In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

Sommario

A seguito dell'esposizione a specifici fattori di stress ambientale, il nematode Caenorhabditis elegans subisce un'ampia plasticità fenotipica per entrare in uno stadio giovanile 'dauer' resistente allo stress. Presentiamo metodi per l'induzione controllata e l'imaging della neuroplasticità durante il dauer.

Abstract

I meccanismi che controllano lo stress-indotta plasticità fenotipica di animali sono spesso complesse e difficili da studiare in vivo. Un classico esempio di plasticità indotta da stress è la fase dauer di C. elegans. Dauers sono uno stadio larvale di sviluppo alternativo formata in condizioni di basse concentrazioni di cibo batterica e alte concentrazioni di un feromone dauer. Dauers visualizzare ampia plasticità evolutiva e comportamentale. Ad esempio, un set di quattro quadranti interno-labiale (IL2Q) neuroni soggetta ad un esteso rimodellamento reversibile durante la formazione dauer. Utilizzando la ben nota voce di percorsi ambientali di regolazione dauer, un metodo precedentemente stabilito per la produzione di greggio dauer feromone da grandi culture nematodi liquido è dimostrata. Con questo metodo, una concentrazione di 50.000 - 75.000 nematodi / ml di coltura liquido è sufficiente a produrre una molto potente greggio dauer feromone. La potenza feromone greggio è determined da un saggio biologico dose-risposta. Infine, sono descritti i metodi utilizzati per in vivo time-lapse imaging dei IL2Qs durante la formazione dauer.

Introduzione

Plasticità fenotipica, tra cui plasticità evolutiva e comportamentale, è importante per adattamenti alle condizioni ambientali avverse ed è considerato una forza trainante nell'evoluzione ^1. C. elegans è un organismo modello utilizzato frequentemente per gli studi di sviluppo e neurobiologia. In condizioni ideali, C. elegans si sviluppa attraverso quattro stadi larvali prima di entrare nella fase riproduttiva adulto. Tuttavia, in condizioni di scarsa disponibilità di cibo e di alta densità di popolazione, C. elegans può subire un interruttore di sviluppo e di entrare in una fase di lunga durata e resistente alle sollecitazioni dauer ^2. Dauers mostrano molte differenze morfologiche e comportamentali da non dauers che probabilmente mediano questa resistenza allo stress. Gli stimoli ambientali e percorsi genetici che regolano l'ingresso dauer sono stati ampiamente descritti ^{3, 4, 5, 6, 7.} Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le singole modifiche fenotipiche che si verificano durante formazione dauer sono meno ben compreso.

L'esame di fenotipi specifici-Dauer richiede la produzione di animali Dauer. Questo può essere realizzato in tre modi: 1) Picking da una cultura affamato di C. elegans, 2) Uso della formazione dauer costitutiva (daf-c) mutanti, 3) induzione della formazione dauer attraverso feromone purificato. E 'relativamente semplice per scegliere dauers da una piastra standard NGM con una C. popolazione elegans che ha esaurito il suo batterica di approvvigionamento alimentare. Nelle nostre mani, una piastra standard NGM originariamente seminato con 50 ml di OP50 Escherichia coli, ha permesso di crescere per 3 giorni e successivamente inoculate con 3 - 4 adulti ermafroditi mantenuta a 25 ° C, si esaurirà la fornitura di cibo entro una settimana e produrre diverse migliaia dauers all'interno di un ulteriore 3 giorni (oltre a numerosi non-dauers affamati). Tuttavia, questo metodo non è soddisfacente per i processi che si verificano durante l'esame muta in dAuer. E 'difficile determinare quale delle diverse migliaia di animali su un piatto tipico Starved stanno entrando in dauer. Inoltre, l'uso di una piastra di fame non offre alcuna possibilità di sincronizzazione. L'uso di mutanti daf-c consente la sincronizzazione e la generazione affidabile di dauers. Tuttavia, non vi è alcuna garanzia che una particolare daf-c mutazione non influirà altri fenotipi specifici-Dauer da solo o in combinazione con altre mutazioni.

