Articolo metodologico

Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

14.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/51829

⸱

21 settembre 2014

 ,  , 
1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

In questo articolo

Sommario

La neurochimica del cervello dei mammiferi è cambiata in molte malattie neurologiche e sistemiche. I profili caratteristici dei metaboliti cerebrali possono essere ottenuti in modo efficiente sulla base di estratti grezzi di tessuto cerebrale. A tal fine, viene impiegata la spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che consente un'analisi quantitativa dettagliata delle concentrazioni di metaboliti (metabolomica).

Abstract

Gli studi sull'espressione genica sui livelli di RNA e proteine sono stati a lungo utilizzati per esplorare i processi biologici alla base della malattia. Più recentemente, la genomica e la proteomica sono state integrate da un'analisi quantitativa completa del pool di metaboliti presenti nei sistemi biologici. Questa strategia, chiamata metabolomica, mira a fornire una caratterizzazione globale del complemento di piccole molecole coinvolto nel metabolismo. Mentre il genoma e il proteoma definiscono i compiti che le cellule possono svolgere, il metaboloma fa parte del fenotipo vero e proprio. Tra i metodi attualmente utilizzati in metabolomica, le tecniche spettroscopiche sono di particolare interesse perché consentono di analizzare simultaneamente un gran numero di metaboliti senza una selezione preventiva per specifiche vie biochimiche, consentendo così un approccio ampio e imparziale. Qui viene presentato un protocollo sperimentale ottimizzato per l'analisi metabolomica mediante spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che è il metodo di scelta per una quantificazione efficiente dei metaboliti tissutali. Importanti punti di forza di questo metodo sono (i) l'uso di estratti grezzi, senza la necessità di purificare il campione e/o separare i metaboliti; ii) la natura intrinsecamente quantitativa della RMN, che consente la quantificazione di tutti i metaboliti rappresentati da uno spettro NMR con un solo composto di riferimento; e iii) la natura non distruttiva della RMN che consente l'uso ripetuto dello stesso campione per misurazioni multiple. L'intervallo dinamico delle concentrazioni di metaboliti che possono essere coperte è considerevole a causa della risposta lineare dei segnali NMR, sebbene i metaboliti che si verificano a concentrazioni estremamente basse possano essere difficili da rilevare. Per i composti meno abbondanti, il metodo della spettrometria di massa altamente sensibile può essere vantaggioso, sebbene questa tecnica richieda procedure di preparazione e quantificazione del campione più complesse rispetto alla spettroscopia NMR. Presentiamo qui un protocollo NMR adattato all'analisi del cervello di ratto; Tuttavia, lo stesso protocollo può essere applicato ad altri tessuti con piccole modifiche.

Introduzione

Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello 1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l'espressione genica a RNA e / o livelli di proteine ​​da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall'altro 2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi 7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ultimi 10 o 15 anni, a una rinascita della ricerca metabolica in molti rami della biologia 8,9. Mentre studi metabolici classici si sono spesso concentrati su dettagli di specifici percorsi, il nuovo approccio metabolomica è orientata verso un'indagine onnicomprensiva del profilo metabolico globale del tessuto in esame.Una conseguenza di questo concetto è un evidente bisogno di strumenti analitici che riducono al minimo pregiudizio verso specifici percorsi e / o classi di composti metabolici. Tuttavia, un saggio biochimico classica è basata su una particolare reazione chimica di un analita che deve essere specificato prima di eseguire il test. Per contro, tecniche spettroscopiche come la risonanza magnetica (NMR) nucleare e la spettrometria di massa (MS) (i) sono basati su particolari (fisici) proprietà molecolari di composti biochimici, ciascuna delle quali dà luogo ad uno o più segnali distinti in uno spettro rilevato nel corso di un esperimento; e (ii) rilevare un gran numero di diversi composti per esperimento.

Così, ogni spettro contiene le informazioni combinate di tutta una serie di metaboliti. Per questo motivo, i metodi spettroscopici sono strumenti adeguati per la metabolomica, in quanto nessuna selezione preventiva deve essere fatta per quanto riguarda la natura dell'analita da misurare 8 . Di conseguenza, queste tecniche naturalmente si prestano a studi esplorativi perché notevolmente facilitano l'individuazione di cambiamenti metabolici inaspettati.

