Articolo metodologico

Universale Mano libera tridimensionale optoacustica Imaging Probe per Deep Tissue angiografia umana e funzionali studi preclinici in tempo reale

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DOI:

10.3791/51864

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4 novembre 2014

 ,  , 
1Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, 2Faculty of Medicine, Technische Universität München

In questo articolo

Sommario

Forniamo qui una descrizione dettagliata del protocollo sperimentale per l'imaging con un sistema optoacustico portatile (fotoacustico) di nuova concezione per l'imaging tridimensionale, funzionale e molecolare in tempo reale. Le potenti prestazioni e la versatilità dimostrate possono definire nuove aree di applicazione della tecnologia optoacustica nella ricerca preclinica e nella pratica clinica.

Abstract

L'esclusiva combinazione di un elevato contrasto ottico e di un'eccellente risoluzione spaziale rende l'optoacustica (fotoacustica) ideale per ottenere simultaneamente il contrasto anatomico, funzionale e molecolare in tessuti profondi otticamente opachi. Mentre l'enorme potenziale è stato recentemente dimostrato nell'applicazione dell'optoacustica per la ricerca sui piccoli animali, sono stati intrapresi anche grandi sforzi per tradurre questa tecnologia di imaging nella pratica clinica. Presentiamo qui un approccio di tomografia optoacustica di nuova concezione in grado di fornire immagini volumetriche ad alta risoluzione e spettralmente arricchite della morfologia e della funzione dei tessuti in tempo reale. Viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo sperimentale per il funzionamento con il sistema di imaging sia in modalità portatile che stazionaria e mostrata per diversi scenari potenziali che coinvolgono studi funzionali e molecolari in modelli murini e nell'uomo. La possibilità di visualizzazione in tempo reale in tre dimensioni, insieme al versatile design portatile della sonda di imaging, rendono l'approccio di nuova concezione unico nel pantheon delle modalità di imaging utilizzate nella ricerca preclinica e nella pratica clinica di oggi.

Introduzione

Optoacustica (fotoacustico) di imaging attrae un crescente interesse da parte delle comunità di ricerca biologica e medica, come manifestato dal numero sempre crescente di pubblicazioni che comprendono varietà di nuove applicazioni che sfruttano i vantaggi unici offerti dalla tecnologia 1-5. In particolare, la capacità di immagine agenti foto-assorbimento spettrale distintivi ad alta risoluzione spazio-temporale a profondità ben oltre il limite diffusiva della luce apre capacità senza precedenti per l'imaging funzionale e molecolare 6-10.

Infatti, la traduzione della tecnologia optoacustica nella pratica clinica viene con prospettive promettenti in diagnostica e monitoraggio trattamento di molte malattie. Tuttavia, la propagazione limitata di fotoni in dispersione otticamente e tessuti assorbenti e le risposte generalmente deboli associati al fenomeno optoacustica limitare la profondità applicabile del metodo. Come risultato, optoa portatilesonde Coustic sono tentato di parti di immagine accessibili dall'esterno del corpo 11,12 mentre i sistemi endoscopici vengono utilizzati per fornire immagini all'interno del corpo inserendoli tramite orifizi naturali 13. Alcune parti a basso assorbimento del corpo umano, come il seno femminile, sono accessibili anche da scanner tomografici optoacustica 14,15. Di particolare interesse è l'approccio a mano in quanto consente grande versatilità, in modo simile a ecografia. Qui, l'adattamento dei comuni sonde ecografiche di array lineari per l'imaging optoacustica resta difficile, soprattutto a causa delle differenze fondamentali nei requisiti di imaging tomografico tra ultrasuoni e optoacoustics. Mentre frame rate elevati in ecografia di serie sono attivati ​​per sequenziale sistemi che impiegano frequenze di ripetizione degli impulsi ad alta nel range kHz di trasmissione-ricezione, in tempo reale, tridimensionale delle immagini optoacustica si ottiene con la raccolta simultanea di dati tomografici volumetrico da un singolo interrogating impulso laser. Così, immagini optoacustica alta qualità implica acquisizione di dati tridimensionali dal più grande angolo solido possibile intorno all'oggetto fotografato.

