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Articolo metodologico

A Novel In vivo Tecnica Gene Transfer e In vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

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DOI:

10.3791/51810

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8 giugno 2014

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1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

La differenziazione delle cellule precursori in osteoclasti è regolata da citochine e fattori di crescita. Qui vengono descritti una nuova tecnica di trasferimento genico per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti delle citochine sull'osteoclastogenesi.

Abstract

La differenziazione e l'attivazione degli osteoclasti svolgono un ruolo chiave nello sviluppo delle malattie muscoloscheletriche poiché queste cellule sono principalmente coinvolte nel riassorbimento osseo. Gli osteoclasti possono essere generati in vitro da cellule precursori di monociti/macrofagi in presenza di alcune citochine, che promuovono la sopravvivenza e la differenziazione. Qui vengono dimostrate tecniche sia in vivo che in vitro, che consentono agli scienziati di studiare diversi contributi delle citochine alla differenziazione, alla segnalazione e all'attivazione degli osteoclasti. Il sistema di trasferimento genico minicircle DNA delivery fornisce un metodo alternativo per stabilire un modello correlato all'osteoporosi ed è particolarmente utile per studiare l'efficacia di vari inibitori farmacologici in vivo. Allo stesso modo, i protocolli di coltura in vitro per la produzione di osteoclasti da cellule precursori umane in presenza di citochine specifiche consentono agli scienziati di studiare l'osteoclastogenesi nelle cellule umane per applicazioni traslazionali. Combinate, queste tecniche hanno il potenziale per accelerare gli sforzi di scoperta di farmaci per terapie mirate specifiche per gli osteoclasti, che possono giovare a milioni di pazienti affetti da osteoporosi e artrite in tutto il mondo.

Introduzione

Malattie muscolo-scheletriche colpiscono milioni di persone negli Stati Uniti e presentare gravi conseguenze per i sistemi sanitari nazionali e locali 1. Questi disturbi sono caratterizzati da perdita di osso e funzione articolare che richiedono un trattamento estensivo e lunghi periodi di recupero. Comunemente, un relativo aumento del numero e / o attività di osteoclasti, cellule specializzate a riassorbire osso, osteoporosi ed artrite si osserva 2. In condizioni fisiologiche il numero e l'attività degli osteoclasti è regolata da attivatore del recettore del fattore nucleare κ-B ligando (RANKL), che è prodotto dagli osteoblasti. Osteoprotegerina (OPG), un recettore decoy per RANKL è anche prodotta dagli osteoblasti 3 In modelli animali in vivo che coinvolgono la sovraespressione sistemica di sRANKL, o la cancellazione di OPG sono molto prezioso nella ricerca sull'osteoporosi.; Tuttavia, questi metodi richiedono la generazione di topi transgenici 4,5. Qui, una nuova alternativametodo di iperespressione sRANKL per lo studio dei disturbi muscoloscheletrici legati è descritto. In particolare, minicircle (MC) tecnologia del DNA e metodi di consegna idrodinamiche sono stati usati per conseguire trasferimento genico di sRANKL in vivo e iperespressione del mouse sRANKL sistemicamente 6.

Questo metodo è anche complementare ad altri modelli in vivo di osteoporosi, come la modulazione ormonale degli osteoclasti seguenti ovariectomia 7 e intervento dietetico da basso contenuto di calcio dieta 8. Questi modelli sono molto utili per studiare diversi aspetti dei disturbi muscoloscheletrici legati tuttavia essi richiedono procedure chirurgiche e può richiedere fino a diversi mesi, ad un costo significativo 9. Ovariectomizzate (OVX) modello di roditore è un modello animale sperimentale in cui la rimozione delle ovaie porta alla mancanza di estrogeni mimando così postmenopausale umano 10. Umano post-menopausa osteoporosi, una condizione in cui gli estrogeni deficirenza porta ad un aumento del rischio di fratture ossee e l'osteoporosi colpisce circa otto milioni di donne negli Stati Uniti da soli. Anche se il modello OVX è utile per l'osteoporosi post-menopausale che offre vantaggi limitati a studiare l'osteoporosi in generale. Estrogeni sopprime perdita ossea, inducendo osteoclasti e osteoblasti inibizione dell'apoptosi, quindi in sua assenza un aumento dell'attività degli osteoclasti si osserva 10-12. Un rapporto di squilibrio RANKL-OPG che favorisce riassorbimento osseo si osserva anche 13. Tuttavia, la carenza di estrogeni in vivo è accompagnato anche da una diminuzione dei livelli di fattore di crescita trasformante β (TGF β), aumento della interleuchina-7 (IL-7) e TNF, IL-1 e IL-6 14,15. Poiché queste citochine hanno conosciuto funzioni modulatori rimodellamento osseo indipendente dal percorso che RANKL, è impossibile attribuire qualsiasi osteoclasti esclusivamente all'asse RANKL-RANK. Il modello descritto in questo documento consente ai ricercatori di studiare in vivo l'asse RANKL-RANK in osteoclastogenesi e la perdita di osso senza citochine pro-infiammatorie rispetto ai modelli di roditori OVX.