Anche se la spettroscopia NMR e MS possono essere usati in modo intercambiabile per l'analisi di molti metaboliti, ogni metodo possiede vantaggi e gli svantaggi che sono stati recentemente recensito 10 specifici. In breve, la spettroscopia NMR di solito può essere eseguita da estratti grezzi e non richiede la separazione cromatografica di composti del campione prima dell'analisi. Al contrario, MS funziona con gas o cromatografia liquida (GC o LC) separazione, ad eccezione di particolari sviluppi recenti come l'imaging spettrometria di massa. In alcuni casi particolari, come l'analisi degli zuccheri, separazione LC può diventare una necessità per la spettroscopia NMR così, perché le linee di risonanza di zuccheri diversi si sovrappongono in modo significativo nel protone (1 H) spettri NMR. Tuttavia, spettroscopia 1 H NMR senza chrseparazione omatographic rimane il più popolare quasi universalmente applicata metodo NMR metabolomica,. In generale, la preparazione del campione è più lungo e complesso per MS di quanto lo sia per la spettroscopia NMR. Gravi problemi dovuti agli effetti della matrice sono molto meno comuni in spettroscopia NMR che in Stati membri in cui essi possono condurre a segnali notevolmente attenuati. Metabolita quantificazione può essere ottenuto con entrambi i metodi. Tuttavia, sono necessari più composti standard per la SM a causa di variazioni di effetti matrice e l'efficienza di ionizzazione tra metaboliti. Al contrario, è necessario un solo standard per ogni campione per l'analisi spettroscopica NMR perché in condizioni di misura adeguate, il secondo metodo è intrinsecamente quantitative grazie alla risposta NMR strettamente lineare dai nuclei osservati. Un grave inconveniente di NMR è la sua relativamente bassa sensibilità. MS, in particolare, LC-MS, è più sensibile NMR di diversi ordini di grandezza; per questo motivo, MS è da preferire NMR per laanalisi dei composti presenti a concentrazioni molto basse. D'altra parte, la natura non distruttiva dell'esperimento NMR è un chiaro vantaggio rispetto MS; in questo modo, NMR può essere eseguita più volte sullo stesso campione, ad esempio, per i diversi nuclei NMR attivo come 1 H, fosforo-31 (31 P), carbonio-13 (13 C), fluoro-19 (19 F) etc., in quanto nessun materiale viene consumato da NMR rispetto alle misurazioni MS.

Sia NMR e MS possono essere impiegati in modi differenti, ognuno dei quali è ottimale per la rivelazione di composti con particolari caratteristiche chimiche. Per esempio, 31 P NMR è spesso più adatto di 1 H NMR per l'analisi di composti fosforilati moderatamente concentrati, sebbene metaboliti fosforilati quasi tutti contengono anche protoni. Tuttavia, i loro segnali 1 H NMR possono essere oscurate da 1 H NMR i segnali provenienti da altri composti, non fosforilata, mentre il secondoovviamente non causano segnali di fondo in 31 P NMR. In una situazione analogico, analisi 19 F NMR è da preferire per i composti fluorurati, ad esempio, farmaci fluorurati (nessun segnale di fondo di metaboliti endogeni), mentre il caso speciale di 13 C NMR è di interesse quasi esclusivamente se il destino di 13 C deve essere seguita, a causa della estremamente bassa abbondanza naturale dell'isotopo 13 C (circa 1%) etichettati precursori metabolici esogeni. Molti spettrometri di massa operano in modalità ioni negativi o in modalità ioni positivi. Pertanto, è importante conoscere in anticipo l'analisi se gli ioni da osservare sono caricati negativamente o positivamente. Ci concentriamo qui su un protocollo per l'analisi del metabolome tessuto cerebrale da 1 H e 31 spettroscopia NMR P perché questo metodo produce un gran numero di importanti concentrazioni di metaboliti a basso costo, in termini di (i) il tempo necessario per la preparazione del campione unnd (ii) lo sforzo richiesto per metabolita quantificazione. Tutti gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando l'attrezzatura di un laboratorio standard di wet-chimica e una struttura di spettroscopia NMR ad alta risoluzione. Ulteriori requisiti sono descritti nella sezione Protocollo di seguito.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

NOTA: ANIMAL DICHIARAZIONE ETICA
Gli studi sugli animali sui ratti hanno seguito le linee guida vigenti in Francia, e sono stati approvati dal Comitato Etico locale (# 40.04, Università di Aix-Marseille Medical School, Marsiglia, Francia).

