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Articolo metodologico

Culturing Caenorhabditis elegans In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

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DOI:

10.3791/51796

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2 agosto 2014

 ,  ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In questo articolo

Sommario

C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle.

Abstract

In questo protocollo, presentiamo i materiali necessari, e la procedura per fare C modificati. Legans e assuefazione e della Riproduzione media (mCeHR). Inoltre, la procedura per l'esposizione e acclimatazione C. elegans cresciuti su E. coli a axeniche mezzi liquidi sono descritti. Infine, gli esperimenti a valle che utilizzano axenic C. elegans illustrano i benefici di questa procedura. La capacità di analizzare e determinare C. fabbisogno nutritivo elegans è stato illustrato da una crescente N2 wild type vermi in mezzi liquidi axeniche con concentrazioni variabili eme. Questa procedura può essere replicata con altri nutrienti per determinare la concentrazione ottimale per la crescita e lo sviluppo verme o, per determinare gli effetti tossicologici dei trattamenti farmacologici. Gli effetti di varie concentrazioni eme sulla crescita di tipo selvaggio vermi sono stati determinati mediante osservazione microscopica qualitativa e quantificazione tegli numero di worm che crescevano in ciascuna concentrazione eme. Inoltre, l'effetto di varie concentrazioni di nutrienti può essere saggiata utilizzando vermi che esprimono sensori fluorescenti che rispondono alle variazioni del nutriente di interesse. Inoltre, un gran numero di vermi erano facilmente prodotti per la generazione di transgenici C. elegans utilizzando microparticelle bombardamento.

Introduzione

Il nematode del suolo, Caenorhabditis elegans, è un potente organismo modello utilizzato in numerosi studi dalla genetica alla tossicologia. Come risultato della sua dimensione 1 mm tempo di generazione rapida di quattro giorni facilità di coltivazione, e un gran numero di progenie, questi nematodi sono stati utilizzati in un numero di schermi genetici e farmacologici 1, 2. Ricercatori approfittare di questo worm per identificare molecole e percorsi conservati nei sistemi di vertebrati. Questi percorsi sono segnali di morte cellulare, percorsi di invecchiamento e del metabolismo, e il sistema nervoso 3-6. Inoltre, la trasparenza di C. elegans consente la generazione di linee transgeniche utilizzando reporter proteine ​​fluorescenti, che possono essere visualizzati direttamente per analizzare i modelli di espressione genica e localizzazione delle proteine.

In molti studi questo nematode è coltivato su una superficie a base di agar-solido utilizzando nematode mezzo di crescita (NGM) piastre o in lculture iquid seminati con Escherichia coli come fonte di cibo 7,8. Queste fonti di cibo batteriche possono confondere studi biochimici e tossicologici con interferenza da batteri sottoprodotti che influenzano l'interpretazione dei risultati. Per evitare questi effetti compounding, C. elegans possono essere coltivate in un mezzo liquido axeniche che è privo di batteri come fonte di cibo. Usando questo supporto, abbiamo coltivato con successo milioni di vermi altamente sincronizzati per molti di serie C. protocolli elegans, compresa l'analisi microarray di geni differenzialmente regolati in C. elegans esposto a diverse concentrazioni eme, e produzione di vermi transgenici utilizzando gene bombardamento. Questo supporto è chimicamente definita e modificata da una ricetta originale formulata dal Dr. Eric Clegg 9. Usando questo supporto mCeHR, abbiamo identificato con successo geni coinvolti nella eme omeostasi, riferiti ai geni come eme responsivi (HRG s) 10, che avrebbenon sarebbe stato possibile in condizioni di crescita regolari che utilizzano piastre di agar NGM seminato con E. coli.

In questo protocollo si descrive la procedura per l'introduzione e il mantenimento C. elegans cresciuti su E. coli per la axenic mCeHR e utilizzare questo metodo per ottenere un gran numero di vermi per produrre transgenico C. Linee elegans utilizzando microparticelle bombardamento. Abbiamo presenti anche studi che dimostrano l'utilità di utilizzare supporti axeniche per la determinazione del fabbisogno nutrizionale di C. elegans utilizzando eme come esempio. Questi studi mostrano che utilizzando mCeHR supporti consente la rapida crescita di un gran numero di C. elegans per molte applicazioni a valle utilizzate dai ricercatori worm.

