Articolo metodologico

Valutazione della murini esercizio di resistenza senza l'uso di una griglia Shock: Un'alternativa alla Esercizio forzato

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DOI:

10.3791/51846

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14 agosto 2014

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1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

In questo articolo

Sommario

Viene dimostrato un metodo per valutare la resistenza all'esercizio nei topi di laboratorio senza l'uso di una griglia d'urto. Questo metodo è un perfezionamento umano che può ridurre gli effetti confondenti dello stress sui parametri sperimentali.

Abstract

Utilizzando modelli di topo di laboratorio, i meccanismi molecolari responsabili dei benefici metabolici di esercizio di resistenza cominciano a essere definiti. Il metodo più comune per valutare l'esercizio di resistenza nei topi utilizza costretto esecuzione su un tapis roulant motorizzato provvisto di una griglia shock. Animali che smettono di esecuzione sono spinti dal nastro in movimento tapis roulant su una griglia che offre una scossa elettrica piede; per sfuggire stimolo negativo, i topi tornano a correre sul nastro. Tuttavia, il comportamento di evitamento e stress psicologico dovuto all'uso di un apparato di shock possono interferire con la quantificazione di resistenza in esecuzione, così come le misure di confondere i livelli di ormone e di citochine sieriche postexercise. Qui, noi dimostrare e validare un metodo raffinato per misurare la resistenza in esecuzione in naïve C57BL / 6 topi di laboratorio su un tapis roulant motorizzato senza utilizzare una griglia shock. Quando i topi sono preacclimated al tapis roulant, che corrono volontariamente con andatura accelera specifico per ogni mouse. Uso della griglia ammortizzatore è sostituito dal delicato incoraggiamento da un operatore umano utilizzando un abbassalingua, accoppiato con sensibilità alla volontà volontario per eseguire da parte del mouse. Endpoint chiari per quantificare i tempi di esaurimento per ogni mouse esecuzione sono definiti e riflettono in segni comportamentali di esaurimento come la postura strombato e respiro affannoso. Questo metodo è un perfezionamento umano che riduce anche gli effetti confondenti dello stress sui parametri sperimentali.

Introduzione

L'obesità, insulino-resistenza e diabete di tipo 2 sono disordini metabolici correlati che esercitano profondi effetti sulla salute sia negli Stati Uniti e le popolazioni di tutto il mondo 1-4. Esercizio di resistenza può prevenire, così come trattare, queste condizioni di 5,6. Inoltre, la valutazione della velocità di deambulazione e la resistenza sono utilizzate come test clinici diagnostici per fragilità, sarcopenia, e le conseguenze di altri disturbi come la malattia polmonare ostruttiva cronica, in soggetti umani 7.

I percorsi biochimici alla base degli effetti benefici di esercizio di resistenza sulla composizione corporea e la sensibilità all'insulina stanno cominciando da chiarire, utilizzando topi geneticamente o farmacologicamente modificati che display migliorato o ridotto la capacità di esercizio 8-11. Tuttavia, molti di questi studi hanno utilizzato tapis roulant motorizzati dotati di griglie d'urto per costringere i topi a correre 8-11. Animali che smettono di esecuzione sono spinti dala cinghia in movimento tapis roulant su una griglia che offre una scossa elettrica piede; per sfuggire stimolo negativo, i topi tornano a correre sul nastro. Tali procedure possono introdurre stress psicologico e comportamento di evitamento come fattori di confondimento che influenzano parametri sperimentali 12. Altri metodi di misurazione di resistenza, come la quantificazione dell'attività ambulatoriale utilizzando un apparato trave-break o quantificazione di in-gabbia corsa della ruota, possono essere confusi dalla modulazione dei cicli circadiani, ansia, formazione involontaria, o cibo comportamento di ricerca 12-16. Inoltre, queste procedure richiedono una custodia ad una, un'altra fonte di stress psicologico per i topi. Pertanto, è necessaria una misura diretta di esercizio di resistenza non confusi da stress.

Per ovviare a questi problemi, il nostro laboratorio ha sviluppato e validato un metodo per valutare la massima capacità di esecuzione e durature in esecuzione velocità non allenati, topi naïve utilizzando un tapis roulant motorizzato non equipped con una griglia shock. Lo spazio alla fine del tappeto scorrevole, dove la griglia di shock risiede abitualmente, allora diventa una piattaforma per i topi a riposo, e fornisce un posto per topi che rifiutano di correre a sedersi fino rimossa dall'apparecchio. I topi sono incoraggiati a correre da un osservatore umano per mezzo picchiettando leggermente o toccare con un abbassalingua, insieme con la sensibilità alla disponibilità volontaria per l'esecuzione da parte del mouse. Questo metodo è stato utilizzato per quantificare le differenze di esercizio di resistenza tra geneticamente modificati e controllare C57BL / 6 topi che differiscono nell'espressione del muscolo citochina derivata interleuchina-15 (IL-15) 16,17. Questo metodo è un perfezionamento umano che diminuisce gli effetti confondenti di rinforzo negativo causati da un uso di una griglia di shock.