La presenza di un feromone dauer stato implicito Cassada e Russell e successivamente dimostrato da Golden e Riddle. Il feromone dauer da allora è stato caratterizzato chimicamente ^{2, 8, 9, 10.} Feromone purificato è costituito da una miscela complessa di ascarosides, che in forme diverse a regolare entrambi i processi comportamentali e di sviluppo ^{9, 11.} L'uso di un estratto di feromone greggio dauer permette di induzione affidabile controllata di dauers sincronizzati in uno sfondo wild-type.

Il sistema nervoso e le cellule gliali associate subiscono rimodellamento durante dauer larva formazione ^{12, 13, 14.} Alcuni di questi cambiamenti sono irreversibili, come ad esempio la ristrutturazione delle cellule gliali durante dauer ^{13, 14.} Tuttavia altri eventi di rimodellamento sono reversibili dopo un ritorno favorevole condizioni ambientali. Ad esempio, una serie di quattro neuroni IL2Q subiscono una rapida e reversibile rimodellamento neuronale durante la formazione dauer tra cui: arborizzazione dei dendriti, un passaggio da singolo dendritiche ai neuroni e assoni multidendritic rimodellamento ^12. I metodi consentono qui per imaging attendibile in vivo di neuroplasticità indotta da stress in un organismo modello. I metodi presentati per la produzione e la sperimentazione di greggio dauer feromone sono precedentemente descritti e compilati da diverse fonti ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocollo

