Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

Sommario

Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel.

Abstract

Gel PA sono stati a lungo utilizzati come piattaforma per studiare le forze di trazione delle cellule grazie alla facilità di fabbricazione e la possibilità di regolare le loro proprietà elastiche. Quando il substrato viene rivestito con una proteina della matrice extracellulare, le cellule aderiscono al gel e applicare forze, causando il gel di deformarsi. La deformazione dipende dalla trazione cellulare e le proprietà elastiche del gel. Se il campo di deformazione della superficie è noto, la trazione superficiale può essere calcolata utilizzando la teoria dell'elasticità. Gel deformazione viene comunemente misurata inserendo perline marcatori fluorescenti uniformemente nel gel. Le sonde spostano come il gel si deforma. Le sonde vicino alla superficie del gel sono tracciati. Gli spostamenti riportati da queste sonde sono considerati come spostamenti superficiali. Le loro profondità dalla superficie vengono ignorati. Questa ipotesi introduce errore in forza di trazione valutazioni. Per la misura precisa di forze di cellule, è fondamentale per la posizione delle perline per essere conosciuto. Abbiamo sviluppatouna tecnica che utilizza la chimica semplice confinare perline marcatori fluorescenti, 0,1 e 1 micron di diametro, in gel PA, a 1,6 micron della superficie. Abbiamo cappotto un coprioggetto con poli-D-lisina (PDL) e perline fluorescenti. Soluzione di gel PA viene quindi inserita tra il vetrino ed una superficie aderente. Le perline fluorescenti trasferimento alla soluzione di gel durante la polimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, il gel PA contiene microsfere fluorescenti su un aereo vicino alla superficie del gel.

Introduzione

L'interazione meccanica di una cellula vivente con il suo ambiente locale è stato comunemente studiata utilizzando gel PA. Questi substrati basano su un semplice protocollo ben caratterizzato stabilito da Dembo e Wang nel 1997 ^1. Uno dei principali vantaggi di questi substrati è che la loro rigidezza può essere regolato modificando le concentrazioni dei componenti specifici della soluzione di gel. Ciò fornisce una piattaforma auspicabile studiare l'interazione cellule 'con ambienti di diverse rigidità. Quando gel PA vengono rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine, cellule aderiscono ad esse, la forza che genera. Come risultato della....

Protocollo

Realizzazione e funzionalizzazione PA gel di diversa rigidità con microsfere fluorescenti incorporate in prossimità della superficie di coltura cellulare.

1 funzionalizzare i coprioggetto piano in vetro

1. Pulire i vetrini di vetro (# 1.0, diametro 12 mm.) Con acqua e sapone, seguito da etanolo per rimuovere la polvere estranei.
2. Posizionare il coperchio di vetro scivola su una superficie grattugiato (cioè titolare puntale) in modo che non si tocchino per facilitare la facilità di interazione con i coprioggetti.
3. Rivestire l'intera superficie del coperchio scivola con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) per ....

Risultati

L'imaging confocale è stato utilizzato per determinare che le perle erano effettivamente sotto la superficie del gel e di quantificare la loro collocazione precisa all'interno della profondità di gel. Perline fluorescenti di una lunghezza d'onda diversa da quelle all'interno del gel sono stati lasciati depositare sulla superficie, e la distanza tra le nanoparticelle fluorescenti incorporate e quelle sulla superficie è stata calcolata utilizzando un algoritmo di identificazione centroide. La posizione del tallone sulla s.......

Discussione

Quando si utilizza questa tecnica, è essenziale che la soluzione tallone è correttamente diluito e le perline sono scelti in base a diametro desiderato, PA substrato gel rigidità, e la scala di grandezza dei fenomeni che è esplorato nell'esperimento desiderato.

Si deve usare cautela quando si diluisce la soluzione tallone prima di funzionalizzazione migliori scivola copertura in vetro. La spaziatura tra le perle sulla superficie del gel può essere modificata variando il fattore di diluizione.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
Soluzione tampone HEPES 1 M	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrilammide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrilammide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µ m Microsfere fluorescenti (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectina, Umano, 1 mg	BD Biosciences	354008
Persolfato di ammonio	Bio-RAD	161-0700
Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poli-D-lisina	Millipore	A-003-E
cloridrato di 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil]carbodiimmide (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-idrossisulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0,05% Tripsina-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acido acrilico	Sigma-Aldrich	147230
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morfolino)acido etansolfonico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Piatto con fondo in vetro da 14 mm micro-pozzetto #1	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Vetrini di copertura, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	Codice 26023