Articolo metodologico

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

DOI:

10.3791/51845

⸱

9 ottobre 2014

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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È stato dimostrato che la regolazione alternativa dello splicing contribuisce alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo un metodo che utilizza un modello EMT inducibile per il rilevamento di splicing alternativo durante l'EMT.

Abstract

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Lo splicing alternativo svolge un ruolo critico nella transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale che si verifica in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo una strategia per rilevare lo splicing alternativo durante l'EMT utilizzando un modello EMT inducibile esprimendo il repressore di trascrizione Twist. L'EMT è monitorata dai cambiamenti nella morfologia cellulare, dalla perdita della localizzazione della E-caderina nelle giunzioni cellula-cellula e dall'espressione commutata dei marcatori EMT, come la perdita dei marcatori epiteliali E-caderina e γ-catenina e l'aumento dei marcatori mesenchimali N-caderina e vimentina. Utilizzando set di primer isoforma-specifici, lo splicing alternativo degli mRNA interessati viene analizzato mediante RT-PCR quantitativa. La produzione di isoforme proteiche corrispondenti è convalidata da saggi di immunoblotting. Il metodo di rilevamento delle isoforme di splicing qui descritto è adatto anche per lo studio dello splicing alternativo in altri processi biologici.

Introduzione

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La transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è un programma di sviluppo che guida la morfogenesi di organi e rimodellamento tissutale durante l'embriogenesi. Quando anormalmente attivato, EMT promuove la metastasi del tumore e degli organi fibrosi 1,2. Studi convincenti hanno descritto l'importanza della regolazione trascrizionale durante il processo di EMT, definito da diversi fattori di trascrizione, come il Twist, Lumaca, e ZEB, che reprimono l'espressione della proteina di giunzione adherens E-caderina, con conseguente perdita di un cobble- pietra come morfologia epiteliale e il guadagno di un a forma di fuso fenotipo mesenchimale 3-8. Recenti studi attraverso l'analisi dell'intero genoma di RNA hanno rivelato che esiste un gruppo di geni i cui modelli di splicing sono associati sia con fenotipi epiteliali e mesenchimali 9,10. Il lavoro dal nostro laboratorio funzionalmente collegato splicing alternativo e EMT. Studiando la superficie cellulare molecola di adesione CD44, abbiamo dimostrato che il CD44 Alternative splicing è strettamente regolata durante EMT, e più importante, che CD44 giuntura isoforma passaggio causalmente contribuisce alla EMT 11.

Splicing alternativo rappresenta un modello diffuso e conservato di regolazione genica, in quanto fino al 95% dei geni multi-esone umani sono splicing alternativo 12-14. Generando più prodotti proteici da un singolo gene, splicing alternativo costituisce un meccanismo essenziale per la diversità di proteine, aggiungendo un ulteriore livello di complessità al genoma umano. Come tale, disregolazione di splicing alternativo potrebbe potenzialmente portare a profondi effetti biologici che causano malattie umane. Infatti, aberrante splicing alternativo nelle malattie è stato documentato da oltre un decennio 15-25, compresi recenti scoperte che le mutazioni in geni che codificano per le macchine spliceosoma trovano comunemente nelle sindromi mielodisplastiche 26-28. Pertanto, lo sviluppo di metodi affidabili per la rilevazione di i splicing alternativosoforms è di grande importanza nello studio dei processi biologici diversi, tra cui EMT.

Qui forniamo un protocollo per rilevare i cambiamenti nella splicing alternativo utilizzando un modello di EMT inducibile. I metodi per la progettazione di primer PCR e rilevazione isoforme di splicing sono adatte non solo per lo studio di splicing alternativo durante EMT, ma anche per lo studio di splicing alternativo in altri processi biologici. Indagare splicing alternativo durante EMT è indispensabile al fine di comprendere meglio i meccanismi di EMT e metastasi tumorali, facilitando così lo sviluppo di strategie efficaci per il trattamento di metastasi del cancro.

