Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in Drosophila melanogaster

Sommario

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Abstract

Gli ultimi decenni hanno visto l'esplosione di interesse scientifico intorno a meccanismi di controllo dell'espressione genica a livello di RNA. Questa branca della biologia molecolare è stato notevolmente alimentata dalla scoperta di RNA non codificanti come principali attori regolazione post-trascrizionale. Tale prospettiva rivoluzionaria è stata accompagnata e innescata dallo sviluppo di tecnologie avanzate per la profilazione dell'espressione RNA breve, sia a livello di high-throughput (identificazione genome-wide) o come l'analisi singolo candidato (accumulo stato stazionario di determinate specie). Anche se diverse strategie state-of-art sono attualmente disponibili per il dosaggio o la visualizzazione di tali molecole in fuga, saggio Northern blot rimane l'approccio ammissibile in biologia molecolare per la valutazione immediata e precisa di espressione dell'RNA. Esso rappresenta un primo passo verso l'applicazione delle più sofisticate tecnologie, costose e, in molti casi, rimane un metodo preferenziale per guadagnare facilmente intuizioniin RNA biologia. Qui PANORAMICA un protocollo efficiente (Enhanced Northern Blot) per rilevare microRNA debolmente espresse (o altre piccole specie di RNA regolatori) da Drosophila melanogaster embrioni interi, sezionato manualmente tessuti / adulti larvali o in cellule coltivate in vitro. È necessaria una quantità molto limitata di RNA e l'uso di materiale dal flusso citometria cellule isolate possono essere anche previsto.

Introduzione

RNA biochimica ha sperimentato progressi spettacolari negli ultimi anni ^1. La nostra comprensione del potenziale RNA nel controllo dell'espressione genica è stata scoppiata dall'identificazione dei potenti non codificanti Ribo-regolatori ^2, dalla scoperta di nuovi a base di RNA-meccanismi regolatori ^3,4 e da una caratterizzazione più profonda di eventi post-trascrizionali già noti ^5. Tutti biologia dell'RNA insieme questi studi hanno permesso di rendere drammaticamente la scena, diventando un importante soggetto di ricerca nel panorama scientifico attuale. In particolare, negli ultimi anni stiamo ottenendo un se....

Protocollo

1 Raccolta dei campioni

1. Staccare 2 celle semi-aderente di Schneider, (1-5 x 10 ⁶ cellule in media), pipettando e raccolta per centrifugazione (100 xg per 1 min). Nel caso di cellule aderenti coltivate in vitro, li trypsinize in condizioni standard o direttamente raccoglierli da piastre in una conveniente quantità di RNA reagente di estrazione, con l'aiuto di un raschietto cellulare.
2. Per la raccolta degli embrioni, crescere i ceppi di Drosophila in gabbie fly e lasciare che gli embrioni si accumulano sui piatti deposizione delle uova. Pulire gli embrioni fuori da un pennello in acqua distillata (dH ₂ O),....

Risultati

Seguendo la procedura generale descritta nel testo e schematicamente rappresentato in figura 1, abbiamo valutato l'espressione piccoli RNA da campioni di RNA complessi di diversa origine. Nell'esperimento illustrato nella figura 1, l'RNA è stato isolato da di Drosophila Schneider 2 celle di estrazione proteinasi K, controllato per l'integrità (passaggio facoltativo: denaturante di agarosio gel frazionamento) e caricato in doppio. Una metà del gel è stato cancellato su una membr.......