Recentemente, abbiamo introdotto la prima sonda optoacustica tenuto in mano per tridimensionale (volumetrico) di imaging in tempo reale 16. Il sistema è basato su una matrice bidimensionale di elementi piezoelettrici 256 disposti su una superficie sferica (punti blu in Figura 1A) che coprono un angolo di 90 °. La dimensione dei singoli elementi di circa 3 x 3 mm 2, così come il loro orientamento e la larghezza di banda di frequenza (circa 2-6 MHz) garantiscono l'incasso efficace segnale da un volume centimetri scala circonda il centro della sfera (cubo nero nella Figura 1A). Eccitazione ottica della regione di imaging è fornito di un fascio di fibre inserito attraverso una cavità cilindrica centrale della matrice, in modo che qualsiasi susc lunghezza d'ondaeptible di essere trasmesso attraverso il fascio di fibre può essere utilizzato per l'imaging. Una immagine reale della matrice di trasduttori con il fascio di fibre ottiche è mostrato nella Figura 1B. L'eccitazione efficiente e rilevazione simultanea di segnali permette l'imaging dei tessuti profondi con eccitazione a colpo singolo (un impulso laser), in modo che le immagini in tempo reale ad una frequenza determinata dalla frequenza di ripetizione degli impulsi del laser è ulteriormente attivata con un Grafica- trasformazione-unità (GPU) l'attuazione della procedura di ricostruzione 17. Un involucro cilindrico con una membrana in polietilene trasparente (Figura 1C) è collegato alla trasduttori per racchiudere un mezzo liquido acusticamente trasmissione (acqua). La membrana è ulteriormente accoppiato al tessuto mediante gel acustica. Un'immagine della sonda optoacustica come utilizzati nella modalità di funzionamento manuale è mostrato nella Figura 1D.

Il thr dimostratoee dimensionale immagini optoacustica a mano in combinazione con il tempo reale capacità di imaging funzionale sono dotati di importanti vantaggi per la diagnostica clinica e una serie di potenziali applicazioni sono immaginato per diverse patologie, come la malattia vascolare periferica, disturbi del sistema linfatico, cancro al seno, lesioni cutanee, infiammazione o artrite 18. Inoltre, la capacità di imaging veloce permette la visualizzazione di eventi biologici dinamici con la sonda disposti in posizione stazionaria. In combinazione con lunghezza d'onda veloce a punto parametrico ottico oscillatore (OPO) tecnologia laser, questo approccio consente in tempo reale di immagini di biodistribuzione di agenti foto-assorbimento. In tal modo, nuove possibilità possono altresì emergere in piccole applicazioni di imaging animale, ad esempio., Nello studiare l'emodinamica del tessuto, in vivo il monitoraggio delle cellule, la visualizzazione di farmacocinetica, la perfusione degli organi, mirato imaging molecolare dei tumori e sistema cardiovascolare, o neuroimaging.

In questo lavoro forniamo una descrizione dettagliata del protocollo sperimentale di imaging ad operare con la matrice sferica optoacustica sonda e vetrina prestazioni a mano in diversi scenari clinici e di imaging animale di piccole dimensioni tipiche.

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Protocollo

La procedura dettagliata per il funzionamento con la sonda optoacustica volumetrico portatile è descritto di seguito. Questa procedura viene eseguita secondo le norme istituzionali approvate in materia di sperimentazione animale e umana.

1. Sistema di Preparazione

  1. Accendere il laser per un periodo di riscaldamento di circa 15 minuti prima operazione per stabilizzare il fascio luminoso in uscita.
  2. Posizionare la parte di acqua che racchiude con la membrana di separazione che è in contatto con la pelle (figura 1).
    NOTA: La distanza tra la membrana isolante (a contatto con la pelle) e la regione di massima sensibilità del trasduttore (centro del tastatore sferico) stabilisce la profondità effettiva di imaging.
  3. Riempire l'intero volume di circa 100 ml tra la membrana isolante e la superficie del trasduttore con acqua deionizzata per mezzo di una pompa.
  4. Assicurarsi che siano perdite di acqua né bolle d'aria sono Present. In alternativa, evitare bolle d'aria, fornendo ricircolo dell'acqua.
  5. Eseguire gli esperimenti a temperatura ambiente e garantire il mezzo di accoppiamento (acqua) viene mantenuta a questa temperatura.

2. Imaging Preparazione

  1. Preparazione imaging umano.
  2. Rimuovere capelli dalla parte essere-ripreso con una lozione depilazione per evitare uno sfondo indesiderato nelle immagini (questa operazione è opzionale).
  3. Applicare gel per ultrasuoni sulla cute intorno alla regione da acquisire per fornire accoppiamento acustico efficiente. Posizionare la sonda optoacustica nella regione di interesse. Verificare che non vi siano bolle d'aria sono presenti nel gel di accoppiamento ultrasuoni.
  4. Preparazione di immagini di animali.
  5. Verificare che le procedure di cura e sperimentali con gli animali sono in accordo con le norme e regolamenti istituzionali e di governo.
  6. Rimuovere il pelo dell'animale nella regione per essere ripreso con una lozione da barba. Proteggere gli occhi dell'animale conUnguento veterinario, che previene la secchezza e danni da esposizione a intense radiazioni laser pulsato.
  7. Anestetizzare l'animale mediante iniezione intraperitoneale (IP) di ketamina / xilazina (100 mg / kg KG ketamina + 5 mg / kg KG Xilazina) prima dell'esperimento o utilizzare isoflurano (2-3% (in volume) con 0,9 l / min flusso di gas) durante l'esperimento. Conferma anestesia controllando il riflesso dell'arto posteriore dell'animale.
  8. Applicare gel per ultrasuoni sulla cute intorno alla regione da acquisire per fornire accoppiamento acustico efficiente e posizionare la sonda optoacustica nella regione di interesse. Verificare che non vi siano bolle d'aria sono presenti nel gel di accoppiamento ultrasuoni.