1 raccolta e congelamento Rat Brain

  1. Preparare articoli richiesti: azoto liquido (N 2liq.) In Dewar che è grande abbastanza per mantenere un morsetto di congelamento (almeno 2-3 L di volume); anestetico (ad esempio, isoflurano, o ketamina / xilazina); camera di anestesia; strumenti di dissezione sterili: forbici chirurgiche, bisturi, pinze; salviette di tessuto e bottiglia con la pulizia alcol (etanolo); aghi (25 G); 1 ml e 10 ml siringhe. Fogli di alluminio Label (ca. 10 x 10 cm) con nastro adesivo. Usare i fogli per avvolgere i singoli cervelli di ratto freeze-bloccato.
    NOTA: Indossare sempre guanti protettivi e occhiali di protezione degli occhi o maschera quando si maneggia l'azoto liquido!
  2. Riempire Dewar con N 2liq. Ed inserire gratismorsetto zing in un Dewar. Assicurarsi che la quantità di N 2liq nel Dewar è sufficiente per ripetute procedure di congelamento-clamp (diversi litri, la quantità di N 2liq evaporazione durante ogni freeze-bloccaggio dipende dalle dimensioni della pinza).
  3. Anestetizzare animale (ad esempio, da isoflurano, oppure mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina). Procedere a eutanasia mediante puntura cardiaca per prevenire le emorragie durante cuoio capelluto viene rimosso e il cranio è aperto. Passi 1,4-1,7 sotto descrivono la procedura standard.
    NOTA: Nei protocolli speciali che richiedono la massima conservazione del glucosio e ad alta energia metaboliti, il sacrificio ratto-imbuto congelamento del cervello dell'animale anestetizzato con N 2liq 11, dopo un ritorno del cuoio capelluto. Poi, sezionare il cervello dal cranio sotto intermittente N 2liq per minimizzare post mortem metabolismo 12.
  4. Inumidire testa di ratto con alcol per pulizia. Usare le forbici chirurgiche a (i) remove cuoio capelluto, e (ii) il cranio aperto lungo suture craniche.
  5. Usare pinze per aprire ulteriormente il cranio, e di togliere tutto il cervello da sotto il cranio aperto, posizionando la testa a testa in giù. Rimuovere subito eventuali tracce visibili di sangue utilizzando salviette di tessuto. Se emisferi cerebrali sono metabolicamente e morfologicamente simmetrica, è conveniente utilizzare uno degli emisferi per l'analisi metabolica dopo la separazione dalla emisfero mediante incisione con il bisturi. Se necessario, utilizzare l'emisfero rimanente per altri studi del cervello come istologia.
  6. Rapidamente rimuovere congelamento morsetto da N 2liq -filled Dewar, posizionare intero o metà cervello di ratto su una superficie interna, morsetto e inserire subito il congelamento morsetto in N 2liq -filled Dewar tenendo morsetto saldamente compressa. Assicurarsi che i punti 1.3-1.6 non durare più di 60 sec.
  7. Dopo 1-2 minuti togliere il congelamento morsetto dal Dewar, pinza aperta, allentare il tessuto cerebrale congelato dalla pinza, e avvolgeretessuti congelati in lamiera di alluminio opportunamente etichettati (vedi 1.1 sopra). Assicurarsi che l'etichetta sia leggibile e rimane saldamente in posizione dopo che il campione è avvolto. Introdurre rapidamente campione avvolto in N 2liq. Eseguire l'intera procedura il più rapidamente possibile per evitare lo scongelamento del tessuto cerebrale congelato.
  8. Conservare campione congelato in N 2liq o in un congelatore a -80 ° C fino al momento dell'estrazione metabolita.
    NOTA: Ogni volta che un campione biologico deve essere conservato per più di un anno, la conservazione a temperatura 2liq N è da preferire -80 ° C. Ciò vale anche per il resto di questo protocollo.

2 Preparazione del metabolita Estrazione procedura

  1. Preparare omogeneizzatore tessuto e provette corrispondenti (ad esempio, 10 mm di diametro interno, a seconda del diametro dell'albero omogeneizzatore, di solito in plastica). Utilizzare omogeneizzatori elettrici piuttosto che omogeneizzatori guidati manualmente (smerigliatrici tessuto). Prepare vortex e bilancia da laboratorio.
  2. Preparare secchio pieno di ghiaccio tritato. Tenere quantitites sufficiente di metanolo, cloroformio e acqua sul ghiaccio (4 ml ciascuno a 250-350 mg di tessuto cerebrale congelato).
  3. Preparare pipette di trasferimento e fiale.
    1. Preparare flaconcini di vetro (≥20 di volume ml) con tappo a vite e posto sul ghiaccio (una fiala ogni estratto di tessuto). Fit Tappi a vite con un resistente al cloroformio setti Teflon.
    2. Preparare 5 ml pipette di plastica per l'erogazione di metanolo e acqua, e pipette in vetro o siringhe Hamilton per l'erogazione cloroformio. Preparare pipette di plastica supplementari (5 o 10 ml di volume) per trasferire le miscele di tessuto omogenato e metanolo.
    3. Assicurarsi che tutta la vetreria è accuratamente risciacquato con acqua distillata e asciugato accuratamente prima dell'uso per rimuovere le tracce di impurità, in particolare formiato NMR-rilevabile e acetato.
  4. Riempire mortaio di porcellana con N 2liq, posto porcellana pestello nel mortaio e riempire con N 2liq. Azoto evapora fino a temperatura di mortaio e pestello è sufficientemente bassa. Tenere piccola quantità di N 2liq in mortaio.