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Protocollo

1. Ceppi Worm

  1. Ottenere C. elegans tipo selvatico ceppi Bristol N2 dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e li mantengono su piastre NGM seminato con E. coli ceppo OP50 7. Nota: verme transgenico ceppi IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizzati sono stati generati come descritto in precedenza 11. IQ6011 può essere richiesto all'autore corrispondente.

2. Preparazione di Modified C. elegans Habitation e riproduzione Medium (mCeHR)

Preparare mCeHR mezzi liquidi come descritto di seguito 12. Questo supporto liquido axenic permette ai vermi di crescere senza fonti di cibo supplementari. Eseguire tutte le manipolazioni di mezzi liquidi axeniche e worm axeniche utilizzando condizioni rigorosamente sterile come una cappa a flusso laminare.

  1. Ottenere il latte pastorizzato ultra senza grassi da un negozio di alimentari. Utilizzare il pro refrigeratodotto e non il prodotto temperatura ambiente. Prima di utilizzare in mCeHR mezzo, striscia il latte sul Brain Heart Infusion (BHI) piastre di agar ed incubare per 3 giorni a 30 ° C e 37 ° C per verificare la sterilità. Trasferire il latte a 50 ml provette sterili e conservare a -80 ° C
  2. Preparare ciascuno dei seguenti componenti e combinare nell'ordine e importi indicati per preparare 1 L di mCeHR (Tabella 1A): 10 ml di 2 mM colina diacido citrato, 10 ml di vitamina e fattore di crescita mix (vedi ricetta in Tabella 1B), 10 ml di 2,4 mM myo-inositolo, 10 ml di 2 mM cloruro emina, 250 ml di acqua deionizzata. Applicare l'aspirazione e il filtro attraverso un gruppo filtro 0,22 micron.
  3. Aggiungere 20 ml di miscela di acido nucleico (ricetta nella Tabella 1C), 100 ml di miscela di minerali (ricetta nella Tabella 1D), 20 ml di 170 mg / ml lattoalbumina idrolizzato, 20 ml di aminoacidi essenziali, 10 ml di aminoacidi non essenziali acidi, 20 ml di 450 mM KH 2 PO 4,50 ml di 1,45 M D-glucosio, 10 ml di 1 M HEPES, sale di sodio, 250 ml di acqua deionizzata.
  4. Applicare aspirazione per filtrare sterilizzare i componenti. Rimuovere il filtro e aggiungere 1 ml di 5 mg / ml di colesterolo. Assicurarsi che il pH della media è di circa 6-6,5. Nota: questa soluzione può essere conservata a -80 ° C fino ad un anno.
  5. Aggiungere 20% (v / v) ultra pastorizzato latte scremato organico al mezzo mCeHR prima dell'uso. Usare una tecnica scrupolosamente sterile (ad esempio in una cappa a flusso laminare) all'apertura e si dispensa il latte. Conservare il supporto a 4 ° C.