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Protocollo

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1 Cella Cultura della EMT induzione

Nota: EMT può essere indotta da trattamenti di TGFβ o espressione ectopica di fattori di trascrizione Twist, Chiocciola, o Zeb1 / 2 in cellule epiteliali. Descritto in questo protocollo è un sistema EMT inducibile mediante espressione della proteina di fusione Twist-ER in cellule immortalizzate umane epiteliali mammarie (HMLE / Twist-ER, un dono di Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Al 4-hydroxytamoxifen (TAM) il trattamento, la proteina di fusione Twist-ER trasloca nel nucleo di guidare la trascrizione e risultati in una transizione completa EMT in 12-14 giorni 9,11,29. Altri sistemi inducibili EMT, come HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFβ, e MCF10A / TGFβ, si possono trovare nelle nostre precedenti pubblicazioni 11,30.

  1. Mantenere le cellule HMLE / Twist-ER in mammaria mezzo di crescita delle cellule epiteliali privo di siero (MEGM) in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. Passage le cellule ogni 2-3 giorni quando raggiungono l'80% di confluenza. Incubare le cellule con tripsina 0,15% a 37 ° C per 5-10 minuti, quindi inattivare la tripsina con siero di vitello al 5% / DMEM. Spin le cellule e risospendere in MEGM. Cellule portapiatti in un nuovo piatto di coltura tissutale con un rapporto di 1 a 4.
  2. Sciogliere TAM in etanolo per ottenere una soluzione 200 mM. Proteggere TAM dalla luce e conservare a -20 ° C. Prima dell'uso, appena aggiungere TAM in MEGM materie ad una diluizione 1: 10.000 per effettuare una concentrazione finale di 20 nM TAM.
  3. Per l'induzione di EMT, piastra cellule 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti in duplice copia. Celle di coltura con 20 supporti nM TAM-contenenti MEGM.
  4. Piatto cellule 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER in un piatto di 10 centimetri in duplice copia e il trattamento di cellule con 0,01% di etanolo come controllo non-TAM-trattati.
  5. Due giorni dopo l'incubazione, scattare foto sotto un microscopio ottico a 10X di ingrandimento per registrare cambiamenti morfologici delle cellule.
  6. Aspirare il mezzo da un piatto di controllo o di TAM-trattaticellule. Lavare le cellule con PBS freddo e celle raccolto da demolizione metà della piastra in tampone di lisi RNA per l'isolamento dell'RNA e l'altra metà in tampone RIPA per l'analisi di proteine.
  7. Cellule passaggio dal controllo o piatti TAM-trattati con 1,6 x 10 6 cellule ri-placcatura in un piatto di 10 centimetri in duplice copia. Continuamente trattare le cellule con 20 nM TAM o di un veicolo.
  8. Ripetere i passaggi da 5 a 7 una volta ogni due giorni fino al giorno 14, in cui il tempo, le cellule Twist-ER TAM-trattati mostrano una mesenchimale morfologia fusiforme, mentre le cellule di controllo del veicolo trattate mantengono la morfologia epiteliale ciottoli-like.

2 Caratterizzazione di EMT

Nota: A completamento della EMT è indicato da: (1) cambiamenti morfologici delle cellule da una morfologia epiteliale ciottoli come a un aspetto fibroblastica-come a forma di fuso; (2) Perdita di localizzazione E-caderina a giunzioni cellula-cellula; e (3) L'espressione commutazione di marcatori EMT, definito dalla perditadi marcatori epiteliali e aumento dei marcatori mesenchimali.

Cellulari cambiamenti morfologici vengono acquisite da microscopio ottico a 10X di ingrandimento nel corso del tempo di induzione EMT, descritto nella Sezione 1 Immuno-fluorescenza rilevamento di E-caderina in cellule-giunzioni è descritto in questa sezione. L'espressione di markers di EMT viene rilevato mediante immunoblotting. Marcatori epiteliali comuni sono E-caderina, γ-catenina, e occludina, e marcatori mesenchimali includono fibronectina, N-caderina e vimentina. Procedure generali di immunoblotting sono descritti nella sezione 4.