Inoltre, le tecniche osteoclastogenesi in vitro sono strumenti essenziali per studiare l'attivazione degli osteoclasti per i potenziali trattamenti terapeutici delle malattie muscolo-scheletriche. Precedenti studi hanno inoltre dimostrato che la coltura di midollo osseo di topo macrofagi derivati ​​(BMMs) con il mouse macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) e il mouse sRANKL può portare a osteoclasti differenziazione 3,16,17. Qui sono descritti i protocolli per generare cellule osteoclasti come multinucleate da midollo osseo di topo e di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) in vitro 18. I saggi cellulari necessari per definire un maturo osteoclasti terminalmente differenziate e pienamente funzionale sono anche descritte brevemente. Queste tecniche in vitro completano il romanzo di approccio vivo e insieme fungono da pstrumenti investigativi owerful per studiare la differenziazione degli osteoclasti e l'attivazione. L'utilizzo di questi sistemi, gli scienziati sono in grado di generare osteoclasti in vivo e in vitro e definire gli stimoli e segnali necessari per la proliferazione e l'attivazione e testare l'efficacia di inibitori farmacologici e biologici.

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Protocollo

1. Consegna idrodinamica di sRANKL MC DNA

  1. Consegna idrodinamica via Tail Vena del mouse
    1. Pesare il mouse prima dell'iniezione coda vena. Diluire sRANKL o proteina fluorescente verde (GFP) MC in soluzione di Ringer (pre-riscaldare a 37 ° C) in un volume totale di circa 10% del peso corporeo del topo.
    2. Riscaldare il topo in una gabbia per 10 min prima dell'iniezione per dilatare i vasi sanguigni e rendere vene laterali (LV) visibili. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la disidratazione e ipertermia.
    3. Non appena i VL sono dilatati e visibili, trasferire il mouse per il limitatore e inserire la spina abbastanza lontano nel barile per frenare il movimento. Monitorare il mouse per il normale attività come la respirazione. Regolare la spina del dispositivo di immobilizzazione, se necessario.
    4. Disinfettare la zona di iniezione 3/4 dalla punta della coda con un batuffolo imbevuto di alcool. Utilizzare un ago G 27-30 per l'iniezione coda vena mouse. Tenere la coda saldamente con una mano e inserire l'ago inla vena della coda. Applicare una pressione sulla siringa e completare l'iniezione entro 5-7 sec.
    5. Rimuovere l'ago dalla vena della coda e applicare una pressione con un batuffolo di cotone sul sito di iniezione per fermare l'emorragia. Monitorare il mouse per 15-30 minuti, quindi trasferire il mouse fino al vivaio una volta che il tasso di respirazione è ridotta al suo tasso normale.
  2. Conferma di espressione sistemica mouse sRANKL e quantificazione dei mouse Serum TRACP5b post Gene Transfer
    1. Riscaldare il topo in una gabbia per 5-10 minuti, al fine di dilatare i vasi sanguigni e rendere visibile LV. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la disidratazione e ipertermia.
    2. Fare una piccola incisione con una lama di coda del topo in un sito un quarto dalla punta della coda.
    3. Raccogliere circa 100 ml di sangue in provette di siero di separazione.
    4. Incubare le provette di siero di separazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
    5. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 5 minuti e raccogliere il siero. Store siero in -80 ° C per ulteriori analisi.
    6. Eseguire sRANKL ELISA e mouse dosaggio TRACP5b siero su campioni di siero utilizzando un kit commerciale disponibile.

2. In vitro Osteoclasta generazione di mouse BMMs

  1. Isolamento e Coltura di BMMs
    1. Isolamento della tibia e femore ossa: Euthanize il mouse donatore con CO 2, e disinfettare le gambe con il 70% di etanolo. Sezionare dal pube all'osso calcagno, per rimuovere femore e tibia ossa intatte.
    2. Rimuovere la pelle ei muscoli attenzione senza danneggiare l'osso. Posizionare femore e tibia trasformati in una capsula di Petri contenente tampone fosfato salino (PBS).
    3. Rimozione di midollo osseo: Tagliare la punta su un lato del femore e della tibia ossa e lavare il midollo osseo in una provetta da 50 ml con una siringa da 1 ml con un ago G 25, caricato con α-MEM contenente 1% di penicillina / streptomicina (osteoclasti cultura medio / OCM).
    4. Processo midollo osseo: Mescolare e trasferire sospensione midollo osseo in un tubo da 50 ml facendola passare attraverso un filtro 70 micron cella nylon. Centrifugare le cellule a 300 xg e risospendere in α-MEM contenente 1% di penicillina / streptomicina e 10% FBS (Osteoclasta colturale / OCM (+)).
  2. Cultura dei macrofagi
    1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatico.
    2. Piastra 1 x 10 6 cellule per bene per un 6-pozzetti o 3 x 10 5 cellule per vetrino (5 mm) o fette di dentina collocati in piastra a 96 pozzetti ed incubare a 37 ° C.
    3. Aspirare tutti i supporti contenenti cellule non aderenti e Incubare le cellule a 37 ° C con OCM fresco (+) contenente topo 25 ng / ml M-CSF per 48 ore.
    4. Aspirare tutti i media e incubare le cellule a 37 ° C con nuova OCM (+) supporti contenenti il ​​mouse 25 ng / ml M-CSF e 30 ng / ml il mouse sRANKL per avviare osteoclastogenesis. Rifornire i media ogni 3 giorni come richiesto.
    5. Crescere celluleper circa 6-8 giorni per formare celle multi-nucleari giganti in grado di riassorbimento osseo. Non appena compaiono le cellule multinucleate, eseguire TRAP (fosfatasi acida tartrato resistente) colorazione utilizzando un kit commerciale disponibile, e quando è completamente maturato, eseguire test funzionali. Visualizza anelli di F-actina su vetrini con macchia phalloidin e immagine le cellule attaccate alla dentina fette da microscopia elettronica a scansione (SEM), come descritto in precedenza 19.

