Ottenere immagini di microscopia elettronica a trasmissione di alta qualità è impegnativo, soprattutto nel caso delle cellule vegetali, che hanno abbondanti vacuoli pieni d'acqua e spazi aerati. Il congelamento ad alta pressione in tandem e la sostituzione rapida del congelamento riducono notevolmente i tempi di preparazione dei campioni di piante per la TEM, producendo al contempo campioni con un'eccellente conservazione ultrastrutturale.
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Articolo metodologico
Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Poiché la microscopia elettronica a trasmissione 1940 (TEM) ha fornito i biologi con immagini ultra-alta risoluzione di materiali biologici. Tuttavia, a causa dei protocolli laboriose e lunghe che richiedono anche esperienza nella preparazione dei campioni prive di artefatti, TEM non è considerata una tecnica di facile utilizzo. Preparazione del campione Tradizionale per TEM usato fissativi chimici per preservare le strutture cellulari. Di congelamento ad alta pressione è il cryofixation di campioni biologici sotto alte pressioni per produrre velocità di raffreddamento molto rapidi, limitando in tal modo la formazione di ghiaccio, che è dannoso per l'integrità della ultrastruttura cellulare. Di congelamento ad alta pressione e la sostituzione congelamento sono attualmente i metodi di scelta per produrre la morfologia più alta qualità nelle sezioni in resina per TEM. Questi metodi minimizzano i manufatti normalmente connessi con l'elaborazione convenzionale per TEM di sezioni sottili. Dopo cryofixation l'acqua congelata nel campione viene sostituito con il liquidosolvente organico a basse temperature, un processo chiamato sostituzione congelamento. Sostituzione di Fermo è tipicamente effettuata per diversi giorni in dedicati, attrezzature costose. Una recente innovazione permette il processo per essere completato in tre ore, invece dei soliti due giorni. Questo è in genere seguito da diversi giorni di preparazione del campione, che comprende l'infiltrazione e l'inclusione in resine epossidiche prima del sezionamento. Qui vi presentiamo un protocollo che combina il congelamento ad alta pressione e la sostituzione di congelamento rapido che consente la fissazione del campione pianta per essere realizzato in poche ore. Il protocollo può essere facilmente adattato per lavorare con altri tessuti o organismi. Tessuti vegetali sono di particolare interesse per la presenza di spazi aerati e vacuoli pieni d'acqua che impediscono il congelamento senza ghiaccio d'acqua. Inoltre, il processo di sintesi chimica è particolarmente lunghi in piante dovuto a pareti cellulari che impediscono la penetrazione delle sostanze chimiche di profondità all'interno dei tessuti. Tessuti vegetali sono quindi particlarmente impegnativo, ma questo protocollo è affidabile e produce campioni di altissima qualità.
Introduzione
La nostra conoscenza della ultrastruttura cellulare proviene principalmente da microscopia elettronica, che possono risolvere dettagli nell'intervallo di pochi nanometri 1. Pur essendo così potente nella risoluzione TEM non è considerato user-friendly, come la preparazione del campione richiede tempo e protocolli laboriosi, e richiede una certa esperienza da professionista. Fissazione tradizionale dei campioni ha combinato l'uso di aldeidi e tetrossido di osmio prima di ulteriori trasformazioni che comprende la disidratazione, inclusione in resina e poi sezionamento per la produzione di sezioni ultrasottili che vengono poi colorate con metalli pesa....
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Protocollo
NOTA: La procedura QFS richiede estrema attenzione e cautela da parte dell'utente e che evidenziare queste precauzioni di sicurezza qui come attenzione e note ove applicabili.
1.Preparazione per HPF Run
- Prima di iniziare la preparazione del campione, accendere il congelatore ad alta pressione seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: L'unità HPF utilizzata in questo protocollo è una unità compatta Wohlwend 02 (Figura 1A), e ci vuole circa un a un'ora e mezzo di procedura di avviamento prima HPF corre può cominciare.- Accensione del Wohlwend Compact 02 alta pressione Freezer.
- Accensione del Wohlwend Compact 02 alta pressione Freezer.
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Risultati
I risultati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando un Wohlwend Compact 02 per HPF (Figura 1A). Uno dei principali vantaggi di questo strumento è la facilità di utilizzo dei vettori dei campioni e dei suoi titolari. Quando si utilizzano altri strumenti, McDonald raccomanda che due utenti devono effettuare la preparazione del campione e HPF, una preparazione dei campioni, mentre l'altro fa il congelamento e trasferimento FS cryovials 9. Tuttavia, il Wohlwend provino vettori e tit.......
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Discussione
Il successo del protocollo presentato qui dipende molto l'utente. In primo luogo, una preparazione avanzata è necessaria per garantire che tutti i materiali necessari sono facilmente disponibili e in quantità sufficiente per completare un intero run HPF-QFS. In secondo luogo, l'utente deve lavorare velocemente, passando da passo-a-passo in modo efficiente che minimizza la manipolazione del campione, riducendo così al minimo i cambiamenti allo stato nativo del tessuto. Una volta che i campioni sono congelati e pr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La gentilezza e la generosità del Dr. Kent McDonald di UC Berkeley sono molto apprezzate. Ringraziamo un anonimo recensore per molto utili suggerimenti. Il laboratorio Burch-Smith è supportato da fondi di start-up presso l'Università del Tennessee.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Wohlwend HPF Compact 02 Macchina per il congelamento ad alta pressione | Technotrade International, Inc | HPF02 | Con oscilloscopio integrato per visualizzare le curve di congelamento e pressione; Il PC (non incluso) è necessario per la visualizzazione dei parametri di congelamento |
| Supporto per portacampioni in alluminio DN 3 x 0,5 mm | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Portacampioni, P=1.000, DN 3 x 0,5 alluminio, tipo A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Portacampioni, P=1.000, DN 3 x 0,5 alluminio, tipo B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Stoccaggio Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Lievito | Più vecchio è, meglio è, per evitare un'eccessiva produzione di gas (CO2) | ||
| Stuzzicadenti | |||
| Registratore di dati per termocoppia EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Batteria di ricambio acquistabile separatamente |
| Sonda di temperatura | Microscopia elettronica Sciences | 34505 | |
| Blocco riscaldatore 12/13 mm | |||
| Agitatore rotativo | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Punzone per foglie - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Cera dentale rosa | Microscopia elettronica Sciences | 72660 | |
| Fiale criogeniche 2 ml | Microscopia elettronica Sciences | 61802-02 | |
| Metanolo | |||
| Asciugacapelli | |||
| Ghiaccio | |||
| Azoto | |||
| Acetone | |||
| Pinze | Diverse paia |
Riferimenti
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M.
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Ristampe e permessi