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Protocollo

La procedura qui descritta è stata approvata dal suono Institutional Animal Care and Use Committee VA Puget, ed è conforme con la Guida ILAR per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

Preparazione 1 Sperimentale

  1. Decidere in anticipo se il sangue o raccolta di tessuto subito dopo l'esercizio fisico è necessario, e in caso affermativo, determinare l'intervallo post-esercizio per la conduzione di tali procedure. Gli esempi includono la determinazione dell'ormone indotta da esercizio o il rilascio di citochine in circolo (che richiede la raccolta di sangue), la determinazione di esercizio espressione indotta di specie di mRNA di interesse (che richiede l'eutanasia seguito da collezione dei tessuti). Qualora non sia indicata l'esercizio di sangue posta immediato o raccolta di tessuto, avere materiali per queste procedure a portata di mano in camera procedura. Ricevi revisione istituzionale approvazione bordo e svolgere, secondo le linee guida legislative. Non tutti gli esperimenti richiedono sangue postexercise o collecti tessutosu; un semplice confronto di resistenza in esecuzione può essere tutto ciò che è necessario.
  2. Decidere in anticipo sui gruppi sperimentali e procedure postexercise per topi (vedi descrizione sopra).
  3. Posizionare il tapis roulant su un tavolo robusto in una stanza tranquilla dedicata durante le prove di marcia a questa procedura.
  4. Posizionare il tapis roulant per i vicoli del mouse di dimensioni e ad un'inclinazione appropriata al protocollo. L'inclinazione di 5 o è qui utilizzato per evitare danno muscolare per esercizio eccentrico (allungamento del muscolo allo stesso tempo come contrazione) che si verifica durante la discesa in esecuzione.
  5. Inserire un tampone assorbente sotto la cintura tapis roulant per la cattura feci.

2 Acclimatazione del mouse sul tapis roulant

Decidere se è necessario un (nessun esercizio) gruppo "sedentario" di topi, ed esporre i topi sedentari per il tapis roulant senza correre come indicato nei passaggi 2,1-2,5. Determinare se sono necessari 2 o 4 gruppi sperimentali,. esempio, sedentario / Esercizio (2 gruppi); Controlli esercitati / esercitata trattamento (2 gruppi, senza animali sedentari); o, sedentario / Esercitate x controllo / trattamento (4 gruppi). Il "trattamento" può essere un genotipo transgenico o ko, un regime farmacologico, dieta speciale, o altro intervento sperimentale.

  1. Lasciare che il mouse si adatti alla stanza procedimento nella sua gabbia casa trasportati, con i compagni di gabbia, per 1 - 2 ore.
  2. Selezionare un singolo mouse e il numero di etichetta di registrazione; pesare mouse e il peso record.
  3. Posizionare il mouse nel tapis roulant senza il motore acceso per acclimatazione, circa 5 min. Accendete, senza la corsa cintura tapis roulant, e lasciare il mouse acclimatare alla rumorosità della macchina per altri 5 min.
  4. Rimuovere i topi nei gruppi "sedentari" (se usato; vedi Nota 1) dal tapis roulant a questo punto e restituirli alla loro gabbia o eseguire procedure di post-esercizio come da progetto sperimentale (vedi nota 2).

3. Avvio del test run-to-Esaurimento

  1. Dopo acclimatazione, girare il nastro ad una velocità bassa (10 m / min) quando l'animale sta esplorando la cintura e non sulla piattaforma.
  2. Toccare o sollevare il posteriore del mouse con un abbassalingua, una a tre volte, per incoraggiare gli animali riluttanti a restare sul tapis roulant e correre delicatamente.
    NOTA: La maggior parte dei topi verrà eseguito immediatamente, ma a volte fermarsi per brevi periodi. In questo caso, utilizzare il divaricatore di linguetta di toccare delicatamente o sollevare la parte posteriore dell'animale per favorire la ripresa di esecuzione. Spesso, i topi non hanno bisogno di essere toccato con la lingua depressore; notando la mano con l'abbassalingua venire verso di loro fa sì che i topi a correre un po 'di più.
  3. Avviare un timer laboratorio una volta che il mouse è in funzione alla velocità iniziale di 10 m / min.
  4. Girare la velocità lentamente quando il mouse è in alto (fine salita) della cintura, in incrementi di 1 m / min, circa ogni 2 min.
  5. Girare la velocità fino alimpostazione precedente se il mouse viene eseguito più volte in brevi raffiche e non ad un ritmo costante.
  6. Determinare la massima velocità sostenuta esecuzione di ogni mouse (di solito 14-17 m / min per C57BL / 6 topi) regolando la velocità e guardare il mouse. Registrare questa velocità.
    NOTA: La posizione dell'animale sul tapis roulant spunti l'investigatore per la volontà dell'animale da eseguire ad una velocità più elevata. Se il mouse è all'estrema (in salita) finale e per correre nel muro, è pronto a correre a una velocità superiore. Se il mouse viene eseguito ad un ritmo costante nel mezzo del tapis roulant può essere alla sua velocità massima, o può avere bisogno di ulteriori regolazioni, a seconda della qualità della corsa.