3. In vitro Osteoclasta generazione da PBMC umano

  1. Isolamento di PBMC umano
    1. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato Histopaque-1077 in una provetta da 50 ml.
    2. Filtro leucociti vuoto ottenuto dalla banca del sangue con PBS sterile in una provetta da 50 ml (rapporto 1:1 di sangue con PBS). Strato il sangue diluito su tutto la soluzione HISTOPAQUE molto lentamente, facendo in modo che il sangue non si mescola con il HISTOPAQUE.
    3. Centrifugare i campioni a 1000 xg per 20 min a 18 ° C. Seguireing centrifugazione, isolare attentamente il buffy bianco strato di rivestimento contenente i globuli bianchi e le trasferisce in un nuovo tubo da 50 ml.
    4. Diluire le cellule con PBS e centrifugare di nuovo a 650 xg per 5 minuti per raccogliere le cellule.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in OCM (-) i media e contare le cellule utilizzando contatore di cellule.
  2. Placcatura e Coltura PBMC
    1. Risospendere le cellule in OCM (+) Media e piastra 8 x 10 6 cellule / ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti o 1 x 10 6 cellule / ml per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Cellule piastra su vetrini (5 mm) come richiesto per l'imaging immunofluorescenza nonché sulle fette di osso adatti per saggi di riassorbimento osseo come precedentemente descritto 20.
    2. Cambia terreni di coltura, rifornire le cellule umane con M-CSF ogni 2-3 giorni o secondo necessità. Quindi procedere alla differenziazione passo il giorno 5 aggiungendo 30 ng / ml di sRANKL umana con 25 ng / ml M-CSF umano nella OCM (+) mezzi di avviare osteoclastogenesè.
    3. Crescere cellule per circa 14 a 21 giorni per formare cellule multi-nucleari giganti. Non appena compaiono le cellule multinucleate, queste cellule possono quindi essere etichettati per TRAP, e quando è completamente maturato, test funzionali possono essere eseguiti. Anelli di F-actina possono essere visualizzati su vetrini con macchia falloidina. La morfologia cellulare può essere esaminato in cellule attaccate alla dentina fette mediante SEM.

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Risultati

Qui, una tecnica di trasferimento nuovo gene per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti di citochine sulla osteoclastogenesis sono descritti. In Figura 1, sono mostrati i risultati rappresentativi di successo trasferimento genico di GFP e mouse sRANKL MC nei topi. Nella figura 2, vengono mostrate le immagini rappresentative del m...

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Discussione

Condizioni muscolo-scheletriche sono le cause principali di morbilità e di disabilità e sono composti da oltre 150 malattie e sindromi; che colpisce circa 90 milioni di americani oggi. L'infiammazione articolare e la distruzione ossea sono caratteristiche predominanti di disturbi muscolo-scheletrici, tra cui l'artrite e l'osteoporosi. L'osteoporosi è una condizione che indebolisce l'integrità ossea, causando spesso fratture delle ossa. L'artrite è una malattia cronica, debilitante malattia caratt...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La ricerca è stata in parte supportata dalle sovvenzioni di ricerca NIH R01 AR062173 e SHC 250862 all'IEA. ES è il destinatario della borsa di studio pre-dottorato NIH T32 CTSC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
alpha-MEMLife Technologies 12561-056
Umano M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
Mouse M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Human RANK-Ligand -solubile Miltenyi Biotec130-094-631
Mouse RANK-Ligand - solubileMiltenyi Biotec130-094-076
Tailveiner Resrain per topiBraintreeTV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Kit ELISA Quantikine R& D systemsMTR00
Acid Phosphatase, Kit leucocitario (TRAP)Sigma387A
MouseTRAP assay sistema immunodiagnosticoSB-TR103

Riferimenti

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