3 Estrazione di metaboliti

  1. Rimuovere campione di tessuto cerebrale congelato dalla memoria (N serbatoio 2liq o -80 ° C freezer). Poi, trasferire immediatamente campione di tessuto per malta parzialmente riempiti con N 2liq.
  2. Utilizzare il N 2liq pestello -cold a rompere il tessuto cerebrale congelato in pezzi più piccoli che si adattano facilmente nelle provette utilizzate per la omogeneizzazione dei tessuti. Per evitare che pezzi di tessuto congelato venga proiettata fuori della malta nel processo, rompere il tessuto pur essendo avvolto in foglio di alluminio. Non macinare tessuti congelati in polvere in quanto ciò renderebbe il trasferimento al provetta più difficile (aumento del rischio di formazione di condensa). IMPORTANTE: Durante l'intera procedura, aggiungere N 2liq alla malta come necessario per mantenere il campione surgelati.
  3. Mix spezzi centro commerciale di tessuto cerebrale congelato a fondo, pesare 250-350 mg e trasferire in una provetta riempito di ghiaccio-freddo metanolo (4 ml per il tessuto cerebrale 250-350 mg). Ogni volta che pezzi di tessuto congelato si aggiungono, omogeneizzare questi immediatamente con l'omogeneizzatore tessuto.
    NOTA: Completare questa intera procedura rapidamente per evitare (i) significativa formazione di condensa sul campione che porterebbe ad una sovrastima del peso del campione, e (ii) il riscaldamento e scongelamento del campione. Pezzi di tessuto individuali devono essere in uno stato congelato all'inizio del processo di omogeneizzazione.
  4. Dopo l'ultimo pezzo del campione di cervello di ratto congelato è stato aggiunto alla provetta ed omogeneizzato, trasferire l'omogeneizzato in un flacone di vetro di volume ≥20 ml, vicino tappo a vite e lasciare riposare in ghiaccio per 15 min. Se il volume della provetta non è sufficientemente grande per ≥4 ml di metanolo, utilizzare un volume più piccolo metanolo per omogeneizzare una parte del tessuto cerebrale congelato, trasferire la miscela alfiala di vetro e continuare omogeneizzando i pezzi di tessuto residuo con metanolo fresco. Assicurarsi che il volume totale metanolo è di 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale.
  5. Aggiungere lo stesso volume di ghiaccio-freddo cloroformio (cioè, 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale) di omogenato, vortice accuratamente e lasciare riposare in ghiaccio per 15 min.
    NOTA: utilizzare sempre cappa chimica ventilato durante la manipolazione solventi volatili, in particolare il cloroformio!
  6. Aggiungere lo stesso volume di acqua (ad esempio, 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale) a omogenato, vortice accuratamente e lasciare riposare a -20 ° C per una notte.

4 Preparazione di separazione delle fasi ed evaporazione del solvente

  1. Preparare centrifuga a freddo (4 ° C, 13.000 xg al massimo raggio) e provette da centrifuga. Assicurarsi che questi ultimi sono ≥20 volume di ml, resistente al cloroformio, e in grado di sopportare forze centrifughe di 13.000 x g. Utilizzare provette di vetro dedicati ma risciacquare (come tutti articoli di vetro) con acqua distillata essereuso anteriore (vedi 2.3).
  2. Preparare accuratamente sciacquati pipette Pasteur in vetro e un propipettor appropriata (bulbo, pompa manuale pipetta, pipetta automatica aiuto / pipetta, ecc.).
  3. Preparare due ulteriori provette accuratamente sciacquati (≥15 di volume ml) per campione cervello, di cui uno ha bisogno di essere resistente al cloroformio (in vetro o teflon), l'altro a metanolo (fatta di resistente al metanolo, o vetro plastica).
  4. Preparare apparato evaporazione del solvente (disponibile in commercio o autocostruito). Assicurarsi che il dispositivo fornisce un flusso finemente controllata di gas di azoto secco che viene convogliata sulla superficie di una soluzione di estratto contenente solventi volatili (metanolo, cloroformio).
  5. Preparare due vassoi o secchi aggiuntivi pieni di ghiaccio: uno per il trasporto del campione sul ghiaccio, e un altro per mantenere i campioni a freddo durante il processo di evaporazione.
  6. Preparare liofilizzatore (freeze-asciugatrice) e materiali necessari per liofilizzazione: (i) una 50ml provetta da centrifuga o vuoto pallone basso per estratto, e (ii) N 2liq di congelare la fase acquosa di campioni (≤0.3 L per campione). Se si utilizza il tubo da centrifuga, preparare anche a livello di collo di bottiglia filtro vuoto adatto per liofilizzatore.

