La competizione in Streptococcus pneumoniae è mediata da batteriocine, piccoli peptidi antimicrobici con attività inibitoria nei confronti dello pneumococco e di altre specie correlate. Qui descriviamo un saggio di sovrapposizione batterica ottimizzato che consente la caratterizzazione dell'attività della batteriocina e dello spettro inibitorio, l'immunità specifica della batteriocina e il rilevamento di peptidi quorum sensing secreti.
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Articolo metodologico
Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo Streptococcus pneumoniae colonizza la comunità polimicrobica altamente diversificata del rinofaringe, dove deve competere con gli organismi residenti. Abbiamo dimostrato che i peptidi antimicrobici prodotti battericamente (batteriocine) determinano l'esito di queste interazioni competitive. Tutti i ceppi pneumococcici completamente sequenziati ospitano un locus bacteriocin-l ike peptide (blp). Il locus blp codifica per una gamma di batteriocine diverse e per tutti i componenti altamente conservati necessari per la loro regolazione, elaborazione e secrezione. La diversità delle batteriocine presenti nella regione dell'immunità batteriocina (BIR) del locus è uno dei principali fattori che contribuiscono alla competizione pneumococcica. Insieme alle batteriocine, i geni dell'immunità si trovano nel BIR e sono necessari per proteggere la cellula produttrice dagli effetti della propria batteriocina. Il saggio di sovrapposizione è un metodo rapido per esaminare un gran numero di ceppi alla ricerca di interazioni competitive mediate da batteriocine. Il saggio di sovrapposizione consente anche la caratterizzazione dell'immunità specifica della batteriocina e il rilevamento di peptidi quorum sensing secreti. Il test viene eseguito pre-inoculando una piastra di agar con un ceppo da testare per la produzione di batteriocina, seguito dall'applicazione di un rivestimento di agar morbido contenente un ceppo da testare per la sensibilità alla batteriocina. Una zona di sgombero che circonda la pugnalata indica che il ceppo di copertura è sensibile alle batteriocine prodotte dal ceppo pre-inoculato. Se non si osserva alcuna zona di eliminazione, il ceppo di copertura è immune alla produzione di batteriocine o il ceppo pre-inoculato non produce batteriocine. Per determinare se il locus blp è funzionale in un determinato ceppo, il saggio di sovrapposizione può essere adattato per valutare la secrezione di feromoni peptidici da parte del ceppo pre-inoculato. In questo caso, nell'overlay viene utilizzata una serie di quattro ceppi lacZ-reporter con diversa specificità dei feromoni.
Introduzione
Streptococcus pneumoniae, un colonizzatore comune della comunità polimicrobica del rinofaringe, è in grado di competere con altri pneumococchi e specie strettamente collegate attraverso la produzione di peptidi antimicrobici batteri prodotte (batteriocine). Ogni ceppo pneumococcica completamente sequenziato esaminato fino ad oggi contiene una versione del b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Produzione batteriocina da pneumococco ha dimostrato di essere importante nel risultato sia in vitro che in vivo la concorrenza 1-4. Dinamiche competitive sono influenzati dalla espressione di diverse batteriocine insieme a proteine immunità affini in risposta ad uno specifico peptide feromone. Induzione del locus BLP è controllato da un sistema quorum sensing in cui un peptide feromone, BlpC, si lega alla chinasi sensore, BlpH, e inizia una cascata di segnalazione conseguentetrascrizione del locus 5,6 BLP. Ci sono quattro varianti alleliche di BlpC che ogni legano alla sua BlpH cognate 6. Per la cellula di sopravvivere agli effetti della propria batteriocina, i geni che codificano le proteine immunitarie affini sono trascritti sullo stesso operone come ciascuno dei geni batteriocina. Uccidere verifica se un ceppo concorrente non è in grado di up-regolare il locus BLP in risposta a feromoni esogeno o, se il ceppo manca il gene immunità specifico richiesto per la protezione. Il complesso trasportatore, BlpAB è necessario per la secrezione e la lavorazione del feromone peptidico e peptidi batteriocina 2,4. Recentemente, è stato dimostrato che una percentuale significativa di ceppi di pneumococco sono "imbroglioni", nel senso che hanno una mutazione nel gene conservato blpA che li rende incapaci di secernere feromoni e batteriocine 1,2. Questi ceppi sono in grado di rispondere alle BlpC esogeno 2 secreta da nitritoceppi noiosi consentono la produzione di proteine di immunità.