3. Preparare C. elegans per la Cultura in axeniche mCeHR Liquid Media

  1. Crescere vermi dieci 60 millimetri piastre NGM finché ci sono molti vermi gravide e una quantità minima di OP50 E. coli sulle piastre.
  2. Rimuovere le viti senza fine da ciascuna piastra da risciacquo con 5 ml di tampone M9 (ricetta in Tabella 1F), e combinare in una provetta conica da 50 ml.
  3. Lasciare i vermi a settle lasciando il tubo riposare per 5 a 10 minuti poi rimuovere con attenzione il surnatante contenente la E. coli.
  4. Ripetere i punti 3.2 e 3.3 2x per rimuovere la maggior quantità di batteri residui più possibile prima di continuare la procedura.
  5. Risospendere i vermi in 0,1 N di NaCl in un volume che è un multiplo di tre, per esempio 1,5 ml, 3 ml o 6 ml in cui i singoli vermi può essere visto nel tubo.
  6. Candeggiare i vermi aggiungendo NaOH 5 N e 5% soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) in un rapporto di 01:02:06 alla sospensione verme. Per esempio, 1 ml di NaOH 5 N: 2 ml 5% di ipoclorito di sodio: 6 ml della sospensione verme. Mescolare il NaOH e candeggina prima di aggiungere alla sospensione verme.
  7. Vortex la soluzione energicamente fino vermi gravide vengono sciolti e solo uova sono visibili all'interno della sospensione (circa 5 a 10 min). Monitorare il processo utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X.
  8. Dopo che i vermi hanno completamente sciolto, pellet immediatamente l'uova a 800 xg per 45 secondi a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con 10 ml di acqua sterile per centrifugazione il pellet a 800 xg per 45 sec a 4 ° C.
  9. Dopo lo sbiancamento, trasferire il pellet uovo ad un tessuto beuta da 25 cm 2 di coltura contenente 10 ml di media mCeHR integrato con 100 pg / ml di tetraciclina. Effettuare questa procedura utilizzando tecniche sterili. Se lo si desidera, aggiungere ulteriori antibiotici, di cui 250 mg / ml di acido nalidixico, per prevenire la crescita batterica nelle colture liquide axeniche.
  10. Incubare le colture liquide a 20 ° C in un incubatore agitazione a circa 70 rpm.
  11. Controllare i vermi ogni giorno per notare la fase di sviluppo e il tasso di crescita.
    Nota: Worms inizialmente crescere lentamente e richiedono 7 a 10 giorni per diventare gravida. Tuttavia, come i vermi acclimatarsi al mezzo liquido il tempo di generazione diminuisce di circa 4 giorni per tipo selvatico (N2) vermi.
  12. Dopo i vermi hanno svipato alla fase gravido in mezzi liquidi, trasferire la cultura verme in una provetta conica e agglomerare le vermi a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C utilizzando un rotore oscillante.
  13. Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet verme in un volume uguale di 0,1 M NaCl. Ad esempio, utilizzare 10 ml di 0,1 M NaCl per i vermi coltivate in 10 ml di mCeHR. Lasciare i vermi di stabilirsi per 5 minuti in ghiaccio.
  14. Effettuare la procedura di sbiancamento come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8, e permettere ai vermi di crescere per una seconda generazione nei mezzi liquidi axeniche. Se necessario, aggiungere di nuovo l'antibiotico per inibire la crescita batterica.
  15. Anche in questo caso consentono ai vermi di diventare gravida poi pellet e risospendere i vermi in 0.1 M NaCl come descritto nei punti 3.12 e 3.13, poi candeggiare nuovo come descritto nei passaggi 3,5-3,8, per produrre una popolazione sincronizzato. Crescere i vermi larve L1 in mezzi liquidi senza antibiotici da ora in poi.

4. Sincronizzazione Worms da LiquidCultura

  1. Pellet e risospendere i vermi a 0,1 M NaCl come sopra descritto nei passaggi 3.12 e 3.13. Bleach come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8.
  2. Risospendere il pellet uovo in 10 ml di tampone M9 e permettere alle larve di schiudono O / N a 20 ° C su una piattaforma agitatore rotante. Nota: Le uova si schiudono in larve L1, ma non si svilupperanno ulteriormente, sincronizzando i vermi nella fase L1.
  3. Per mantenere e vermi sottocultura, pellet L1 larve a 800 xg per 5 minuti, poi risospendere le larve in 10 ml di mCeHR e il trasferimento ad un pallone 25 centimetri 2. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C su una piattaforma rotante. Mantenere una densità massima di 3.000 ml / worm / cm 2 per assicurare una nutrizione adeguata per i vermi.
    Nota: In questa fase, gli antibiotici non sono tenuti a mantenere condizioni axeniche quando le procedure siano effettuate con tecniche sterili in una cappa a flusso laminare. Worms devono essere controllate quotidianamente per monitorare la crescita.

