Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.
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Articolo metodologico
Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una parte significativa di sviluppo post-embrionale nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, si svolge all'interno di un insieme di strutture sac-come chiamate dischi immaginali. Questi dischi danno luogo ad una elevata percentuale di strutture adulti che si trovano all'interno della mosca adulta. Qui si descrive un protocollo che è stato ottimizzato per recuperare questi dischi e li prepara per l'analisi con anticorpi, i giornalisti trascrizionali e trappole di proteine. Questa procedura è più adatto per tessuti sottili come dischi imaginali, ma può essere facilmente modificato per l'utilizzo con i tessuti più spessi come il cervello adulto e dell'ovaio larvale. Il protocollo scritto e video che accompagna guideranno il lettore / spettatore attraverso la dissezione di terza larve instar, la fissazione dei tessuti, e il trattamento di dischi immaginali con anticorpi. Il protocollo può essere utilizzato per analizzare i dischi immaginali dal più giovane primo e secondo instar larve pure. Il vantaggio di questo protocollo è che è relativamente breve e deve essereen ottimizzato per la conservazione di alta qualità del tessuto sezionato. Un altro vantaggio è che la procedura di fissazione che è impiegato funziona bene con il numero enorme di anticorpi che riconoscono le proteine di Drosophila. Nella nostra esperienza, vi è un numero molto piccolo di anticorpi sensibili che non funzionano bene con questa procedura. In queste situazioni, il rimedio sembra essere quello di utilizzare una fissazione cocktail alternativo, pur continuando a seguire le linee guida che ci siamo stabiliti per le fasi di dissezione ed incubazioni anticorpi.
Introduzione
Per più di un secolo il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato un sistema di premier per studiare lo sviluppo, il comportamento e la fisiologia. Sviluppo in volo può essere diviso in due grandi fasi: embrionali e post-embrionali con gran parte quest'ultimo che si svolgono all'interno monostrato epiteli chiamati dischi immaginali 1-3. Disegni di dischi immaginali sono stati pubblicati nel 1864 da August Weismann, come parte della sua vasta monografia sullo sviluppo degli insetti 1. Questi dischi iniziano il loro sviluppo durante l'embriogenesi, vengono modellato durante gli stadi larvali, ....
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Protocollo
1 Preparazione di larve
- Riempire una capsula di Petri 35 millimetri con tampone dissezione.
- Porre larve in piastra di Petri e permettere loro di nuotare in giro per alcuni minuti (step-autopulente).
- Trasferimento larve ad un pool di buffer di dissezione su un piatto dissezione a base di silicone. Questa piscina deve essere di un bordo della piastra. La piastra dissezione costituita da una soluzione di silicone che è stato versato e indurito in una piastra di Petri di vetro.
- Usando una pipetta pasteur-, posizionare un grande pool di buffer di dissezione nel centro del piatto dissezione.
- Utilizzando # 5 pinze, trasferi....
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Risultati
Il metodo descritto in precedenza in modo affidabile produce materiale di alta qualità per l'analisi con sonde in situ, giornalisti trascrizionali, trappole di proteine e anticorpi. In figura 1 mostriamo dischi eye-antenna, genitali, ala, haltere e gambe che vengono regolarmente recuperati con questo metodo. Questi dischi sono stati trattati con un fluoroforo falloidina coniugato, che si lega alla F-actina e quindi delinea ogni cella. Se il tessuto è stato fissato correttamente allora il solc.......
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Discussione
Anche se questa procedura è in gran parte concentrata sulla isolamento e successivo trattamento di dischi occhio-antenne, è suscettibile di essere utilizzato per isolare e analizzare l'ala, haltere, gamba e dischi genitali (Figura 4). L'unica modifica necessaria del protocollo per isolare questi dischi (in contrasto con il disco occhio-antenne) è il metodo della dissezione grossolana (sezione 2 del protocollo). La prima tappa (T1) coppia toracica si trova alla anteriore della larva e può essere .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Donald Pronto e Kevin Mosè per l'insegnamento JPK la procedura di dissezione disco immaginale originale. Ringraziamo anche Bonnie Weasner per il disco genitale in Figura 1B e il disco occhio in Figura 2A, Brandon Weasner per la figura 3, il Bloomington Drosophila Stock Center per le macchie Fly e la Developmental Studies Ibridoma Banca per gli anticorpi. CMS è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), il Frank W. Putnam Research Fellowship, e Robert Briggs Research Fellowship. JPK è supportata da una sovvenzione da parte....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomero Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG | Utilizzato per creare la base per la piastra di dissezione |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Utilizzare il coperchio per la piastra di dissezione |
| #5 Pinze da dissezione | Ted Pella | 525 | Le pinze devono essere mantenute molto affilate |
| 9 pozzetti di vetro per orologi | Vairous Fornitori | Utilizzato per la fissazione di complessi di dischi immaginali | |
| Fiaschetta di Erlenmeyer da 50 ml | Vari fornitori Piccola | ||
| barra di agitazione | Vari fornitori Abbastanza | piccolo da poter essere inserito nel pallone di Erlenmeyer | |
| Provette coniche da 50 ml | Vari fornitori Provette | ||
| per microfuga da 1,5 ml | Vari fornitori Trasparente | o scuro a seconda dell'applicazione | |
| Rack | per microfugaVari fornitori Rotatore | ||
| banco | Vari fornitori | 100 μ il volume non deve schizzare a bassa impostazione | |
| Paraformaldeide | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serve come fissativo |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma Chemical Co | S-3139 | Utilizzato per fare tamponi di dissezione e lavaggio |
| Sodio Fosfato di sodio bibasico | Sigma Chemical Co | 71636 | Usato per fare tamponi di dissezione e lavaggio |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Utilizzato nella soluzione fissativa |
| Periodo di sodio | Sigma Chemical Co | S-1878 | Utilizzato nella soluzione fissativa |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Utilizzato per perforare i dischi immaginali |
| Idrossido di sodio | EM Science | SX0593-3 | Utilizzato per sciogliere la paraformaldeide |
| 100% Siero di capra normale | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serve come soluzione bloccante |
| Anticorpi primari | Vari fornitori Diluire | in siero di capra al 10% come indicato dal produttore | |
| Anticorpi secondari | Vari fornitori Diluire | in siero di capra al 10% come indicato dal produttore | |
| Sonde molecolari | Vectashield | H-1000 | Previene lo sbiancamento dei campioni |
| Vetrini per microscopio | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Vetrini di copertura in vetro 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Vari fornitori | Impedisce ai vetrini di aderire alla base in silicone | |
| Pennello Panit 000 | Vari fornitori Utilizzare | per abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti sui campioni |
Riferimenti
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
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Ristampe e permessi