  1. Al giorno 12 del trattamento TAM, semi di 1 x 10 5 cellule su un vetro coprioggetti circolare 12 millimetri disposte in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
  2. 48 ore dopo che le cellule di semina, medie Aspirare e lavare con pre-riscaldato PBS.
  3. Fissare le cellule con pre-riscaldato paraformaldeide 4% per 15 min.
  4. Lavare le cellule tre volte con PBS.
  5. Incubare le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 15minuti a temperatura ambiente.
  6. Lavare le cellule tre volte con PBS.
  7. Incubare le cellule a 5% BSA / PBS per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare legame non specifico.
  8. Incubare le cellule con l'anticorpo E-caderina primario in una diluizione 1:50 in 1% BSA / PBS in una camera di umidificata O / N a 4 ° C. NOTA: L'intervallo per la diluizione anticorpo primario è normalmente compreso tra 1:50 e 1: 200, e la diluizione ottimale per ogni anticorpo deve essere determinato sperimentalmente.
  9. Decantare l'anticorpo primario e lavare le cellule tre volte con PBS.
  10. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario fluorescente marcato in una diluizione 1: 500 per 1 ora a temperatura ambiente. Da questo punto in poi, proteggere le cellule dalla luce.
  11. Decantare l'anticorpo secondario e lavare tre volte con PBS.
  12. Cellule macchia con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst per 10 min.
  13. Lavare le cellule con PBS per tre volte.
  14. Montare coprioggetto con una goccia di mezzo di montaggio, e coprioggetto tenuta con smalto.
  15. Osservare le cellule e prendereimmagini sotto un microscopio a fluorescenza 63X.

Colorazione con anticorpi supplementari può essere eseguita per confermare il fenotipo EMT. Ad esempio, N-caderina e α-actina del muscolo liscio possono essere colorati per un fenotipo mesenchimale 29,31,32. Riorganizzazione della struttura del citoscheletro può essere monitorato mediante colorazione delle cellule con falloidina per la F-actina 11. Inoltre, saggi di motilità cellulare e la resistenza delle cellule morte possono essere eseguite per esaminare le proprietà del EMT 11.