1 Crude Dauer feromone Produzione

1. Grow OP50 E. coli da una singola colonia O / N a 37 ° C sotto agitazione in 100 ml di brodo LB a 200 rpm. NOTA: Questo / cultura O N può essere fatta in anticipo e conservato a 4 ° C.
2. Grow N2 C. elegans il 15-20 Giugno piatti cm Petri con NGM agar (vedi ricetta nella tabella 1), testa di serie con 50 ml di OP50 E. coli fino a quando il batterio è quasi esaurito ^19.
3. Fai 5x 250 ml di S supporti (vedi ricetta nella tabella 1) in 1 L beute ^19. NOTA: Questa soluzione può essere effettuato in anticipo.
4. Coltivare una cultura di OP50 E. coli in 4 l di brodo LB O / N inoculando con 1 ml di OP50 in E. coli e agitazione a 37 ° C per 16 ore.
5. Lavare i nematodi da piastre (passo 1.2) con 1 ml di soluzione S basale (vedi ricetta nella tabella 1) e di trasferimento nematodi 4-5 piastre in ciascuna delle 4 1 L Erlenmeyer palloni con i media S preparata al punto 1.3 (a 4 5 piattiper ogni pallone) ^19.
6. Centrifugare la OP50 dal punto 1.4 a 650 xg per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere ogni pellet batterico in 10 ml di soluzione S basale. Trasferire la stessa quantità di batteri risospese ad ogni pallone di nematodi.
7. Collocare i flaconi in un agitatore orbitale a temperatura ambiente (20 - 25 ° C) e 100 - 150 rpm per 4 - 5 giorni fino a quando la soluzione inizia a cancellare, indicando una deplezione di cibo.
8. Una volta che il cibo è esaurito, crescerà un'altra cultura O / N di OP50 E. coli in 4x 1 l di brodo LB. Centrifugare i batteri a 650 xg per 10 minuti e aggiungere una pallina da un pallone a ciascuno dei palloni S multimediali con nematodi. Restituire i palloni S media per l'agitatore orbitale, come al punto 1.7, per altri 3-4 giorni fino a quando il cibo si esaurisce di nuovo.
9. Dai ~ 1 ml aliquota della soluzione da ciascuna beuta e stimare la concentrazione nematode da sub-campionamento 1 microlitri da ogni 1 ml aliquota e contando il numero di nematodi. NOTA: L'popolazione di nematodi dovrebbe essere 50.000 - 75.000 nematodi / ml. A questa concentrazione la maggior parte dei nematodi sono dauers.
10. Eliminare eventuali fiaschi contaminati. NOTA: La contaminazione si manifesta frequentemente come ife fungine visto durante la fase 1.9.
11. Nematodi Centrifugare a 4000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il pellet nematode e conservare il surnatante. In alternativa, consultare la discussione per l'utilizzo di questi animali per fare un feromone a bassa potenza.
12. Filtrare il surnatante con # 1 carta da filtro Whatman. NOTA: Una boccetta di vuoto sarà accelerare questo processo.
13. Inoltre Filtrare il surnatante con unità di filtrazione a vuoto sterile 0,45 micron. NOTA: filtrato può essere conservato O / N a 4 ° C o procedere a 1.14.
14. Aggiungere il filtrato in un becher da 2 L con un ancoretta. Mettere in una cappa su una piastra riscaldante scalpore. Portate ad ebollizione mescolando ed evaporare a circa 200 ml. Trasferire la soluzione in un becher da 500 ml. Continuare l'ebollizione fino a circa 50 ml sono left. NOTA: Si deve prestare attenzione durante questa fase in quanto è possibile per la soluzione a bollire sopra. Il colore finale 50 ml è un marrone scuro. In qualsiasi momento durante il processo di cottura, il calore può essere spento e il filtrato O / N conservato a temperatura ambiente oa 4 ° C.
15. Lasciate raffreddare e centrifugare per 5 minuti a 1000 x g. Versare il surnatante in un becher da 100 ml e scartare il pellet.
16. Lessare il surnatante verso il basso per una crosta marrone. Togliere dal fuoco e rompere la crosta con una spatola. Aggiungere sufficiente etanolo 200 prova a coprire la crosta. Coprire il becher con Parafilm e lasciate riposare O / N a RT. Eliminare l'etanolo in un bicchiere pulito e messo a lato. Aggiungere etanolo fresco per coprire la crosta. Ripetere estrazioni O / N 3 volte. Si riuniscono gli estratti.
17. Utilizzare una pompa a vuoto per asciugare gli estratti di etanolo. Se una pompa a vuoto non è disponibile, aggiungere l'estratto etanolico di un becher pulito e caldo a 50 ° C sotto agitazione in una cappa aspirante. NOTA: Una volta che l'etanolo è evaporato un residuo appiccicoso di light colore marrone deve rimanere. Se si usa il riscaldamento, la cura dovrebbe essere presa per non bruciare la soluzione di riscaldamento per troppo tempo.
18. Disciogliere il residuo in 10 ml di acqua distillata sterile. Filtro sterilizzare questa soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron e conservare a -20 ° C in aliquote di 1 ml. NOTA: 1 ml di acqua viene utilizzata per sciogliere il residuo per ogni 100 ml di coltura nematode liquido originale. Ad esempio, se una delle fiasche di coltura liquido viene scartato a causa della contaminazione, quindi regolare la quantità di acqua utilizzata per sciogliere il residuo.