Modalità operativa 3. Pre-view

  1. Stabilire la lunghezza d'onda di imaging (s) tra 690 nm e 900 nm e la frequenza di ripetizione degli impulsi tra 10 e 50 Hz. Selezionare i parametri per il sistema di acquisizione dati acustici - 1 MWimpedenza di ingresso. Acquisire 2030 campioni per ogni impulso laser ad una frequenza di campionamento di 40 megacampioni al secondo e 12 bit risoluzione verticale. Attivare l'acquisizione con uscita Q-switch del laser.
  2. Assicurarsi che sia l'operatore che il paziente usa occhiali protettivi adatti alla lunghezza d'onda di eccitazione ottica (s). Impostare la potenza del laser in modo che la fluenza luce alla superficie del tessuto viene mantenuta al di sotto di 20 mJ / cm 2 durante l'esperimento per lunghezze d'onda nel vicino infrarosso per soddisfare i limiti di esposizione di sicurezza per esperimenti umani 19 e prevenire sollecitazioni termiche e danni alla pelle negli animali .
  3. Avviare il software pre-vista con una implementazione di algoritmi di elaborazione delle GPU per consentire la visualizzazione di immagini tridimensionali ad un frame rate corrispondente alla frequenza di ripetizione degli impulsi del laser.
  4. Spostare la sonda e / o l'oggetto da esporre al fine di ottimizzare le prestazioni di visualizzazione e localizzare le strutture di interesse.

4. Acquisizione Dati

  1. L'acquisizione dei dati per la modalità di scansione (a mano).
  2. Se necessario, iniettare un agente di contrasto prima dell'acquisizione di arricchire il contrasto nella regione di interesse.
    NOTA: Nei nostri esperimenti non abbiamo eseguito l'imaging umano con mdc. Tuttavia, vari mezzi di contrasto possono essere potenzialmente utilizzati per questo scopo. Indocianina verde (ICG) è un esempio di mezzo di contrasto ottico clinicamente approvato che può essere utilizzato per migliorare il contrasto a somministrazione della dose massima raccomandata di 2 mg / kg di peso corporeo negli adulti.
  3. Avviare l'hardware di acquisizione dati con i parametri descritti in 3.1 mantenendo l'esecuzione del software di anteprima. Spostare delicatamente la sonda intorno alla regione ripreso per monitorare le strutture di interesse.
    NOTA: Quando le immagini a più lunghezze d'onda laser sono acquisiti contemporaneamente, la velocità di movimento della sonda in modalità manuale deve essere diminuito significativamente (preferibilmente inferiore a 2 mm / secper un laser a impulsi frequenza di ripetizione di 50 Hz) per evitare artefatti da movimento legati nelle immagini spettralmente miscelati.
  4. L'acquisizione dei dati per la modalità fermo.
  5. Montare l'oggetto ripreso (ad es., Animali) e la sonda portatile sul supporto e avviare l'acquisizione dei parametri descritti in 3.1 mantenendo l'esecuzione del software pre-view.
  6. Mantenere la sonda optoacustica e la parte di imaging nella stessa posizione durante l'esperimento di visualizzare eventi biologici dinamici della regione di interesse.
  7. Iniettare un agente di contrasto per monitorare la distribuzione dinamica nella regione di interesse.
    NOTA: Nei nostri esperimenti del mouse, verde indocianina (ICG) è stato utilizzato per migliorare il contrasto. Come regola generale, una quantità di 10 nmol o 0,4 mg / kg di ICG deve essere introdotto nella circolazione del mouse per creare contrasto rilevabile con optoacoustics multi-spettrali in vivo.
    NOTA: Il mezzo di contrasto deve essereapprovato per uso umano e / o animale dal rispettivo ente.

5. Finalizzazione l'esperimento

  1. Arrestare il laser.
  2. Rimuovere la sonda optoacustica dalla regione ripreso. Per lo studio degli animali, interrompere l'erogazione dell'anestesia.
  3. Posizionare l'animale sotto un riscaldatore a raggi infrarossi per tenerlo al caldo ed evitare il contatto con altri animali fino a quando non pienamente recuperato dalla anestesia. Non lasciare l'animale incustodito durante il recupero dall'anestesia.