3 Rilevamento di Splice Isoforme Utilizzo qRT-PCR saggi

  1. Disegno Primer
    NOTA: Le coppie di primer deve essere accuratamente studiato per amplificare isoforme di splicing distinti. Exon skipping, l'evento splicing alternativo più comunemente osservato, è illustrata qui come esempio per illustrare la strategia di progettazione di primer. Figura 1A mostra una quattro esone pre-mRNA, con il terzo esone come esone variabile. L'inclusione dell'esone 3 risultati inla produzione di un giunto isoforma più lunga, mentre skipping dell'esone 3 genera una giuntura isoforma più corta. I primer devono essere progettati per distinguere l'isoforma esone-3-incluso e esone-3-saltato isoforma, e per rilevare la trascrizione completa della mRNA.
    1. Per il rilevamento di inclusione dell'esone, progettare con cura un primer in avanti all'interno della variabile esone 3, e un primer reverse all'interno della vicina esone costitutiva 4, permettendo l'amplificazione specifica della variabile isoforma esone-incluso. Assicurarsi di non progettare sia in avanti e reverse primer all'interno dello stesso esone variabile al fine di evitare i prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA genomico o pre-mRNA.
    2. Per amplificare specificamente esone eventi saltare, di design uno dei primer che abbracciano la giunzione dell'esone costitutiva 2 e esone 4 che altrimenti sarebbe distrutto quando esone variabile 3 è incluso. Progettare l'altro fondo all'interno del esone costitutiva 4 Come tale, i prodotti di PCR vengono generati solo quando la variabile esone 3 è excluded e la costitutiva esone 2 e l'esone 4 sono successivamente uniti.
    3. Per rilevare le trascrizioni totali del gene, disegnare i primer entro due esoni costitutivi 1 e 2 Pertanto, i prodotti di PCR sono amplificati da tutte le isoforme.
    4. Assicurarsi che la temperatura di fusione (Tm) per tutti i primer è di circa 55 ° C, la lunghezza di ogni primer è di circa 18-22 nucleotidi, e la dimensione dei prodotti di PCR è compresa tra 80 e 150 paia di basi.
  2. Estrazione di RNA: RNA estratto utilizzando un kit di totale isolamento di RNA (vedi tabella dei Materiali).
    1. Raccogliere le cellule in 350 microlitri di buffer di lisi RNA.
    2. Aggiungere 350 ml di etanolo al 70% al lisato e mescolare accuratamente.
    3. Trasferire il campione alla colonna di purificazione dell'RNA.
    4. Centrifugare a 10.000 xg per 1 min e scarto flow-through.
    5. Lavare la colonna una volta con 500 ml di RNA di lavaggio buffer di I e due volte con RNA tampone di lavaggio II.
    6. Rimuovere il tampone di lavaggio RNA residuoII dalla colonna mediante centrifugazione a velocità massima per 2 min.
    7. Trasferire la colonna in una nuova provetta da 1,5 ml, aggiungere acqua priva di nucleasi 50 microlitri al centro della matrice colonna ed eluire l'RNA per centrifugazione a velocità massima.
  3. Sintesi di cDNA First-strand
    1. Determinare la concentrazione e la qualità di RNA con la misura di assorbimento UV. NOTA: Buona RNA qualità dovrebbe avere un / 280 nm rapporto di assorbanza 260 nm di circa 2.0.
    2. Impostare trascrittasi inversa (RT) reazioni che contengono 250 ng di RNA totale, 0,05 mg primer esameriche casuale, 50 pmol MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 microlitri di buffer 5 × GoScript, e 1 ml RT enzima in un volume finale di 20 ml.
    3. Eseguire reazioni RT a 42 ° C per 1 ora, seguito da incubazione a 70 ° C per 5 minuti per inattivare l'enzima RT.
  4. Real-time PCR
    1. Impostare 20 microlitri reazioni che consistono di 10 microlitri SYBR master mix verde,0.1-1.0 modello cDNA microlitri, e 5 pmol avanti e indietro primer.
    2. Eseguire PCR in tempo reale con 40 cicli dei seguenti passi: 95 ° C denaturazione per 10 sec, 58 ° C ricottura per 10 sec e 60 ° C per 30 sec estensione. Eseguire reazioni PCR in triplice copia.
    3. Controllare le curve di dissociazione e fare in modo che un singolo picco si osserva per ogni set di primer.
    4. Ottenere i valori di ciclo di quantificazione (Cq) calcolando i secondi valori derivati ​​curve di amplificazione.
    5. Calcolare la quantità relativa (RQ) del mRNA bersaglio in campioni indotto, rispetto al campione uninduced utilizzando il 'delta delta Cq (ΔΔCq)' metodo come mostrato dalla seguente formula. Utilizzare geni housekeeping, come GAPDH o TBP, come riferimento.

figure-protocol-1
Per calcolare con maggiore precisione i valori relativi delle isoforme di splicing, tegli usa di più geni di riferimento dovrebbe essere considerato. I risultati possono essere analizzati utilizzando un metodo di quantificazione del valore assoluto modificato descritto da Pfaffl et al 33,34.