2 Determinazione del feromone Dose Response

1. Preparare dauer feromone facendo 6x 5 ml di NGM media con Noble agar senza peptone, e integrato con 50 mg / ml di streptomicina solfato e una serie di dauer feromone (vedi ricetta in Tabella 1) ^{4, 19.} Miscelare i componenti in un 13x100 mm provetta di vetro, bollire sopra un becco Bunsen, e poi versare in tre centimetri piastre di Petri.
2. Pesare amtubo icrocentrifuge. Aggiungere 1 ml di O / N coltura di E. coli OP50 al tubo e centrifugare a ~ 17.000 xg in una provetta. Rimuovere tutto il surnatante. Pesare nuovamente il tubo e determinare il peso del pellet batterico. Risospendere il pellet con tampone M9 (vedi ricetta in Tabella 1) per una concentrazione finale di 4% ^(w / _v). Aliquotare 10 microlitri della sospensione batterica sul centro di ciascuna piastra feromone ^4. Conservare le piastre O / N a RT.
3. Scegli 10-15 gravide N2 wild-type ermafroditi un giorno dopo la muta in età adulta sulle piastre feromoni ^4. Conservare le piastre a 25 ° C per 3 - 4 ore.
4. Scegli fuori tutti i ermafroditi adulti. Registrare il numero di uova deposte per ogni piatto. Sigillare le piastre con parafilm e ritornare a 25 ° C per 3 giorni ^17.
5. Contare la percentuale di dauers (Figura 2). Nota: Per entrambi i metodi, è importante notare che dauers (e ad un ex minoretenda non dauers) salirà sulle pareti e sul coperchio delle piastre di Petri. E 'quindi importante esaminare tutte le superfici del piatto per nematodi.
6. Montare i dati ad una curva dose-risposta e stimare la concentrazione CE ₉₀ del feromone (feromone sufficiente ad indurre il 90% degli animali per formare dauers) come mostrato in Figura 3 Nota:. Usiamo tipicamente un modello di regressione logistica per stimare la CE ₉₀ , ma diversi pacchetti software statistici possono avere metodi alternativi che producono stime simili.

3 Immagini dal vivo di Dauer IL2 neuroni

1. Preparare piatti dauer feromoni come nel protocollo 2 utilizzando il valore EC ₉₀ determinata al punto 2.6.
2. Indurre dauers utilizzando i metodi del protocollo 2 con un ceppo che trasporta un giornalista transgene integrato IL2 (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P _KLP-6 :: tdTomato] o qIs56 [P _lag-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} NOTA: Se si utilizza q Is56, espressione di GFP non sarà visibile nei IL2Qs fino a diverse ore nel molt dauer e alcuni degli eventi di rimodellamento iniziali non saranno visibili. Inoltre, mentre il segnale fluorescente dalla P _lag-2 :: GFP transgene è in definitiva più luminoso nelle IL2s durante dauer rispetto ai _{6 KLP-reporter} fluorescenti P, la P _lag-2 :: transgene GFP esprime anche debolmente nei muscoli della testa che può mascherare i bei rami IL2.
3. Dopo la deposizione delle uova, rimuovere gli ermafroditi adulti, sigillare le piastre con Parafilm e incubare per 34 ore a 25 ° C ^17. NOTA: La lunghezza del tempo per la muta dauer varia leggermente da individuo a individuo. La rapida periodo più di dendrite arborizzazione inizia 4-5 ore dopo l'inizio della muta dauer (39-44hr dopo la deposizione delle uova a 25 ° C) ^12.
4. Il giorno prima di imaging, costituiscono una soluzione di 10% ^(w / _v) agarosio in tampone M9 con dauer feromone alla concentrazione CE _90. Aliquota circa 100 ml di agarosio su un vetrino da microscopio e rapidamente, ma delicatamente, posizionare un'altra diapositiva in alto per creare una superficie piana agarosio. Dopo l'agarosio si è solidificato, avvolgere le diapositive saran wrap e conservare in una camera umida (scatola punta della pipetta con tovaglioli di carta bagnati).
5. Dopo il periodo di incubazione 34 ore, esaminare le piastre di feromone per nematodi che hanno smesso faringeo pompaggio. Scivoli separati in modo tale che una sola superficie di un vetrino ha agarosio su di esso. Scegli uno o più nematodi su un pad agarosio del 10% e 1 μ l di 0,1 micron sferette di polistirene ^22. NOTA: Con una popolazione ben sincronizzato, la maggior parte dei nematodi sul piatto entrerà nella muta da L2D a dauer. Tuttavia, ci possono essere variazioni tra individuals. E 'quindi importante notare funzionalità aggiuntive (stoma occlusione, faringeo rimodellamento) per stimare la quantità di tempo che gli animali sono stati all'interno della muta dauer (vedi risultati rappresentativi per esempio).
6. Determinare l'orientamento (sinistra / destra, dorsale / ventrale) del nematode. Cattura immagini di Z-stack di un dendrite IL2Q ad ingrandimento 100X con la possibile intensità di fluorescenza più basso ogni 15 minuti o quando necessario per l'esperimento specifico. Continuare a catturare immagini fino a quando il nematode ha separato dalla cuticola L2D e immobilizzazione è impossibile o se l'animale si riprende da dauer (faringe comincia pompaggio). Quando non l'imaging attivamente, posizionare il vetrino in una camera umida. NOTA: Usiamo un microscopio epifluorescente con un contrasto di interferenza differenziale di fase e motorizzato (DIC) ottica.

