Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Sommario

La competizione in Streptococcus pneumoniae è mediata da batteriocine, piccoli peptidi antimicrobici con attività inibitoria nei confronti dello pneumococco e di altre specie correlate. Qui descriviamo un saggio di sovrapposizione batterica ottimizzato che consente la caratterizzazione dell'attività della batteriocina e dello spettro inibitorio, l'immunità specifica della batteriocina e il rilevamento di peptidi quorum sensing secreti.

Abstract

Lo Streptococcus pneumoniae colonizza la comunità polimicrobica altamente diversificata del rinofaringe, dove deve competere con gli organismi residenti. Abbiamo dimostrato che i peptidi antimicrobici prodotti battericamente (batteriocine) determinano l'esito di queste interazioni competitive. Tutti i ceppi pneumococcici completamente sequenziati ospitano un locus bacteriocin-l ike peptide (blp). Il locus blp codifica per una gamma di batteriocine diverse e per tutti i componenti altamente conservati necessari per la loro regolazione, elaborazione e secrezione. La diversità delle batteriocine presenti nella regione dell'immunità batteriocina (BIR) del locus è uno dei principali fattori che contribuiscono alla competizione pneumococcica. Insieme alle batteriocine, i geni dell'immunità si trovano nel BIR e sono necessari per proteggere la cellula produttrice dagli effetti della propria batteriocina. Il saggio di sovrapposizione è un metodo rapido per esaminare un gran numero di ceppi alla ricerca di interazioni competitive mediate da batteriocine. Il saggio di sovrapposizione consente anche la caratterizzazione dell'immunità specifica della batteriocina e il rilevamento di peptidi quorum sensing secreti. Il test viene eseguito pre-inoculando una piastra di agar con un ceppo da testare per la produzione di batteriocina, seguito dall'applicazione di un rivestimento di agar morbido contenente un ceppo da testare per la sensibilità alla batteriocina. Una zona di sgombero che circonda la pugnalata indica che il ceppo di copertura è sensibile alle batteriocine prodotte dal ceppo pre-inoculato. Se non si osserva alcuna zona di eliminazione, il ceppo di copertura è immune alla produzione di batteriocine o il ceppo pre-inoculato non produce batteriocine. Per determinare se il locus blp è funzionale in un determinato ceppo, il saggio di sovrapposizione può essere adattato per valutare la secrezione di feromoni peptidici da parte del ceppo pre-inoculato. In questo caso, nell'overlay viene utilizzata una serie di quattro ceppi lacZ-reporter con diversa specificità dei feromoni.

Introduzione

Streptococcus pneumoniae, un colonizzatore comune della comunità polimicrobica del rinofaringe, è in grado di competere con altri pneumococchi e specie strettamente collegate attraverso la produzione di peptidi antimicrobici batteri prodotte (batteriocine). Ogni ceppo pneumococcica completamente sequenziato esaminato fino ad oggi contiene una versione del b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Produzione batteriocina da pneumococco ha dimostrato di essere importante nel risultato sia in vitro che in vivo la concorrenza ^1-4. Dinamiche competitive sono influenza....

Protocollo

1 Preparazione del Produttore Strain

1. Streak un ceppo pneumococcica per essere testato per la produzione batteriocina su un sangue di pecora di soia trittico piastra di agar 5% da -80 ° C scorte congelatore.
   NOTA: L'uso di piastre di sangue per la crescita iniziale del ceppo da testare per l'inibizione aumenta notevolmente la riproducibilità del dosaggio. Inoltre, altri ceppi non-pneumococco che producono batteriocine possono essere utilizzati anche se le condizioni di crescita può avere bisogno di essere modificato per un organismo specifico. Abbiamo usato Streptococcus mitis e Lactococcus lactis nel saggio overlay con succ....

Risultati

Ci sono due possibili risultati nel test di sovrapposizione. Dovrebbe essere possibile vedere la crescita del ceppo accoltellato dopo incubazione durante la notte. Nella Figura 1A, il ceppo sovrapposizione è sensibile alle batteriocine prodotte. Una zona libera può essere visualizzata circonda il ceppo accoltellato. Inoltre, vorticoso del ceppo pugnalato nella miscela sovrapposizione è possibile e può essere visto in Figura 1A. Nella Figura 1B, il ceppo overlay è immune.......

Discussione

Questo saggio overlay è un modo rapido per determinare la gamma di attività per i produttori batteriocina e dimostrare interazioni competitive che possono verificarsi tra i ceppi di pneumococco. Il dosaggio può essere adattato overlay da utilizzare per lo screening più ceppi per la produzione batteriocine una singola piastra. Abbiamo proiettato con successo grandi collezioni di deformazione con questo dosaggio utilizzando un replicatore 48-pin per inoculare le piastre SBA da una metà di una piastra a 96 pozzetti. Dopo i.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Trypticase Agar di soia con il 5% di sangue di pecora Fisher		B21261X	Per la crescita da colture congelate
Catalase	Sigma	C100-500mg	4.741 unità per piatto
Brodo Todd Hewitt + estratto di lievito (THY)	Fisher	DF0492-17-6	30 g di THB, 5 g di estratto di lievito, 1 L di autoclave ddH2O
Trypticase Brodo di Soia + Piastre Agar (TSA)	Fisher	B11768	30 g di TS, 15 g di agar, 1 L ddH2O autoclave
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galattopiranoside (X-gal)	Sigma	B4252-50MG	Sciogliere in
piastre di Petri
	Misura il OD620 delle colture
C bagnomaria
37 gradi Incubatore C con provetta

dimetilformammide Spettrometro Fisher FB0875712 37 ° conica da 15 ml al 5% di CO2