4. endpoint e topi che si fermano

  1. Utilizzare l'abbassalingua per toccare delicatamente o sollevare i quarti posteriori di animali che si fermano, per favorire la ripresa di esecuzione (vedi nota 3.2). Non interrompere il timer per interruzioni temporanee in esecuzione.
  2. Identificare e RemovE i topi che si rifiutano di funzionare. Nota: questo sul foglio dati. A seconda del disegno sperimentale, i topi che rifiutano possono essere riesaminati in un giorno diverso
    NOTA: alcuni topi completamente rifiutare di eseguire. Tali topi saranno eseguiti in brevi raffiche, poi si ferma per lo sposo o "pedale", cioè, sedersi sulla piattaforma e usare le zampe anteriori sul nastro. La posizione di questi topi è curvo, con tutti e quattro i piedi piantati sotto l'animale per evitare di essere spinto indietro sul tapis roulant con la lingua depressore. Di tanto in tanto un mouse diventa aggressivo verso l'abbassalingua quando non vuole correre, mordere l'abbassalingua o salire come una via di fuga. E 'chiaro entro i primi 5 minuti del processo se il mouse, o non lo farà, correre. Rimuovere i topi che si rifiutano di eseguire dall'analisi, ma non li contano come topi "sedentari".
  3. Identificare i topi esausti e arrestare il timer.
    NOTA: Esaurimento è definito da tre fermate successive e rifiuto di risume in esecuzione nonostante l'incoraggiamento gentile, oltre a segni fisici di stanchezza, come respiro affannoso e la postura strombato. I topi recuperare dalla stanchezza in 30 a 60 min.
  4. Annotare la quantità totale di tempo trascorso in esecuzione a tutte le velocità.
  5. A seconda del disegno sperimentale, o di rispedire il mouse è alla sua gabbia, o conducono le procedure postexercise immediate, come sangue o raccolta di tessuto come da linee guida istituzionali.
  6. Pulire la cinghia pulita con una salvietta germicida dopo aver testato ogni singolo mouse in modo che il profumo del mouse precedente non influenza il comportamento dei successivi topi testati.
  7. Verificare il successivo mouse. Utilizzare una nuova abbassalingua per ogni mouse. I topi che risiedono nella stessa gabbia possono essere testati in sequenza nello stesso giorno senza acclimatazione aggiuntivo per la stanza procedura.

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Risultati

Questa procedura di misurazione esercizio di resistenza riflette accuratamente il profilo molecolare e metabolico di diversi ceppi di topi C57BL / 6 che differiscono nell'espressione della citochina IL-15 16,17. Topi transgenici che iperesprimono IL-15 (IL-15 TG topi) mostra aumentato significativamente run-to-esaurimento volte rispetto ai controlli littermate, mentre i topi che mancano di IL-15 (IL-15 KO topi) presentano ridotti significativamente i tempi di funzionamento prima di raggiungere esaurimento...

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Discussione

Qui descritto è un metodo per valutare la resistenza esecuzione volontaria nei topi di laboratorio utilizzando un tapis roulant motorizzato senza l'uso di una griglia di shock. Questo metodo può rivelare differenze tra sub-linee di C57BL / 6 topi che differiscono nella espressione della citochina IL-15, che a sua volta provoca differenze nell'espressione dei fattori che sottendono esercizio di resistenza 16,17. In linea con i principi della "Tre cuori in R" nel laboratorio di scienze animali...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Supportato da Merit Review # BX001026 dal Department of Veterans Affairs (LSQ), e l'uso di risorse e strutture in Health Care VA Puget Sound System, il Core transgenico risorse presso l'Università di Washington Nathan Shock Centro di Eccellenza in Biologia di base di invecchiamento (NIA # 5P30AG-013.280), e l'Università di Washington Diabete Endocrinologia Research Center (NIH # P30 DK-17047). Ringraziamo Cynthia Pekow DVM e Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, fornito utili commenti sul manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tapis roulant per roditori aperto Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMQuesto numero di catalogo è per i modelli senza griglia antiurto. Le griglie d'urto possono essere rimosse manualmente dai modelli più vecchi (Eco 3/6)
Salviette germicide in tessuto Sani PDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYsolitamente ordinate tramite la struttura localeContiene il 10% di alcol isopropilico; può essere utilizzato qualsiasi prodotto equivalente.
AbbassalinguaQualsiasi fornitore
Timer di laboratorioQualsiasi fornitore
Topi IL-15 TGJAX, Bar Harbor, ME011002Transgene murino IL-15 espresso da un promotore di actina alfa-scheletrico umano modificato con sequenza di segnale alterata per facilitare la secrezione.
Topi C57BL/6J (wild-type)*JAX, Bar Harbor, ME000664Topi di controllo per topi IL-15 TG
IL-15 KO*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MTopi omozigoti IL-15 "knockout" su sfondo C57BL/
6 C57BL/6NTac (wild-type)*Taconic Farms, Germantown, NYTopi di controllo B6-Mper IL-15 KO*
Opzionale; le linee e i trattamenti dei topi possono essere specifici per l'esperimento protocollo.
locale*

Riferimenti

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