppo di trattamento per rilevare differenze statisticamente significative varia a seconda del modello animale, l'età, il sesso e pure. Di conseguenza, i calcoli di dimensione del campione pertinenti dovrebbero essere eseguite durante le fasi di pianificazione per determine il numero totale di animali necessari in ciascun gruppo di trattamento per rilevare differenze statisticamente significative. Questi calcoli dovrebbero anche prendere in considerazione ulteriori misure di esito utilizzate nello studio (ad esempio, misure di forza di presa o istologica analisi). Sulla base dei nostri calcoli di potenza, di solito utilizziamo 10-12 animali per gruppo di trattamento. Inoltre, particolare attenzione deve essere rivolta a ciò che il controllo ceppo viene utilizzato nello studio. C'è una tendenza per i ceppi di controllo inadeguate per essere utilizzato in studi preclinici. Ad esempio, i topi BL6 sono spesso usati come un ceppo di controllo per topi mdx; Tuttavia, il topo mdx è su uno sfondo BL10. Come si vede nella figura 3, i topi BL10 sono molto più attivi rispetto ai topi BL6, che rendono impossibile il confronto dei dati mdx e BL6. Quando la conduzione di studi preclinici sui topi mdx, topi BL10 dovrebbero essere usati come ceppo di controllo. Inoltre, se uno studio è stato condotto con i topi Dy2J, topi BL6 devono essere utilizzati come il contrceppo olo.

Piccoli cambiamenti ambientali possono influenzare in modo significativo i livelli di attività. Questi includono l'illuminazione, la temperatura, l'umidità, l'odore, il rumore, e 4,15 l'attività umana. Pertanto, è molto importante che il test viene eseguito in una stanza a temperatura ed umidità controllata con illuminazione non diretta allo stesso tempo ogni giorno 5. Le camere di prova devono essere equamente distanziati in tutta la stanza e non posti sotto illuminazione diretta o in ombra o oscuri angoli 5. Gli animali devono essere assegnati in modo casuale a loro camere di prova ogni giorno per ridurre gli effetti delle diverse condizioni ambientali in tutta la stanza, e dovrebbero avere la possibilità di acclimatarsi alla sala prove per 10-30 min prima della raccolta dei dati. Assicurati di seguire l'assegnazione scatola di ogni animale per tutta la durata dello studio al fine di garantire che ogni influenza di scatola / ambiente è equamente distribuito tra i diversi gruppi di trattamento. Gli individui carico l'animals nelle camere di prova e la manipolazione degli animali per tutta la durata dello studio dovrebbero essere accecati al gruppo di trattamento, e il ceppo animale quando possibile. In molti casi i genotipi colpite sono notevolmente diverse da quelle dei relativi controlli e accecante non è possibile. Tuttavia, gli individui devono sempre essere accecati tra i gruppi trattati e non trattati. Inoltre, tutti gli individui dovrebbero lasciare la stanza durante la raccolta dei dati per ridurre il rumore e le distrazioni all'interno della stanza, e tutte le camere devono essere puliti con cura dopo ogni sessione di raccolta dati. Queste azioni saranno ridurre significativamente variazione dei dati. E 'importante notare che gli animali sono anche molto sensibili all'adattamento 15. Pertanto, si suggerisce che gli animali siano rimossi dalla camera di prova subito dopo l'60 min di raccolta dei dati ogni giorno e che i livelli di attività in campo aperto da valutare non più di una volta al mese.

La distanza totale percorsa e movimento totalemisure di tempo mento tendono ad essere campo aperto più sensibili misure di attività 5. Nel modello Dy2J, la misurazione dell'attività verticale tende ad essere la misura dell'attività campo aperto più sensibile (Figura 3); Tuttavia, può essere difficile per catturare misurazione dell'attività verticali accurati animali più piccoli. Ad esempio, è possibile che un animale più piccolo esporrà comportamento allevamento e il sensore non catturare causa dell'altezza del sensore verticale. Come risultato, si consiglia di animali di prova non più di 5 settimane di età. E 'anche possibile che un animale dormirà tutta la durata di una sessione di raccolta dati. Se questo è il caso, è opportuno aggiungere un ulteriore giorno di raccolta dei dati. Infine, povero allineamento del divisore quadrante o il blocco dei sensori all'interno della scatola può provocare dati inesatti pure. Pertanto, è molto importante effettuare un controllo preliminare sensore, prima del test, e rivedere tutti i dati successivi al termine delogni sessione di raccolta dati.