Anche se, preparazioni crude di batteriocine da surnatanti possono essere preparati da ceppi produttori utilizzando metodi biochimici passi per raggiungere la purezza, questo approccio non è utile per lo screening di grandi collezioni di isolati e se il livello di espressione batteriocina è bassa in colture in brodo cresciuta 2,7- 9. Il saggio di sovrapposizione viene usato come un modo rapido per studiare le dinamiche competitive tra i ceppi che possono esistere in vitro. Per fare ciò, un ceppo pneumococco è pre-inoculato su una piastra di agar e ha permesso di crescere fino a raggiungere concentrazioni batteriche locali sufficienti per l'induzione del locus BLP. Un secondo ceppo viene quindi inoculato in una soluzione soft agar fuso che viene poi applicato sopra il ceppo pre-inoculato per verificare la sensibilità. Per valutare l'attività del locus BLP (indipendente da attività inibitoria), i ceppi possono essere sovrapposti con una serie di three precedentemente descritti ceppi giornalista BlpC. Questi ceppi sono stati costruiti per contenere uno dei tre diversi alleli blpH che rispondono ai tre feromoni più comuni BlpC secreti dal pneumococchi. I ceppi giornalista hanno un gene lacZ integrato che è sotto il controllo di un promotore dipendente BlpH e portare una delezione nel gene blpC che impedisce auto-stimolazione 10,11.
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Protocollo
1 Preparazione del Produttore Strain
- Streak un ceppo pneumococcica per essere testato per la produzione batteriocina su un sangue di pecora di soia trittico piastra di agar 5% da -80 ° C scorte congelatore.
NOTA: L'uso di piastre di sangue per la crescita iniziale del ceppo da testare per l'inibizione aumenta notevolmente la riproducibilità del dosaggio. Inoltre, altri ceppi non-pneumococco che producono batteriocine possono essere utilizzati anche se le condizioni di crescita può avere bisogno di essere modificato per un organismo specifico. Abbiamo usato Streptococcus mitis e Lactococcus lactis nel saggio overlay con successo. - Incubare la piastra overnight (O / N) a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Dopo l'incubazione del ceppo produttore, preparare il piatto trittico di agar soia (TSA) pipettando 3.000 a 4.000 unità di catalasi su piastre contenenti 25 ml di TSA e diffondere la soluzione catalasi utilizzando microsfere di vetro sterili. Lasciate asciugare la piastra per circa 10 minuti sottouna cappa di sicurezza biologica.
- Raccogliere una quantità visibile di batteri su una punta della pipetta. Pugnalare la punta della pipetta nella piastra TSA secca.
NOTA: Più di un ceppo produttore può essere accoltellato in un unico piatto TSA. È importante distanziare i colpi in modo che aloni risultanti non si sovrappongano.- Se possibile, includere noto batteriocine produttore come controllo positivo e il ceppo da utilizzare nella sovrapposizione come controllo negativo.
NOTA: I controlli positivi e negativi sono stati precedentemente pubblicati e sono disponibili su richiesta 10.
- Se possibile, includere noto batteriocine produttore come controllo positivo e il ceppo da utilizzare nella sovrapposizione come controllo negativo.
- Incubare la piastra TSA contenente più pugnalate a 37 ° C con il 5% di CO 2 per 6 ore.
2. Fare scorte glicerolo del ceppo Overlay
- Preparare le scorte glicerolo (colture cresciute a fase mid-esponenziale e poi conservati a -80 ° C previa aggiunta di glicerolo) prima del giorno del test di sovrapposizione. Inoculare 5-10 colonie di str pneumococcoain per essere testato per la sensibilità o la secrezione di feromoni in Todd-Hewitt media con estratto di 0,5% di lievito (THY).
NOTA: Costruzione di giornalisti inducibili BlpC è stato precedentemente descritto e 2 ceppi sono disponibili su richiesta. - Incubare 5-10 colonie in tubi di vetro con 5 ml di THY con coperchi ben chiusi in un bagno d'acqua a 37 ° senza agitare.
- Incubare colture a 37 ° C fino a raggiungere un diametro esterno 620 di 0,3 a 0,5.
NOTA: Questo richiederà circa 4-5 ore a seconda del ceppo utilizzato.- Capovolgere delicatamente la provetta un paio di volte prima di misurare il diametro esterno.
- Se l'esperimento non può essere effettuata il giorno stesso o il ceppo sarà utilizzato più volte in futuro, fare scorte di glicerolo e di riprendere l'esperimento in una data successiva. Per gli stock di glicerolo, aggiungere glicerolo alle culture ad una concentrazione finale del 20%. Culture aliquote in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. NOTA: I campioni possono essere ssbranati da mesi a -80 ° C. Se non fare scorte di glicerolo, utilizzare direttamente i campioni per l'analisi di sovrapposizione.