5. fase di separazione e di evaporazione del solvente

  1. Per la separazione di fase completa, trasferire il tessuto omogenato metanolo / cloroformio / acqua / cervello (vedi 3.6) in una provetta da centrifuga cloroformio-resistente (volume ≥20 ml) e centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 40 min.
    NOTA: Due fasi formeranno, separati da uno strato di proteina precipitata. La fase inferiore (più pesante) è costituito da metanolo, cloroformio e lipidi disciolti, mentre la fase superiore (accenditore) è costituito da acqua, metanolo e metaboliti idrosolubili disciolti.
  2. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire la fase superiore ad un appropriato tubo ml ≥15 (resistente al metanolo plastica o vetro). Tenere su ice.
  3. Utilizzare una pipetta Pasteur fresco per trasferire la fase inferiore ad un appropriato tubo ≥15 ml (vetro o Teflon). Tenere su ghiaccio.
  4. Conservare il livello di proteina precipitata a -80 ° C se deve essere utilizzato per la determinazione delle proteine ​​totali; oppure scartare.
  5. Mantenere il tubo con la fase acqua / metanolo (vedi 5.2) su ghiaccio e si evapora il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sulla superficie della soluzione di estratto. In alternativa, delicatamente bolla azoto attraverso la soluzione di estratto. Terminare il processo di evaporazione quando gorgogliare azoto non causa più la riduzione del volume della soluzione di estratto. In questo momento, continuare con liofilizzazione (vedere 5.7), o congelare e mantenere campione a -80 ° C con il tubo chiuso (tappo a vite o Parafilm) fino al momento liofilizzazione.
  6. Posizionare il tubo con la fase di metanolo / cloroformio (vedi 5.3) sul ghiaccio e far evaporare il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sul surfaccia della soluzione d'estrazione. Quando tutto il solvente viene evaporato, terminare il processo e mantenere il campione a -80 ° C con il tubo chiuso (tappo a vite o Parafilm) fino al momento analisi NMR.
  7. Preparare fase acquosa per Liofilizzazione
    1. Dopo la fine del processo di evaporazione del metanolo (vedi 5.5), trasferire il campione ad un risciacquato tubo da centrifuga da 50 ml (se il campione è congelato, scongelare prima del trasferimento). In alternativa, trasferire in un pallone a fondo tondo vuoto.
    2. Congelare soluzione di estratto ruotando tubo da centrifuga (o pallone a fondo tondo) parzialmente inserito nel N 2liq tale che la superficie interna del tubo o pallone viene progressivamente coperto da liquido congelato. Assicurarsi che nessun N 2liq. Può entrare nel recipiente.
    3. Quando tutto il liquido è congelato, coprire il tubo con un coperchio forato o tappo a vite per permettere al vapore di fuoriuscire, e porre il tubo in una bottiglia filtro a depressione a livello del collo.
    4. Inizia liofilizzazione dopo Attaching il pallone o flacone per il liofilizzatore.
  8. Terminare il processo di liofilizzazione quando il campione è completamente asciutto. Mantenere il campione a -80 ° C in un tubo chiuso (con un tappo a tenuta!) Finché utilizzata per l'analisi NMR.
    NOTA: Di solito non più di 24 ore sono necessarie per liofilizzazione. Diversi campioni possono essere liofilizzate contemporaneamente, a seconda del design del liofilizzatore, e se vengono utilizzate provette da centrifuga in bottiglie a collo largo o palloni a fondo tondo.