Discussione

Anche se il nostro apprezzamento per il sofisticato intreccio attraverso il quale l'RNA regola la neurogenesi è in continuo aumento, le implicazioni meccanicistiche di circuiterie di RNA che influenzano neurali biologia delle cellule staminali, differenziamento neuronale / integrazione funzionale, sviluppo di patologie neurali e tumori rimangono inesplorate. Il mantenimento di tali reti attraverso regni rende il potenziale dei sistemi genetici come Drosophila melanogaster strumentale per svelare vie cellula.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
COMPOSIZIONE FINALE/NOME	AZIENDA	CATALOGO (Stock)	COMMENTI
REQUISITI GENERALI
Centrifuga, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Decontaminante, RNasi Away	Sigma-Aldrich	83931	Applicare su vetro/plastica, pulire e risciacquare
Inibitore della RNasi, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Pericoloso //// 1609-47-8
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Stereomicroscopio, M60	Leica
1X PBS Buffer
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2,7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1,8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
ESTRAZIONE/ANALISI DELL'RNA
Spettrofotometro UV-Vis	Thermo Scientific	Imager Gel Thermo
, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Elettroforesi orizzontale, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
Reagente per estrazione RNA, Reagente TRIzol	Life Technologies	15596026	Pericoloso
PCA (25:24:1), 1:1 per l'estrazione	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 per l'estrazione	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
EtOH, 2,5 vol. per precipitazione, 70% per lavaggio	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Righello genetico 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x Soluzione
2% sodio dodecil solfato (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Non raffreddare mai SDS per evitare precipitazioni //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinasi K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Reticolocita Standard Tampone (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
			denaturante di agarosio
1,2% Agarosio	Sigma-Aldrich	A9539	Lasciare solidificare il gel per almeno 1 ora //// 9012-36-2
10X MOPS Buffer
0,2 M MOPS sale sodico, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Non confondere il sale sodico MOPS con MOPS //// 71119-22-7
Colorante
1x MOPS Buffer
3% formaldeide	Sigma-Aldrich	F8775	Pericoloso //// 50-00-0
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Pericoloso //// 75-12-7
Bromuro di etidio (EtBr) 30 μ g/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Pericoloso //// 1239-45-8
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
PICCOLO FRAZIONAMENTO DELL'RNA
Punte di caricamento del gel piatto	Life Technologies	LC1002
Concentratore Savant SpeedVac	Thermo Scientific	Elettroforesi verticale DNA120
, Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
Denaturante Acrilammide Gel
10% acrilammide / bis-acrilammide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Pericoloso. Lasciare polimerizzare il gel per 45 minuti prima dell'uso
1x tampone TBE (o 1x tampone MOPS)
7 M urea	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0,1% persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0,1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Righello genetico Scala DNA a gamma ultra bassa (passo 10 bp)	Thermo Scientific	SM1211	Etichetta 0,1 μ g, come descritto nella reazione di "marcatura della sonda"
Colorante blu acrilammide
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Pericoloso //// 75-12-7
Blu bromofenolo	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
Buffer di corsa (RB)
1x Buffer MOPS
RB alternativo: 1x tampone
1x tampone
5x TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM di acido borico	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
			colorante in gel
Bromuro di etidio 0,5 μ g/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Pericoloso //// 1239-45-8
1x Macchia RB			per 15 minuti con EtBr, destagnare per 15 minuti senza EtBr
BLOTTING
3MM Carta Whatman	Sigma-Aldrich	Z270849
Membrana in nylon neutro, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Fotosensibile
RETICOLAZIONE
Soluzione reticolante (XLS)
1% 1-metilimidazolo (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Preparare sempre un'aliquota fresca di XLS //// 616-47-7
12,5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Pericoloso //// 7647-01-0
3,1% EDC (w/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
(PRE)-HYBRIDIZATION
Contatore di Scintillazione Liquida	Beckmann	LS 6500
Spermatozoo di salmone tosato, 0,1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4 sonda			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA
sonda			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
sonda			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
sonda			5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Kit
di purificazione, Illustra MicroSpin G-25 Colonne	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pre)-Soluzione di ibridazione (HS)
0,5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5x Soluzione
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0,2 M fosfato di sodio	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA (pH 8,0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50x Soluzione
1% Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% Polivinilpirrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1X TEN tampone
10 mM Tris-Cl (pH 8,0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA (pH 8,0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Etichettatura
0,4 &; M oligonucleotide
1,5 μ l Ci/μ l [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	pericoloso //// 51963-61-2
1x tampone polinucleotide chinasi T4	Biolabs	B0201
polinucleotide chinasi 0,5 unità/μ l	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
WASHING
Geiger Mueller Detectors	Canberra Industries	MCB2/CPS –
Tampone di lavaggio (WB), 2x SSPE
Rigorosi tamponi di
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
RILEVAMENTO DEL SEGNALE
Sistema PharosFX Plus Biorad		170-9460
Immagine J	Disponibile
Quantità Una	Biorad
BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	Rivelatore fotosensibile
per pellicole radiografiche	Sigma-Aldrich	P7042
Fissatore per pellicole radiografiche	Sigma-Aldrich	P7167
STRIPPING
Soluzione
10 mM Tris-HCl pH 8,8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0,1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	Aggiungere SDS dopo l'ebollizione per evitare la formazione di schiuma //// 151-21-3

ScientificRSBGel di caricamento di agarosioTBETBESoluzione antisenso antisenso antisenso antisenso di Denhardtdi Denhardtdella sondaEM77021lavaggiogratuitamente Pellicole radiografiche , di strippaggio