3. Overlay saggio
- Poco prima di sovrapporre l'applicazione, miscelare i componenti di sovrapposizione. In un tubo da 15 ml, aggiungere 5 ml di THY, 3000-4000 U di catalasi, e 200 ml di brodo di coltura ceppo di sovrapposizione che è stato sia cresciuto quel giorno o uno stock di glicerolo della cultura che è stato scongelato a temperatura ambiente. Se si utilizza il ceppo giornalista, aggiungere 50 ml di X-gal (40 mg / ml) alla miscela di sovrapposizione. Utilizzare un tubo conico per piastra.
- Equilibrare miscela sovrapposizione a temperatura ambiente prima aggiunta di liquido TSA.
- Rimuovere la piastra TSA con ceppo accoltellato da incubatrice. Sciogliere solido TSA in forno a microonde e mantenerlo a 55 ° C bagnomaria fino al momento dell'uso. Aggiungere 3 ml di liquido TSA con il 1,5% agar raffreddata a 55 ° C per sovrapporre miscela.
- Preparare immediatamente la miscela di sovrapposizione prima pipettaggio, il composto inizierà a solidificarsi moltorapidamente. NOTA: Se la sovrapposizione inizia a solidificarsi prima di placcatura, i risultati saranno interpretabile.
- Mescolare il composto overlay pipettando su e giù parecchie volte con una pipetta 5 ml facendo attenzione a non introdurre bolle nella miscela. Lentamente pipettare miscela overlay direttamente alla piastra TSA accoltellato. Conservare la piastra sul banco per qualche minuto per consentire l'agar per indurire.
- Non ruotare la piastra per distribuire la miscela overlay, questo tirerà crescita della cultura accoltellato nella sovrapposizione.
- Posizionare con cura piastra TSA con sovrapposizione in 37 ° C incubatore contenente il 5% di CO 2 O / N (circa 16-18 ore).
- Osservare le piastre dopo la crescita durante la notte. Le piastre devono apparire opaca dalla crescita del ceppo sovrapposizione, tranne nelle zone in cui si è verificato l'inibizione o feromone segnalazione. Questi appariranno come zone sia chiaro o blu attorno al ceppo accoltellato, rispettivamente.
NOTA: Anche se measurements del diametro di compensazione blu o possono essere determinati per la valutazione quantitativa, differenze di diametro possono anche variare a seconda della quantità di batteri che è stato accoltellato nella piastra. Il saggio overlay è un test qualitativo, ogni valutazione quantitativa devono essere interpretati con cautela. Qualsiasi compensazione visibile rispetto al controllo negativo è considerata attività.
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Risultati
Ci sono due possibili risultati nel test di sovrapposizione. Dovrebbe essere possibile vedere la crescita del ceppo accoltellato dopo incubazione durante la notte. Nella Figura 1A, il ceppo sovrapposizione è sensibile alle batteriocine prodotte. Una zona libera può essere visualizzata circonda il ceppo accoltellato. Inoltre, vorticoso del ceppo pugnalato nella miscela sovrapposizione è possibile e può essere visto in Figura 1A. Nella Figura 1B, il ceppo overlay è immune...
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Discussione
Questo saggio overlay è un modo rapido per determinare la gamma di attività per i produttori batteriocina e dimostrare interazioni competitive che possono verificarsi tra i ceppi di pneumococco. Il dosaggio può essere adattato overlay da utilizzare per lo screening più ceppi per la produzione batteriocine una singola piastra. Abbiamo proiettato con successo grandi collezioni di deformazione con questo dosaggio utilizzando un replicatore 48-pin per inoculare le piastre SBA da una metà di una piastra a 96 pozzetti. Dopo i...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Elizabeth E. Kennedy Research Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trypticase Agar di soia con il 5% di sangue di pecora Fisher | B21261X | Per la crescita da colture congelate | |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4.741 unità per piatto |
| Brodo Todd Hewitt + estratto di lievito (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g di THB, 5 g di estratto di lievito, 1 L di autoclave ddH2O |
| Trypticase Brodo di Soia + Piastre Agar (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g di TS, 15 g di agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galattopiranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Sciogliere in |
| piastre di Petri | |||
| Misura il OD620 delle colture | |||
| C bagnomaria | |||
| 37 gradi Incubatore C con provetta | |||
Riferimenti
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
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- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
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Ristampe e permessi