4 Esame di Splice Isoforme a livello proteico

  1. Raccogliere le cellule in 100 microlitri di buffer RIPA ghiacciato.
  2. Impostare lisati su ghiaccio per circa 10 min.
  3. Centrifugare a 14000 g per 10 min a 4 ° C, e raccogliere il surnatante.
  4. Misurare la concentrazione di proteine ​​mediante saggi Bradford.
  5. Diluire i campioni di proteine ​​in tampone di caricamento SDS e caricare 20-40 mg di proteine ​​in gel 10% SDS-PAGE.
  6. Eseguire gel SDS-PAGE a 20 mA per 1.5 ore.
  7. Trasferimento proteine ​​di membrane PVDF in un sistema di trasferimento umida a 4 ° C per 3 ore a 85 V. Regolare il tempo di trasferimento secondo il peso molecolare delle proteine ​​bersaglio.
  8. Membrana blocco in 5% di latte senza grassi per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente.
  9. Incubare la membrana with un anticorpo primario a 4 ° CO / N. La gamma di diluizione anticorpo primario è normalmente compresa tra 1: 200 e 1: 5.000, determinare la diluizione ottimale per ciascun anticorpo sperimentalmente. La diluizione di anticorpi utilizzati in questo protocollo può essere trovato in "Tabella di reagenti e attrezzature specifiche".
    1. Per rilevare isoforme di splicing, utilizzare anticorpi specifici che riconoscono una particolare isoforma. In alternativa, utilizzare un anticorpo che riconosce l'epitopo nella costitutiva esone regione codificante e rilevare le isoforme di splicing simultaneamente in base alle loro dimensioni diverse proteine.
    2. Allo stesso tempo, monitorare EMT mediante immunoblotting per i marcatori di EMT. Utilizzare E-caderina, γ-catenina, e occludina come marcatori epiteliali, e fibronectina, N-caderina e vimentina come marcatori mesenchimali.
  10. Membrana Lavare tre volte con TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7.4) in un intervallo di 5 min.
  11. Incubare la membrana con una formica secondario HRP-coniugatoiBody in una diluizione 1: 10.000 per 1 ora a RT.
  12. Membrana Lavare tre volte con TBS-T in un intervallo di 5 min.
  13. Visualizzare proteina con un sistema di rilevazione chemiluminescenza ed esporre la membrana di un film autoradiografia.

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Risultati

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Le procedure sopra descritte forniscono un metodo affidabile per rilevare splicing alternativo durante EMT. Risultati rappresentativi di CD44 giunzione commutazione isoforma durante EMT Twist-indotta sono riportati di seguito come esempio.

EMT Twist-indotta nelle cellule HMLE / Twist-ER è stato caratterizzato da una transizione da un ciottolo-pietra come fenotipo epiteliale ad un fenotipo fibroblastica allungata (Figura 2A), l'assenza di marcatori epiteliali E-caderina, γ-ca...

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Discussione

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La procedura qui descritta consente il rilevamento di splicing alternativo in un modello EMT inducibile. Come tali, le alterazioni dinamiche di espressione delle isoforme di splicing possono essere catturate nel corso tempo di EMT. Questo metodo ha vantaggi rispetto all'uso di epithelial- diverso o linee di cellule mesenchimali-che rappresenta per il confronto di splicing alternativo, perché background genetici distinti da linee cellulari connessi alle Nazioni Unite potrebbero influenzare indebitamente splicing alte...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Wensheng Liu per l'inestimabile aiuto con l'imaging cellulare. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 CA182467), dell'American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), della Lynn Sage Foundation e della A Sister's Hope Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-idrossitamoxifeneSigmaH7904Preparare la soluzione madre sciogliendo il 4-idrossitamoxifene in etanolo a 200 μM. Mantenere la soluzione a -20 ° C protetto dalla luce.
Kit di isolamento dell'RNA totale E.Z.N.A. Kit di isolamentodell'RNA totaleOmega Bio-TekR6731
Sistema di trascrizione inversa GoScriptPromegaA5001Reagente per il test qRT-PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002Reagente per il test qRT-PCR
LightCycler 480 Sistema di PCR in tempo realeRocheAttrezzatura per il test qRT-PCR
Anticorpo CD44R& D SystemsBBA10Diluizione 1:1.000
Anticorpo E-caderinaTecnologia di segnalazione cellulare4065Diluizione 1:2.500 per immunoblotting; Diluizione 1:50 per immunofluorescenza
γ-catenina AnticorpoTecnologia di segnalazione cellulare2309Diluizione 1:1.000
Anticorpo occludinaSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-5562Diluizione 1:500
Anticorpo della fibronectina AnticorpoBD Transduction Laboratories610077Diluizione 1:5.000
Anticorpo N-caderinaBD Transduction Laboratories610920Diluizione 1:2.000
Anticorpo VimentinNeoMarkersMS-129-p1Diluizione 1:500
Anticorpo GAPDHMillipore CorporationMAB374Diluizione 1:10.000
Amasham ECL Western blotting reagente di rilevamentoGE Health Life ScienceRPN2209sistema di chemiluminescenza

Riferimenti

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