6. Off-line Data Processing

  1. Caricare il file (s) che contiene i segnali optoacustica acquisite nell'applicazione software utilizzati per l'elaborazione dei dati.
  2. Utilizzare un algoritmo di ricostruzione per ottenere una matrice tridimensionale corrispondente ad una immagine volumetrica dell'assorbimento ottico per ogni fotogramma e ogni lunghezza d'onda.
    NOTA: Per la ricostruzione è preferibile usare un algoritmo che rappresentano fattori di distorsione, come hétérogèneimpianti e delle attenuazione nell'oggetto fotografato, effetti di banda finale e la geometria degli elementi di rilevazione e varianti luce fluenza, al fine di ottenere una rappresentazione più quantitativa della distribuzione dell'energia assorbita.
  3. Utilizzare un algoritmo unmixing di ottenere, a ogni frame multi-lunghezza d'onda, una nuova serie di matrici matrice tridimensionale che rappresenta l'assorbimento ottico per ciascuna sostanza assorbente presente nel campione.
  4. Se necessario, trattare ulteriormente gli array a matrice che rappresenta la distribuzione di assorbimento ottico per facilitare la visualizzazione e la lettura dei parametri biologicamente rilevanti.

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Risultati

Rappresentante dei risultati, che dimostrano le capacità del sensore portatile volumetrico descritto optoacustica, sono in mostra in questa sezione. In tutti i casi, la fluenza della luce sulla superficie della pelle è stata mantenuta al di sotto del limite di esposizione di sicurezza del 20 mJ / cm 2 19.

Le prestazioni della sonda in tempo reale inseguimento vascolare periferico umano è presentato nella figura 2. Nel corso di questo esperimento, la sonda è stata ...

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Discussione

I vantaggi unici offerti dalle tecniche di imaging optoacustica in piccola ricerca su animali hanno creato una forte motivazione per tradurre la tecnologia nella pratica clinica, con un numero di diagnostica e applicazioni di monitoraggio di trattamento immaginati ad es., In seno e il cancro della pelle, infiammazioni o malattie vascolare periferico. Tuttavia, al contrario di topi o animali più piccoli, che possono essere circondati da un numero sufficiente di fonti di illuminazione e di elementi di rilevamento...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio Europeo della Ricerca nell'ambito dell'accordo di sovvenzione ERC-2010-StG-260991.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Laser basato su oscillatore parametrico ottico (OPO)Innolas Laser GmbH, Krailling (Germania)su misuraIl laser fornisce impulsi laser con una durata di circa 10 nsec e un'energia fino a 80 mJ.
La lunghezza d'onda è regolabile tra 680-950 nm.
Array sferico di rivelatori piezocompositiImasonic SaS, Voray (Francia)su misuraL'array è costituito da 256 sensori piezoelettrici distribuiti su una superficie sferica.
Ogni elemento ha dimensioni 3 x 3 mm2, una frequenza centrale di 4 MHz e una larghezza di banda del 100%. 
Sistema di acquisizione dati (DAQ)Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (Germania)su misuraIl DAQ acquisisce contemporaneamente 256 segnali a 40 megacampioni al secondo e 2.030 campioni.
L'impedenza di ingresso è di 1 MW.
Fascio di fibreCeramOptec GmbH, Bonn (Germania)su misuraIl fascio è costituito da 480 singole fibre distribuite in modo casuale in ingresso e in uscita.
L'apertura numerica di ogni singola fibra è di 0,22.
Topo nudo atimicoHarlan Laboratories (Paesi Bassi)Nudo atimico - Foxn1nuIl topo aveva 8 settimane (adulto) al momento dell'esperimento.
Il protocollo etico è stato approvato dal governo bavarese (numero 55.2.1.54-2632-102-11)
Bepanthen cremaBayer AG (Germania)Unguento veterinario per proteggere gli occhi durante l'anestesia
Softwaredi elaborazione datiMatlab (Mathworks, Natick, MA, USA)su misuraIl software di elaborazione dati è stato sviluppato presso il nostro istituto.
Consente la ricostruzione ad ogni lunghezza d'onda e l'unmixaggio di più lunghezze d'onda, nonché un'ulteriore elaborazione dei dati.
racchiude l'acquamisuraQuesta parte contiene l'acqua che funge da mezzo di accoppiamento acustico tra la pelle e gli elementi del trasduttore
Verde indocianina (ICG)PULSION Medical Systems SEICG-PULSION (principio attivo: colorante verde indocianina) è un farmaco utilizzato nella diagnostica cardiaca, circolatoria e microcircolatoria, nella diagnostica della funzionalità epatica e nella diagnostica dell'angiografia oftalmica.
Parte che su

Riferimenti

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