6 Preparazione di campioni NMR

  1. Conservare secchi e gli estratti liofilizzati a temperatura molto bassa (≤-80 ° C). Ridisciogliere liofilizzati per la preparazione dei campioni NMR immediatamente prima dell'esperimento NMR.
    NOTA: Memorizzazione di campioni in soluzione e / o temperatura ambiente può causare la degradazione del campione!
  2. Preparare una soluzione acquosa 200 mM dell'agente chelante, l'acido trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), come segue:
    1. Aggiungere acqua pura (ad esempio, 20 ml) in una provetta provetta o centrifuga, e aggiungere la quantità di CDTA polvere necessaria per generare una soluzione 200 mM.
      NOTA: Una parte sostanziale di CDTA non sarà solubile, perché il pH è molto basso in quanto la forma acida della CDTA è stato utilizzato, piuttosto che un sale CDTA.
    2. Aggiungere con cautela, passo dopo passo, aumentando quantità di polvere CsOH alla soluzione CDTA, e vortex accuratamente dopo ogni aggiunta.
      NOTA: La frazione solubile CDTA aumenterà con l'aumento del contenuto CsOH nella soluzione acquosa. Evitare "overtitration", vale a dire a meno di aggiungere la quantità stechiometrica di CsOH alla soluzione CDTA.
    3. Quando quasi tutta la polvere CDTA viene sciolta, iniziare a misurare il pH dopo ogni aggiunta CsOH e vortex approfondita. Terminare CsOH Inoltre quando il pH finale viene raggiunta (Tabella 1).
      NOTA: In questo momento, tutto il CDTA sarà sciolto. L'uso di Cs + come controione di CDTA è generalleato preferito su Na + o K +. Cs + è un acido di Lewis morbido grazie alla sua grande raggio ionico, al contrario di Na + e K +, che hanno minore raggi ionici e sono acidi forti. Di conseguenza, Cs + forma complessi con fosfati (basi dure) meno facilmente di quanto non facciano Na + e K +. Questo è vantaggioso per 31 P spettroscopia NMR di metaboliti fosforilati perché complessazione tende ad aumentare larghezze di riga NMR, in particolare in condizioni di lenti a scambio ionico intermedio.
  3. Per 31 P NMR analisi dei fosfolipidi (PL), dissolvono lipidi essiccati (vedi 5.6) in 700 ml di una miscela solvente costituita da cloroformio deuterato (CDCl 3), metanolo e la soluzione CDTA preparato come descritto al punto 6.2 (5: 4: 1 rapporto in volume). Trasferire il campione in una provetta. Usa-spostamento diretto (o volumetrica) micropipetta con cloroformio-resisteresuggerimenti formica in entrambe le fasi.
    NOTA: Tenere presente che la modifica dei seguenti parametri influenzerà l'aspetto (chemical shift e la larghezza delle linee) di PL 31 P NMR 13-17:
    (I) rapporto volume CDCl 3: soluzione CDTA: MeOH
    (Ii) il volume di solvente totale utilizzata
    (Iii) il pH della componente acquosa del solvente
    (Iv) concentrazione CDTA della componente acquosa del solvente.
    NOTA: In generale, la messa a punto di questi parametri del campione (Tabella 1) non è necessaria, e deve essere effettuata con estrema cura, se desiderato, in casi particolari. Modifica del volume tra solventi facilmente provoca la formazione di un sistema costituito da due fasi invece di una fase omogenea! Il sistema monofase è risultato essere più pratico rispetto al sistema a due fasi nella maggior parte delle applicazioni 13,14.
  4. Per analisi 1 H NMR di metaboliti idrosolubili, sciogliere liofilizzato (vedi 5.8) in 700 microlitri ossido di deuterio (D 2 O) contenente 3 (trimetilsilil)-propionico 2,2,3,3-d4 sale sodico (TSPD 4) nell'intervallo millimolare (D 2 O contenente 0,05% TSPD 4 è disponibile in commercio) . Trasferire il campione in una provetta.
  5. Regolare il pH della soluzione risultante estratto acquoso di 7.3 con l'aggiunta di piccole quantità (circa 2 ml) di cloruro di deuterio (DCL) e soluzioni deuterossido sodio (INCD). In primo luogo, iniziare con 0,02 N soluzioni DCL o INCD. Se 2 o 3 integrazioni successive non provocano sufficiente il cambiamento di pH, continuare con 0,2 N soluzioni DCL o INCD. Fare attenzione a non overtitrate.
    NOTA: L'importo complessivo di soluzione di DCL o INCD necessaria dipende dalla quantità di tessuto cerebrale estratto; notare che questo valore per una precisa quantificazione metabolita. Nella maggior parte dei casi i volumi combinati delle aggiunte soluzioni DCL e INCD dovrebbero essere praticamente trascurabile (quasi l'1% del volume del campione NMR).
TITOLO "> 7. svolgimento dell'esperimento 31 P NMR per Brain Phospholipid Analysis 13,14

