Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Sommario

La neurochimica del cervello dei mammiferi è cambiata in molte malattie neurologiche e sistemiche. I profili caratteristici dei metaboliti cerebrali possono essere ottenuti in modo efficiente sulla base di estratti grezzi di tessuto cerebrale. A tal fine, viene impiegata la spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che consente un'analisi quantitativa dettagliata delle concentrazioni di metaboliti (metabolomica).

Abstract

Gli studi sull'espressione genica sui livelli di RNA e proteine sono stati a lungo utilizzati per esplorare i processi biologici alla base della malattia. Più recentemente, la genomica e la proteomica sono state integrate da un'analisi quantitativa completa del pool di metaboliti presenti nei sistemi biologici. Questa strategia, chiamata metabolomica, mira a fornire una caratterizzazione globale del complemento di piccole molecole coinvolto nel metabolismo. Mentre il genoma e il proteoma definiscono i compiti che le cellule possono svolgere, il metaboloma fa parte del fenotipo vero e proprio. Tra i metodi attualmente utilizzati in metabolomica, le tecniche spettroscopiche sono di particolare interesse perché consentono di analizzare simultaneamente un gran numero di metaboliti senza una selezione preventiva per specifiche vie biochimiche, consentendo così un approccio ampio e imparziale. Qui viene presentato un protocollo sperimentale ottimizzato per l'analisi metabolomica mediante spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che è il metodo di scelta per una quantificazione efficiente dei metaboliti tissutali. Importanti punti di forza di questo metodo sono (i) l'uso di estratti grezzi, senza la necessità di purificare il campione e/o separare i metaboliti; ii) la natura intrinsecamente quantitativa della RMN, che consente la quantificazione di tutti i metaboliti rappresentati da uno spettro NMR con un solo composto di riferimento; e iii) la natura non distruttiva della RMN che consente l'uso ripetuto dello stesso campione per misurazioni multiple. L'intervallo dinamico delle concentrazioni di metaboliti che possono essere coperte è considerevole a causa della risposta lineare dei segnali NMR, sebbene i metaboliti che si verificano a concentrazioni estremamente basse possano essere difficili da rilevare. Per i composti meno abbondanti, il metodo della spettrometria di massa altamente sensibile può essere vantaggioso, sebbene questa tecnica richieda procedure di preparazione e quantificazione del campione più complesse rispetto alla spettroscopia NMR. Presentiamo qui un protocollo NMR adattato all'analisi del cervello di ratto; Tuttavia, lo stesso protocollo può essere applicato ad altri tessuti con piccole modifiche.

Introduzione

Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello ^1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l'espressione genica a RNA e / o livelli di proteine ​​da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall'altro ^2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi ^7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ul....

Protocollo

NOTA: ANIMAL DICHIARAZIONE ETICA
Gli studi sugli animali sui ratti hanno seguito le linee guida vigenti in Francia, e sono stati approvati dal Comitato Etico locale (# 40.04, Università di Aix-Marseille Medical School, Marsiglia, Francia).

1 raccolta e congelamento Rat Brain

1. Preparare articoli richiesti: azoto liquido (N _2liq.) In Dewar che è grande abbastanza per mantenere un morsetto di congelamento (almeno 2-3 L di volume); anestetico (ad esempio, isoflurano, o ketamina / xilazina); camera di anestesia; strumenti di dissezione sterili: forbici chirurgiche, bisturi, pinze; salviette di tessuto e bot....

Risultati

Per ottenere la migliore risoluzione in metabolica spettri NMR di cervello e di altri estratti tissutali, è stato a lungo una pratica comune per rimuovere o ioni metallici (maschera più importante: ioni paramagnetici) presenti nelle soluzioni di estratto. Ciò è stato ottenuto mediante aggiunta di un agente chelante come EDTA o CDTA all'estratto ^19, o facendo passare l'estratto attraverso una resina a scambio ionico, come Chelex-100 ^20. I risultati presentati in Figura 1, dimostrano.......

Discussione

Spettroscopia NMR è un metodo efficiente per la misurazione delle concentrazioni di composti chimici in soluzione in modo molto accurato e riproducibile. Tuttavia, per ottenere dati di alta qualità, è necessario rispettare alcune norme in materia di preparazione e analisi del campione. Nella determinazione di concentrazioni di metaboliti mediante spettroscopia NMR, né la generazione né la ricezione del segnale NMR domina l'errore di quantificazione, a meno che l'intensità di un segnale osservato avvicina alla so.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isoflurano	Virbac	Vetflurano	Anestetico per animali
Vaporizzatore di isoflurano	Ohmeda	Isotec 3	Modello più recente disponibile: Isotec 4
Bisturi, forbici, pinze, morsetti	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various varie	Attrezzature chirurgiche per animali
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Pinza con piastre in alluminio, da inserire in azoto liquido per raffreddamento
Dewar	Nalgene	4150-4000
Azoto liquido	Aria Liquida	n/a
Azoto gassoso	Aria Liquida	n/a
Evaporatore di azoto	Organomation Associates	N-EVAP 111	Può essere sostituito da un dispositivo autocostruito
Mortar	Sigma-Aldrich
Pestello	Sigma-Aldrich	Z247510
Omogeneizzatore tissutale	Kinematica	Polytron	Con raccordo per provette albero omogeneizzatore
Bilancia elettronica	Sartorius	n/a
Metanolo	Sigma-Aldrich	M3641
Cloroformio	Sigma-Aldrich	366910
Provette da centrifuga in vetro	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, provetta da 30 ml
Provette per microcentrifuga	Kimble	45150-2	Kimax provetta da 2 ml; sostituire la provetta "Eppendorf" se compatibile con il rotore della centrifuga
Pipette in polistirene	Costar Corning	Stripettes	volumi da 5 e 10 ml
Deuterocloroformio	Sigma-Aldrich	431915	deuterato al 99,96%
Ossido di deuterio	Sigma-Aldrich	423459	99,96% deuterato
Cloruro di deuterio	Alpha Aesar	42406	20% in ossido di deuterio
Deuterossido di sodio	Sigma-Aldrich	164488	30% in ossido di deuterio
Liofilizzatore	Cristo	Alpha 1-2
Centrifuga a freddo	Heraeus	Megafuge 16R
pHmetro	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Idrossido di cesio	Sigma-Aldrich	516988
provette NMR	Wilmad	528-PP
Inserto coassiale con stelo	NMR Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
Pipette	NMR Sigma-Aldrich	Z255688
Pipette	Eppendorf	Research	Con puntali per volumi da 0,5 a 1.000 μ l
Pipet-Aid	Spettrometro	XP
	Bruker	AVANCE 400	con sonda e altri accessori
Software NMR	Bruker	TopSpin 1.3	versione più recente disponibile: Topspin 3.2
Composti standard solubili in acqua	Sigma-Aldrich	vari
composti	standard fosfolipidiAvanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	vari vari vari	Fonte per plasmalogeni, ma può essere < 70 - 80% di purezza
Metilenedifosfonato	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913

Z247472 NMR Drummond