Risultati

La produzione di greggio risultati dauer feromoni in un liquido giallo (Figura 1) che è sia caldo e freddo stabile. Aliquote di feromone greggio vengono conservati a -20 ° C indefinitamente senza perdita evidente di attività. In seguito la produzione di feromoni, un unico biotest dose-risposta è sufficiente per una stima approssimativa di potenza. Tuttavia, per la maggior parte degli esperimenti è necessario ripetere il saggio biologico 2 - 3 volte e prendere una media di ciascun esperimento. I risultat...

Discussione

Un esame della neuroplasticità specifici per dauer e altri cambiamenti morfologici Dauer-associata richiede controllata e affidabile di formazione dauers sia attraverso la mutazione genetica (cioè mutanti, DAF-C) o in caso di esposizione di wild-type animali a feromone. Mentre l'uso di una mutazione genetica per indurre dauers è conveniente, può confondere risultati. Pertanto, i dati raccolti con mutazioni daf-c devono essere successivamente confermati con wild-type animali indotti ad entrare nella...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
N2 C. elegans Bristol ceppo	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III Su	richiesta del laboratorio
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Su richiesta del laboratorio
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Piastre di Petri	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Vari		3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g peptone in 975 ml H2O autoclavato raffreddato a 55° C seguito da 1 ml di colesterolo 5 mg/ml in etanolo, 25 ml di tampone 1 M KPO4 (pH 6,0), 1 ml di 1 M CaCl2, 1 ml di 1 M MgSO4
S I	vari		terreni S sono costituiti da una soluzione basale S (1,46 g di NaCl, 0,25 g di K2HPO4, 1,5 g di KH2PO4, 0,25 ml di colesterolo 5 mg/ml in etanolo e H2O a 250 ml. Alla soluzione basale S aggiungere 2,5 ml di citrato di potassio pH 6,0 (2 g di acido citrico monoidrato, 29,4 g di citrato tripotassico monoidrato, H2O a 100 ml, sterilizzato in autoclave), 2,5 ml di soluzione di metalli in tracce (1,86 g di EDTA disodico, 0,69 g di FeSO4  e toro; 7 H2O, 0,2 g MnCl2&toro; 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  e toro; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  e toro; 5 H2O, H2O a 1 L. Autoclavato e conservato al buio), 0,75 ml di 1 M CaCl2 e 0,75 ml di 1 M MgSO4.
Piastre di feromoni Dauer per saggio dose-risposta	Varie		Miscele 0,085 g di agar nobile, 0,5 ml di NaCl 0,513 M e 5 µ l di 5 mg/ml di colesterolo sciolto in etanolo in ciascuna delle 6 provette da 15 ml. Aggiungere una quantità sufficiente di feromone grezzo a ciascuna provetta per creare una gamma di concentrazioni. Aggiungere H2O per portare il volume a 4,725 ml. Far bollire su un bruciatore Bunsen fino a quando l'agar non si sarà sciolto e poi raffreddare a 55 °C. Aggiungere 125 &5; l 1 M KPO4 tampone (pH 6,0), 50 &; micro; l 0,1 M CaCl2, 50 µ l 0,1 M MgSO4 e 50 µ l di 5 mg/ml di streptomicina solfato in ciascuna provetta. Versare il contenuto di ogni tubo in una capsula Petri di 35 mm di diametro. Lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente per una notte (se più a lungo, conservare in un contenitore chiuso per evitare un'eccessiva essiccazione).
Microsfere 0,1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 tampone	Varie		Miscela 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Sterilizzare in autoclave

SchroederSchroeder