  1. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un spettrometro NMR multinucleare ad alta risoluzione (≥9.4 Tesla di campo, corrispondente a 162 MHz 31 P, o 400 MHz 1 frequenze di risonanza H). Oltre la bobina 31 P, assicurarsi che la sonda 31 P NMR possiede una bobina 1 H per protone disaccoppiamento. Impostare la regolazione della temperatura della sonda NMR di valore nominale desiderato (di solito 25 ° C).
    NOTA: la temperatura della sonda potrebbe essere necessario 10-20 minuti per stabilizzare!
  2. Soluzione Centrifuga PL estratto in provetta (vedi 6.3) a 4 ° C e 11.000 xg per 30 min a girare giù residui solidi nel campione. Trasferire 600 ml di surnatante in un tubo NMR di alta qualità (diametro esterno 5 mm).
  3. Preparare appropriato gambo inserto coassiale riempito con un methylenediphosphonate acquosa 20 mM di soluzione (MDP) a pH 7.0 per chimico-shift riferimentoe quantificazione. Mettere questo inserto nel tubo NMR riempito con soluzione di estratto di PL.
  4. Montare il tubo NMR con l'ogiva e il trasferimento opportuno magnete NMR. Ora ruotare il campione a 15-20 Hz e attendere fino a quando il campione si è adattato alla temperatura impostata (ca. 10 min).
  5. Minimizzare cura disomogeneità di campo magnetico attraverso campione regolando in asse e fuori asse correnti bobina spessore 18.
  6. Impostare NMR parametri di acquisizione dello spettro di valori ottimali, che possono variare in funzione di intensità di campo magnetico (per un sistema 9.4 T, si veda la Tabella 1 per i valori dei parametri raccomandati).
  7. Impostare il numero di transitori per esperimento (= NS).
    1. Impostare NS a circa 80 (durata totale dell'acquisizione dati circa 20 minuti) se solo i PL più diffuse devono essere quantificato con precisione (fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolamina (PtdEtn), etanolammina plasmalogen).
    2. Impostare NS a circa 100-200 (durata totale dacquisizione ata 1-2 ore) se PLs meno concentrati sono da quantificato (alchil-acil-fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina, acido fosfatidico).
    3. Impostare NS a circa 1.500-2.000 (durata totale dell'acquisizione dati 7-10 h; esperimento durante la notte) se PLs molto-basso-concentrazione devono essere quantificato, ad esempio mono fosfatidilinositolo e difosfati (PtdIP e PtdIP 2), cardiolipina, liso-PL , alchil-acil-fosfatidiletanolamina, e occasionalmente altri.
  8. Dopo la fine della acquisizione dello spettro, processo di decadimento di induzione libera (FID) con parametri ottimizzati. I valori di questi parametri variano in funzione della forza di campo magnetico, qualità spessore, e il segnale PL da quantificare.
    1. Per ottenere i migliori risultati per l'intera gamma di PL, ripetere l'elaborazione utilizzando multipla (almeno due) diverse procedure di filtraggio. Utilizzare forte miglioramento della risoluzione per i segnali fortemente sovrapposti, ad es., Per PtdCho e PtdEtnregioni.
    2. Utilizzare forte filtraggio (debole o nessun miglioramento della risoluzione) per i segnali deboli.
    3. Filtro segnali molto deboli e larghe, senza significative sovrapposizioni da apodizzazione (ad esempio, LB = 3 Hz) per aumentare segnale-rumore, ad esempio PtdIP e PtdIP 2. Vedere la Tabella 1 per i parametri di elaborazione caratteristici.
  9. Quantificare l'area di ogni segnale PL rispetto alla zona sotto il segnale del composto di riferimento (MDP) nello stesso spettro.
  10. Calibrare il segnale del composto di riferimento (MDP) in un esperimento separato, utilizzando un tubo NMR 5 millimetri riempito con (i) un composto di fosforo di concentrazione nota, e (ii) l'inserto stesso stelo coassiale utilizzato in esperimenti PL 31 P NMR ( vedi 7.3 e 7.9).
  11. Calcola concentrazione singola PL basato sulle aree relative dei segnali PL da un lato (vedi 7.9), e il valore di calibrazione ottenute per MDP daInserto coassiale dall'altro (vedi 7.10). Si tenga conto che il numero di nuclei di fosforo contribuiscono ad un particolare segnale NMR 31 P può variare in funzione dell'origine molecolare di tale segnale.
    NOTA: Il segnale phosphonate MDP (di solito riferito a 19.39 ppm) rappresenta due nuclei di fosforo, così come il segnale cardiolipina fosfato. Tutti gli altri segnali NMR PL 31 P rilevati in estratti cerebrali rappresentano un nucleo fosforo ciascuno.
  12. Utilizzare un software di statistiche come necessario per confrontare i livelli di PL cerebrali tra i gruppi di animali.

8 svolgimento dell'esperimento 1 H NMR per l'analisi di acqua-solubile metaboliti cerebrali