5. Liberozing e scongelamento Worms per colture axeniche medie

  1. Congelare le culture verme asincroni axeniche o sincronizzato larve L1 in azoto liquido. Worm pellet a 800 xg per 5 minuti poi risospendere in tampone di S (6,45 KHPO mm 4, 43.55 KHPO mm 4, 146,25 mM NaCl) con 0,5 ml per ogni flacone. Aggiungere un volume uguale di tampone S con il 30% v / v glicerolo ad ogni flacone e trasferire i vermi a -80 ° C prima della conservazione a lungo termine in N 2 liquido. Congelare circa 1 x 10 6 vermi per ml in ogni fiala.
  2. Scongelare vermi incubando le fiale a 37 ° C per circa 2 min fino a quasi tutto il ghiaccio è fuso. In una cappa a flusso laminare, trasferire i vermi in un pallone sterile contenente mCeHR e metterli a 20 ° C.

6. Determinare l'effetto di Hemin concentrazione sulla crescita e la riproduzione in mCeHR

  1. Utilizzare supporti mCeHR axeniche per saggiare la crescita dipende nutrienti di C. elegans. Per determinare l'effetto of emina concentrazione sulla crescita senza fine e lo sviluppo, l'uso sincronizzato vermi N2 axeniche o di altri ceppi di interesse. Sincronizzare L1 larve come descritto sopra nella sezione 4.
  2. Il giorno successivo, pellet e contare sincronizzato larve L1 e portare ad 1 verme per ogni ml di mezzi axeniche. Effettuare 10 mM cloruro emina in 0,3 M NH 4 OH e regolare a pH 8 mediante HCl concentrato.
  3. Aggiungere 800 microlitri di media mCeHR ad una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 100 vermi per ciascun pozzetto in 100 microlitri di media. Aggiungere cloruro di emina a ciascun pozzetto in concentrazioni comprese tra 0 mM, 1,5 mM a 1.000 pM in triplice copia. Assicurarsi che tutti i pozzetti contengono la stessa concentrazione di 0,3 M NH 4 OH. Risospeso delicatamente i worm prima il pipettaggio per garantire che il 100 L1 larve sono aggiunti a ciascun pozzetto.
  4. Esaminare i vermi ogni giorno e notare la crescita di ciascuna concentrazione in ciascun pozzetto. Contare il numero di vermi dopo 9 giorni di incubazione e tracciare il numero di worm / ml corrispondenti a ciascuna emeconcentrazione (Figura 1).

7. Effetto della Hemin concentrazione su eme Worms sensori

  1. Incubare sincronizzati L1 vermi sensore eme (Phrg-1 :: GFP) in mCeHR contenente 4 micron, 8 micron, 10 micron e 20 micron emina.
  2. Immagine worm utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza, 48 ore dopo incubazione (Figura 2).

8. Utilizzando mCeHR per generare transgenici C. elegans Utilizzo di microparticelle Bombardamento

Nota: la procedura per la generazione e la realizzazione di microparticelle bombardamento con vermi coltivate in mCeHR unc-119 (ED3) è illustrato nella figura 3 13.