L'attenzione dovrebbe anche essere presa quando si analizzano i dati di attività in campo aperto. Aperto dati attività sul campo ha la tendenza ad essere normalmente non distribuiti e hanno valori anomali 4. Prima di eseguire eventuali analisi statistiche, i nostri biostatistici consiglio vivamente la verifica dei dati di normalità e di valori anomali. Se i dati non sono distribuiti normalmente, si dovrebbe considerare l'utilizzo di un test non parametrico quando si confrontano i mezzi. Inoltre, tutti i dati devono essere analizzati da un individuo cieco a ciò che i gruppi di trattamento sono.

Nel complesso, l'attività di misura in campo aperto ha importanti vantaggi: a) si tratta di una valutazione complessiva di entrambi locomotoria e l'attività comportamentale, che è forte, ma non sempre correlata con la funzione di locomotiva; b) si tratta di una misura facile da eseguire; c) non richiede la manipolazione degli animali durante la prova; d) è una misura non invasiva che può essere eseguita più di una volta per tutta la durata di una study; e) nessun addestramento speciale è necessario per eseguire il test; f) più gli animali possono essere testati in una sola volta; e g), si tratta di una misura di esito clinicamente rilevante 5,16. Tuttavia, quando si prova terapeutica, tenere presente che altri fattori possono influenzare il comportamento di un animale, e, a sua volta misure di attività in campo aperto. I farmaci possono avere SNC e o altri effetti a livello del corpo, e il comportamento può anche essere influenzato da un ambiente stressante. Di conseguenza, può essere difficile distinguere se i cambiamenti nei livelli di attività di locomotive o comportamentali sono legati a cambiamenti nella funzione muscolare, la forza muscolare, o sono il risultato di effetti collaterali del farmaco. Pertanto, ulteriori saggi funzionali, istologiche e molecolari o dovrebbero essere condotte pure. Questo protocollo standardizzato è stato anche utilizzato con successo in altre malattie muscolari 4,17; Tuttavia, come visibile in figura 3, gli studi pilota dovrebbero essere eseguiti inizialmente per valutare la sensibilità della misura nell'animalemodello.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa pubblicazione è finanziata attraverso Cure CMD, Francese Distrofia Muscolare (AFM), un assegno di ricerca traslazionale dalla Distrofia Muscolare, Il National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), il Dipartimento della Difesa ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) e una sovvenzione pilota da Parent Project Muscular Distrofia ( PPMD).

Questa carta è uno dei tanti in una serie di POS per metodologie utilizzate di routine nel campo malattia muscolare congenita. Esso riflette gli sforzi discussi e stabiliti da oltre 20 esperti nel campo della malattia muscolare congenita al recente muscolare congenita Disease Consortium Workshop, tenutosi nel mese di aprile 2013, Washington, DC

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Sistema di monitoraggio dell'attività in campo aperto VersaMax con camere di prova in acrilico e sensori degli assi X, Y, ZAccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USASistema di
monitoraggio dell'attività in campo aperto Fusion in pensione con camere di prova in acrilico e sensori degli assi X, Y, ZOmnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USASistema suggerito attualmente sul mercato
ComputerDell, Inc.
Materiali
Disinfettante ad ampio spettro Virkon-S (perossimonosolfato di potassio/cloruro di sodio)Pharmacal Research Laboratories, Inc.
Mice
B6. WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J)Jackson Lab000524
C57BL/6J (BL6)Jackson Lab000664
SJL/J (SJL)JacksonLab000686
C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx)Jackson Lab001801
C57BL/10ScSnJ (BL10)Jackson Lab000476

Riferimenti

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