  1. Impostare la regolazione della temperatura della sonda 1 H NMR al valore nominale desiderato (di solito 25 ° C). Osservazioni Vedere anche 7.1.
  2. Centrifugare la soluzione di estratto acquoso in provetta (vedi 6.5) a 4 ° C e 11.000xg per 30 min a spin down residui solidi nel campione. Trasferire 600 ml di surnatante in un tubo NMR di alta qualità (diametro esterno 5 mm).
  3. Trasferimento tubo NMR a magnete NMR, spessore e impostare spettro NMR parametri di acquisizione a valori ottimali come spiegato in 7,4-7,6. Per i valori dei parametri raccomandati Vedi anche Tabella 1.
  4. Impostare il numero di transitori per esperimento a circa NS = 32 (durata totale dell'acquisizione dati ca. 13 min). Per ottenere buoni rapporti segnale-rumore per segnali molto deboli, in particolare nella regione aromatica, utilizzare NS = 64 (durata totale dell'acquisizione dati ca. 26 min) o più.
  5. Dopo la fine della acquisizione dello spettro, processo di decadimento di induzione libera (FID) con parametri ottimizzati. I valori di questi parametri variano leggermente in funzione di forza del campo magnetico, la qualità spessore, e il segnale metabolita da quantificare.
    NOTA: Nella maggior parte dei casi, è sufficiente per trattare ogni spettro una volta, Impiegando un insieme di parametri di lavorazione che presentano un buon compromesso per tutti i segnali di metaboliti. Vedere la Tabella 1 per i parametri di elaborazione caratteristici.
  6. Quantificare l'area di ogni segnale metabolita (spesso un multipletto, talvolta sovrapposizioni con altre singlets o multipletti derivanti da differenti molecole) rispetto alla zona sotto il segnale del composto di riferimento (TSP-d 4) nello stesso spettro.
  7. Calcolare le concentrazioni del metabolita individuali basate su TSP-d 4 concentrazione (vedi 6.4). Si tenga conto che il numero di protoni che contribuiscono ad un particolare segnale NMR 1 H, possono variare in funzione della provenienza molecolare di tale segnale. Il segnale TSP-d 4 trimetil (riferiti a 0,0 ppm) rappresenta nove protoni.
  8. Utilizzare un software di statistiche come necessario per confrontare i livelli di metaboliti cerebrali tra i gruppi di animali.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Per ottenere la migliore risoluzione in metabolica spettri NMR di cervello e di altri estratti tissutali, è stato a lungo una pratica comune per rimuovere o ioni metallici (maschera più importante: ioni paramagnetici) presenti nelle soluzioni di estratto. Ciò è stato ottenuto mediante aggiunta di un agente chelante come EDTA o CDTA all'estratto 19, o facendo passare l'estratto attraverso una resina a scambio ionico, come Chelex-100 20. I risultati presentati in Figura 1, dimostrano...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Spettroscopia NMR è un metodo efficiente per la misurazione delle concentrazioni di composti chimici in soluzione in modo molto accurato e riproducibile. Tuttavia, per ottenere dati di alta qualità, è necessario rispettare alcune norme in materia di preparazione e analisi del campione. Nella determinazione di concentrazioni di metaboliti mediante spettroscopia NMR, né la generazione né la ricezione del segnale NMR domina l'errore di quantificazione, a meno che l'intensità di un segnale osservato avvicina alla so...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il sostegno del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 e 7339) è ringraziato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IsofluranoVirbacVetfluranoAnestetico per animali
Vaporizzatore di isofluranoOhmedaIsotec 3Modello più recente disponibile: Isotec 4
Bisturi, forbici, pinze, morsettiHarvard Apparatus
Fisher Scientific		various
varie		Attrezzature chirurgiche per animali
Freeze-clamp toolhomebuiltn/aPinza con piastre in alluminio, da inserire
in azoto liquido per raffreddamento
DewarNalgene4150-4000
Azoto liquidoAria Liquidan/a
Azoto gassosoAria Liquidan/a
Evaporatore di azotoOrganomation AssociatesN-EVAP 111Può essere sostituito da un dispositivo autocostruito
MortarSigma-Aldrich
PestelloSigma-AldrichZ247510
Omogeneizzatore tissutaleKinematicaPolytronCon raccordo per provette albero omogeneizzatore
Bilancia elettronicaSartoriusn/a
MetanoloSigma-AldrichM3641
CloroformioSigma-Aldrich366910
Provette da centrifuga in vetroKimble45500-15, 45500-30Kimax 15 ml, provetta da 30 ml
Provette per microcentrifugaKimble45150-2Kimax provetta da 2 ml; sostituire la provetta "Eppendorf" se compatibile con il rotore della centrifuga
Pipette in polistireneCostar CorningStripettesvolumi da 5 e 10 ml
DeuterocloroformioSigma-Aldrich431915deuterato al 99,96%
Ossido di deuterioSigma-Aldrich42345999,96% deuterato
Cloruro di deuterioAlpha Aesar4240620% in ossido di deuterio
Deuterossido di sodioSigma-Aldrich16448830% in ossido di deuterio
LiofilizzatoreCristoAlpha 1-2
Centrifuga a freddoHeraeusMegafuge 16R
pHmetroEutech CyberneticsCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
Idrossido di cesioSigma-Aldrich516988
provette NMRWilmad528-PP
Inserto coassiale con steloNMR Sigma-AldrichZ278513By Wilmad
PipetteNMR Sigma-AldrichZ255688
PipetteEppendorfResearchCon puntali per volumi da 0,5 a 1.000 μ l
Pipet-AidSpettrometroXP
BrukerAVANCE 400con sonda e altri accessori
Software NMRBrukerTopSpin 1.3versione più recente disponibile: Topspin 3.2
Composti standard solubili in acquaSigma-Aldrichvari
compostistandard fosfolipidiAvanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		vari
vari
vari		Fonte per plasmalogeni, ma può essere < 70 - 80% di purezza
MetilenedifosfonatoSigma-AldrichM9508
TSP-d4Sigma-Aldrich269913
Z247472 NMR Drummond

Riferimenti

  1. Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5(2008).
  2. Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1(2012).
  3. Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
  4. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
  5. Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
  6. Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
  7. Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157(2007).
  8. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  9. Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
  10. Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  11. Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
  12. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
  13. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
  14. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  16. Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101(2013).
  17. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
  18. Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
  19. Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
  20. Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Spettroscopia NMRestratti di tessuto cerebraleomogeneizzazione dei tessutimetanolo cloroformio acquaprocesso di liofilizzazioneanalisi dei fosfolipidiNMR ad alta risoluzioneprofilazione dei metaboliti

Articoli correlati