  1. Worm Preparazione
    1. Trasferire circa 1 x 10 6 asincroni unc-119 (ED3 vermi) in 90 ml di mezzi mCeHR in A 175 cm 2 matraccio una settimana prima del bombardamento. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C ona piattaforma di agitazione a ~ 70 rpm (Figura 3-1).
      Nota: Una settimana più tardi, la densità verme dovrebbe essere significativamente maggiore con molti adulti vermi gravide. Circa 3 x 10 7 vermi saranno necessari per microparticelle bombardamento.
    2. Freddo JM109 E. coli testa di serie 10 piatti cm NGM sul ghiaccio.
    3. Trasferire i vermi axeniche a due tubi da 50 ml coniche e centrifugare i vermi a 800 xg per 2 minuti. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le viti senza fine in ciascun tubo in 50 ml di tampone M9 (Figura 3-2).
    4. Lasciare i vermi adulti a pellet per gravità per 10-15 minuti sul ghiaccio.
      Nota: Il pellet 2 ml deve contenere ora> 90% vermi adulti. Questo pellet 2 ml dovrebbe avere circa 5 x 10 6 vermi ed è sufficiente per un bombardamento microparticelle.
    5. Rivestire l'intera superficie del refrigerata JM109 seminato piastra NGM con il pellet 2 ml di vermi. Che il liquido sia completamente assorbito poi lasciare la piastraper 30 min in ghiaccio prima di proseguire (Figura 3-3).
  2. Preparazione di particelle d'oro
    1. Pesare 30 mg di particelle d'oro in una provetta siliconato. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% e agitare la provetta per 5 min.
    2. Lasciare che il tubo a sedere per 15 minuti, poi centrifugare a 6.000 xg per 10 secondi per far sedimentare le particelle d'oro. Rimuovere il surnatante utilizzando un puntale cautamente la punta verso il lato opposto del tubo di particelle d'oro.
    3. Lavare le particelle d'oro con 1 ml di acqua sterile, vortex per 1 min e centrifugare brevemente la provetta a 6.000 xg per 10 sec. Ripetere la fase di lavaggio due volte, poi risospendere le particelle d'oro in 0,5 ml di soluzione sterile 50% glicerolo.
      Nota: La concentrazione finale delle particelle d'oro sarà di 60 mg / ml e può essere conservato per 1-2 mesi a 4 ° C.
  3. Preparare la miscela di particelle di DNA-oro
    1. Combinare 10 pg di DNA plasmidico desiderato con 10 &# 956; g del unc-119 di salvataggio plasmide in un siliconato 1,5 ml provetta. Aggiungere 50 ml di acqua deionizzata e 100 ml di ben risospeso soluzione di particelle d'oro poi vortex per 1 min.
    2. Aggiungere 150 ml di 2,5 M CaCl 2 e agitare nuovamente la soluzione per 1 min. A questa soluzione, aggiungere 60 ml di 0,1 M spermidina e vortex per 3-5 min.
    3. Pulse centrifugare la soluzione a 6.000 xg per 10 secondi, rimuovere il surnatante e aggiungere 300 ml di etanolo al 70%. Vortex bene per 1 min, impulso centrifugare a 6000 xg, rimuovere il supernatante e risospendere in 170 ml di etanolo al 100%. Vigorosamente agitare la soluzione per 5-10 minuti poi pulsano centrifugare e rimuovere il surnatante.
  4. Bombardamento (Figura 3-3)
    Nota: Questo protocollo è eseguita con il sistema di erogazione di particelle specificato nella tabella dei materiali / Attrezzatura. Seguire le istruzioni per lo strumento consegna particella disponibili.
    1. Inserire un foglio di carta velina in un piatto di 15 centimetri. Usando le pinzette, immergere sette macrocarriers singolarmente in 100% di etanolo e stenderli sul tessuto ad asciugare.
    2. Pulire accuratamente la camera di biolistic, titolare macrocarrier e piastra bersaglio con etanolo al 70%. Pulire e sterilizzare gli schermi di arresto prima di ogni procedura di bombardamento.
    3. Caricare i macrocarrriers nel supporto utilizzando pinzette e premere nel supporto utilizzando lo strumento dei posti a sedere.
    4. Distribuire uniformemente 20 ml del DNA rivestiti particelle d'oro nel centro di ogni macrocarrier e poi lasciare che la soluzione si asciughi completamente.
    5. Pulire le due parti del divisore pressione con etanolo e assemblare con etanolo puliti dischi di rottura. Avvitare il divisore a pressione montate e dischi di rottura nella camera di bombardamento.
    6. Montare uno schermo arresto autoclave con il titolare macrocarrier e posizionare l'apparecchio al scaffale di metallo richiesto e bloccare in posizione.
    7. Inserire il MACR assemblataocarrier apparecchio nella camera biolistic nello slot assegnato sotto del divisore pressione e allinearsi con il divisore pressione.
    8. Nastro il piatto NGM aperto con i vermi sul ripiano piastra bersaglio e chiudere la porta della camera.
    9. Per bombardare worm, regolare la pressione a quella necessaria per rompere i dischi di rottura. Accendere il vuoto a 28 pollici di pressione Hg, quindi premere il pulsante di fuoco fino a quando i dischi di rottura.
    10. Rilasciare il vuoto e rimuovere la piastra NGM dall'apparecchio. Lavare i vermi dalla piastra e ridistribuire in venti 10 piatti cm NGM seminato con JM109 E. coli (Figura 3-4).
    11. Lasciare i vermi di crescere per 10 a 14 giorni a 25 ° C e morire di fame i piatti. Worms salvati dal difetto unc-119 avranno il movimento normale e possono essere identificate in questo momento. Scegli almeno 10 "di tipo selvatico" vermi da lastre separate per ulteriori analisi in quanto questi rappresentano linee transgeniche indipendenti (Figure 3-5).

