Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell'integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica mediante l'osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.
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Articolo metodologico
Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Riparazione del DNA difettoso porta ad una maggiore instabilità genomica, che è la causa principale delle mutazioni che portano alla tumorigenesi. Analisi della frequenza e il tipo di aberrazioni cromosomiche in diversi tipi cellulari permette difetti nei percorsi di riparazione del DNA da chiarire. Comprensione mammiferi riparazione del DNA biologia è stato molto aiutato dalla produzione di topi con ko in geni specifici. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B del mouse. Etichettatura dei telomeri con sonde PNA-FISH (peptide di acido nucleico - ibridazione fluorescente in situ) facilita l'analisi rapida di instabilità genomica degli spread metafase cromosomiche. Cellule B hanno vantaggi specifici relativi ai fibroblasti, perché hanno ploidia normale e un indice mitotico superiore. Cultura a breve termine di cellule B consente quindi la misurazione precisa di instabilità genomica in una popolazione di cellule primarie, che rischia di avere mutazione genetica secondaria menos di quello che è tipicamente presenti nei fibroblasti trasformati o linee cellulari di pazienti.
Introduzione
Il cancro è causato da un accumulo di mutazioni che interessano i geni che regolano la crescita delle cellule normali. La mutazione è una conseguenza di modifiche alla struttura e la sequenza del genoma causato da danni al DNA. Danno al DNA può avvenire attraverso una varietà di processi, compresi gli agenti esogeni come radiazioni ionizzanti, e come un sottoprodotto del normale metabolismo cellulare, come deaminazione spontanea di basi nucleotidiche o danni che si verificano per contatto con le specie reattive dell'ossigeno 1.
Anche se le cellule di mammifero in possesso di una serie di attività di riparazione che può inve....
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Protocollo
Questa procedura è stata approvata dal Comitato di cura e l'uso degli animali Istituzionale presso la Rutgers, l'Università statale del New Jersey. I topi sono stati trattati in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli scienziati dovrebbero consultare i loro organizzazioni nazionali ed istituzionali animali per linee guida stabilite e approvate.
Prima di iniziare, preparare le soluzioni elencate nella tabella 1.
1 B Isolamento cellulare e attivazione
Euthanize un mouse utilizzando CO 2 seguita da dislocazio....
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Risultati
Cromosomi in metafase derivati da una cella dovrebbe formare un cluster discreto contenente 40 cromosomi (se si utilizza cellule di topo) (Figura 1A). Ogni cromosoma ha un centromero ad una estremità, che è visibile come una sfera azzurro. In cromosomi normali, due segnali telomeri sono visti alla fine dei cromatidi e due segnali di ciascun centromero. Nuclei in interfase saranno presenti sul vetrino pure. Questi saranno visibili come sfere blu, con segnali telomeri rosse, ma non cromosomi condensati .......
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Discussione
Considerando che i linfociti B attivati sono particolarmente adatti alla preparazione degli spread cromosomi mitotici, possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule. Linfociti T condividere molti dei vantaggi delle cellule B, in quanto possono essere purificati dai nodi milza o linfonodi, e hanno un elevato indice mitotico, quando stimolato dalla crescita in terreno contenente mitogeni appropriate 8. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) sono adatti anche per l'analisi della metafase crom.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da NIH concedere R00 CA160574 (SFB) e da una borsa di studio del programma di formazione Biotecnologie Rutgers (a SMM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 50% destrano solfato | Intergen | S4030 | |
| Formamide deionizzata | Ambion | 9342 | |
| Pepsina (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μ g) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) microsfere | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Camera di essiccazione citogenetica | Thermotron |
Riferimenti
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
| Solution | Reagents | Comments | Storage |
| B Cell Wash Buffer | 500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 5 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| B Cell Medium | 418.5 ml RPMI-1640 | Filter through 0.22 μm stericup filtration unit | 4 °C |
| 50 ml 50 °C heat inactivated FCS | |||
| 5 ml 100x Pen/Strep | |||
| 5 ml glutamine | |||
| 5 ml nonessential amino acids | |||
| 5 ml sodium pyruvate | |||
| 1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol | |||
| 5 ml 1M HEPES | |||
| Fixative | 3:1 v/v methanol/glacial acetic acid | Make fresh | |
| 0.075 M KCl | 1.395 g KCl | Room Temperature | |
| 250 ml distilled H2O | |||
| FISH Master Mix | 40 ml 50% Dextran sulfate | Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml 20x SSC | |||
| 40 ml sterile distilled H2O | |||
| 70% Formamide/2x SSC | 10 ml 20x SSC | Adjust to pH 7 with 1M HCl | Aliquot and store at -20 °C |
| 20 ml distilled H2O | |||
| 70 ml deionized formamide | |||
| 0.01 M HCl | 1 ml 1M HCl | Adjust to pH 2.0 | Room Temperature |
| 99 ml distilled H2O | |||
| 1x PBS/MgCl2 | 50 ml 1M MgCl2 | Room Temperature | |
| 950 ml 1x PBS | |||
| 50% Formamide/2x SSC | 20 ml 20x SSC | Adjust to pH 7.25 Formamide used in this step does not have to be deionized. | Make fresh |
| 80 ml distilled H2O | |||
| 100 ml formamide | |||
| 4x SSC/0.1% Tween20 | 50 ml 20x SSC | Room Temperature | |
| 200 ml distilled H2O | |||
| 250 μl Tween20 | |||
| DAPI staining solution (80 ng/ml) | 40 μl 0.2mg/ml DAPI stock | 4 °C in light protected staining jar | |
| 100 ml 2x SSC | |||
| Mowiol Mounting Medium | 6 g glycerol | Incubate at 50 °C with stirring for 2hrs | Aliquot and store at 4 °C |
| 2.4 g Mowiol 4-88 | |||
| 6 ml distilled H2O | |||
| 12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5 | |||
| 230 μl 1% Thimerosal (w/v in water) |
Table 1. List of solutions.