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Risultati

Coltura C. elegans in axeniche aiuti mezzo liquido nella determinazione di sostanze nutritive che sono richiesti dai vermi, senza interferenze da parte di metaboliti secondari prodotti da E. coli. Worm di tipo selvatico N2 acclimatare i media mCeHR entro tre generazioni e mostrano una crescita paragonabile a vermi cresciuti su piastre NGM batteriche. Infatti, questi vermi diventano gravide entro 4 giorni, rispetto a 3,5 giorni per i vermi coltivati ​​sui batteri OP50.

Un va...

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Discussione

In questo protocollo vi presentiamo un axenic mCeHR mezzi liquidi modificato che consente una rapida C. generazione elegans con produzione di un gran numero di vermi. Questo supporto mostra diversi vantaggi come i vermi sono coltivate senza contaminare E. coli o sottoprodotti batterici e possono essere sfruttati in studi nutrizionali e tossicologici. L'uso di E. coli o altri batteri in detti studi ha diversi inconvenienti. Ad esempio, la crescita dei batteri può cambiare in varie ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano non ci sono interessi economici in competizione o conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MgCl2• 6H2OSigmaM-2393
Citrato di sodioSigmaS-4641
Citrato di potassio monoidratoSigmaP-1722
CuCl2• 2H2OFisherC455-500
MnCl2• 4H2OFisherM87-100
ZnCl2SigmaZ-0152
Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2OSigmaF-1018
CaCl2• 2H2OFisherC70-500
Adenosina 5 -monofosfato, sale sodicoSigmaA-1752
Citidina 5 -fosfatoSigmaC-1006
Guanosina 2' - e 3' -monofosfatoSigmaG-8002
Uridina 5 -fosfato, sale disodicoSigmaU-6375
TiminaSigmaT0376
N-acetilglucosaminaSigmaA3286
DL-alaninaFisherS25648 
Acido p-aminobenzoicoSigmaA-9878
BiotinaSigmaB-4639
Cianocobalamina (B-12)SigmaV-2876
Folinato (Ca)SigmaF-7878
NiacinaSigmaN-0761
NiacinamideSigmaN-3376
PanteteinaSigmaP-2125
Pantotenato (Ca)SigmaP-6292
Acido pteroilglutammico (acido folico)ACRCS21663-0100
Piridossale 5'-fosfatoSigmaP-3657
Piridossamina 2HClSigmaP-9158
Piridossina HClSigmaP-6280
Riboflavina 5-PO4(Na)SigmaR-7774
Tiamina HClSigmaT-1270
DL-6,8-Acido tiotticoSigmaT-1395
KH2PO4SigmaP-5379
Colina di-acido citratoSigmaC-2004
myo-InositoloSigmaI-5125
D-glucosioSigmaG-7520
Idrolizzato enzimatico di lattoalbuminaSigmaL-9010
Brain Heart InfusionBD211065
Cloruro di eminaFrontier ScientificH651-9
HEPES, sale sodicoSigmaH-3784
ColesteroloJ.T. BakerF676-05
MEM Aminoacidi non essenzialiInvitrogen11140-076
MEM Aminoacidi SoluzioneInvitrogen11130-051
Acido nalidixico sale sodicoSigmaN4382
Tetraciclina cloridratoMP Biomedicals2194542
Sistema di somministrazione biolisticoBioRad165-2257
Particelle d'oro (Au Powder)   Sistemi di materiali Ferro Electronic6420 2504, JZP01010KM
o
particelle d'oro 1.0 μ mBioRad  Codice 165-2263

Riferimenti

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